基于細(xì)菌/真菌相互作用的紅樹林內(nèi)生真菌活性菌株篩選*

張柳紅，李嫣然，李云龍，寧嘉盈，周耀航，熊智瑤，李佳欣，王玉如，黃志堅(jiān)，劉嵐

(中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

基于細(xì)菌/真菌相互作用的紅樹林內(nèi)生真菌活性菌株篩選*

張柳紅，李嫣然，李云龍，寧嘉盈，周耀航，熊智瑤，李佳欣，王玉如，黃志堅(jiān)，劉嵐

(中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

為篩選出具有抑菌活性且次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的紅樹林內(nèi)生真菌，以水產(chǎn)養(yǎng)殖中分離得到的2株病原細(xì)菌(VibrioparahaemolyticusB1和AcinetobacterjohnsoniiB2)對(duì)2014年從珠海淇澳-擔(dān)桿島省級(jí)自然保護(hù)區(qū)采集得到的616株紅樹林內(nèi)生真菌進(jìn)行代謝產(chǎn)物抗菌活性和豐富度篩選。利用共培養(yǎng)技術(shù)，尋找在共培養(yǎng)后菌落形態(tài)特征出現(xiàn)明顯變化或形成抑菌圈的內(nèi)生真菌。通過對(duì)純培養(yǎng)和共培養(yǎng)真菌的粗提物進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)和HPLC指紋圖譜分析，篩選出在共培養(yǎng)條件下可誘導(dǎo)產(chǎn)生新代謝產(chǎn)物且抑菌效果顯著提高的菌株，為發(fā)現(xiàn)抗菌化合物提供新來源。

紅樹林內(nèi)生真菌；抑菌活性；HPLC指紋圖譜；次級(jí)代謝產(chǎn)物

紅樹林是生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶海岸和河口潮間帶的木本植物群落，是四大海洋高生產(chǎn)力生態(tài)系統(tǒng)之一，也是陸地到海洋過渡型生態(tài)系統(tǒng)。由于邊緣效應(yīng)，紅樹林生態(tài)環(huán)境具有強(qiáng)還原性、強(qiáng)酸性、高含鹽量和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1]，為一大群適應(yīng)了高鹽度和定期潮汐沖刷等生存環(huán)境的微生物提供了必要的棲息之地，紅樹林內(nèi)生真菌就是紅樹林微生物資源中的主要類群。紅樹林豐富的微生物環(huán)境，使微生物間存在激烈的生存競(jìng)爭(zhēng)，促使微生物產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為尋找新抗菌活性物質(zhì)提供了源泉[2]。本課題組已從紅樹林內(nèi)生真菌分離得到許多結(jié)構(gòu)新穎或活性良好的次級(jí)代謝產(chǎn)物[3-4]。在過去的紅樹林內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中，大部分是采用純培養(yǎng)的方式大規(guī)模發(fā)酵真菌，進(jìn)而分離其次級(jí)代謝產(chǎn)物，但在純培養(yǎng)條件下，有些真菌的基因處于沉默的狀態(tài)，產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的途徑不表達(dá)或者表達(dá)被抑制[5]，這就減少了發(fā)現(xiàn)活性天然產(chǎn)物的機(jī)會(huì)。共培養(yǎng)基于微生物間的相互作用，可激活沉默的生源合成基因簇[6]，是產(chǎn)生新活性代謝產(chǎn)物的重要途徑[7-9]。

耐藥細(xì)菌性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常見而且危害最大的一類疾病，由于抗生素的過量使用，使水產(chǎn)病原菌的種類和數(shù)量顯著增加，養(yǎng)殖生物耐藥病原菌病害的發(fā)生也越來越頻繁，微生物病害防治的難度越來越大[10]。近年來全國(guó)范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖毀滅性病害的頻繁發(fā)生表明，當(dāng)病害發(fā)生時(shí)，施虐的病原微生物很可能已具有了抗藥性[11]，抗生素藥物療法已不再有效。為尋求新型抗生素，需要探索新的抗菌機(jī)制或?qū)ふ倚碌目咕钚晕镔|(zhì)。本研究旨在通過真菌與水產(chǎn)致病菌共培養(yǎng)，抑菌活性檢測(cè)和HPLC指紋圖譜分析等手段，篩選出在與水產(chǎn)致病菌共培養(yǎng)時(shí)能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的活性物質(zhì)且抑菌效果較純培養(yǎng)時(shí)顯著提高的紅樹林內(nèi)生真菌，作為進(jìn)一步次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的目標(biāo)菌株，尋找真菌由于與水產(chǎn)致病菌的生存競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生針對(duì)水產(chǎn)致病菌作用的特殊代謝產(chǎn)物，為發(fā)現(xiàn)新型抗菌活性物質(zhì)打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；YXQ-LS-100SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；RE-2010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Multiskan?GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)；Waters高校液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)。

試劑：甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；DMSO(CP，廣州化學(xué)試劑廠)；實(shí)驗(yàn)所用水均為蒸餾水；PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯浸出粉300 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂15 g/L，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；LB肉湯培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L、酵母膏粉 5 g/L、氯化鈉10 g/L、pH為6.9～7.1，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用真菌為本課題組2014 年分離自中國(guó)珠海淇澳紅樹林保護(hù)區(qū)的紅樹植物，種屬未鑒定。實(shí)驗(yàn)用的2株病原細(xì)菌為2014年分離自廣東冠利海洋生物有限責(zé)任公司茂名試驗(yàn)站養(yǎng)殖海水，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為VibrioparahaemolyticusB1(以下簡(jiǎn)稱：B1)和AcinetobacterjohnsoniiB2(以下簡(jiǎn)稱：B2)，GenBank 登錄號(hào)分別為KY077678和KY077679。所有菌種均保存在廣州中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院海洋生物天然產(chǎn)物研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化 細(xì)菌活化：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，按為1∶10比例將細(xì)菌原液接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，并于37 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)(150 r/min)18～24 h。

真菌活化：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用接種針或接種環(huán)從凍存管中挑取真菌菌絲，按照三點(diǎn)轉(zhuǎn)接法接種于PDA平板培養(yǎng)基中，并于28 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，拍照記錄菌株的生長(zhǎng)形態(tài)。

1.3.2 真菌和細(xì)菌純培養(yǎng)、共培養(yǎng) 真菌純培養(yǎng)：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用接種針挑取活化后的真菌菌落外緣菌絲于PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，觀察并拍照記錄菌落形態(tài)。

細(xì)菌純培養(yǎng)：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用移液槍取100 μL活化后的細(xì)菌液于PDA平板培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻，37 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，觀察并拍照記錄菌落形態(tài)。

真菌/細(xì)菌共培養(yǎng)：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用移液器取100 μL活化后的細(xì)菌液于PDA平板培養(yǎng)基，并用涂布棒均勻涂布到平板的各個(gè)角落，然后用接種針挑取活化后的真菌菌落外緣菌絲按照三點(diǎn)轉(zhuǎn)接法接種于上述涂布有細(xì)菌液的PDA平板中，28 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，觀察并拍照記錄純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的真菌菌落形態(tài)有無改變，有無抑菌圈或色素產(chǎn)生，尋找相互作用強(qiáng)烈，形態(tài)變化明顯的菌株。

1.3.3 次級(jí)代謝產(chǎn)物提取 對(duì)篩選出的菌株，其純培養(yǎng)和共培養(yǎng)完成后，將整個(gè)含菌培養(yǎng)基放入茶袋中，用甲醇/乙酸乙酯/二氯甲烷(體積比為3∶2∶1)浸泡2～3 d(浸泡沒過茶袋)，超聲萃取菌株的代謝產(chǎn)物并收集浸泡液，將浸泡液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干后，用乙酸乙酯萃取2～3次。取上層乙酸乙酯有機(jī)相，并用旋蒸儀濃縮蒸干，甲醇復(fù)溶后轉(zhuǎn)移至青霉素瓶中，放置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮干得到粗提物，待HPLC指紋圖譜分析及抗菌活性檢測(cè)。

1.3.4 HPLC指紋圖譜分析 將粗提物用甲醇溶解并用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，配制成3 mg/mL的樣品，利用Waters 1525-2998 HPLC進(jìn)行指紋圖譜分析。流動(dòng)相采用乙腈/水體系(A：15%乙腈+85%水；B：15%水+85%乙腈)；梯度洗脫(0～22 min，100%A-100%B；22～27 min，100%B；27～35 min，100%B-100%A)；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量30 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為190～700 nm；色譜柱規(guī)格為Zorbax SB-C18 (9.4 mm×250 mm, 5 μm)。

1.3.5 抗菌活性檢測(cè) 采用96孔板法[12]檢測(cè)純培養(yǎng)和共培養(yǎng)粗提物分別對(duì)B1和B2的抑菌活性。活化B1和B2后，按1∶10比例接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)(150 r/min)12 h，再將菌種懸浮液以1∶100比例接種至LB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)(150 r/min)3 h，在600 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值A(chǔ)，調(diào)整A值至0.5，再用新鮮LB肉湯培養(yǎng)基以1∶100比例稀釋，此時(shí)菌液濃度約為5×105CFU/mL，適用于藥敏實(shí)驗(yàn)。將粗提物樣品用體積比為1∶4的DMSO水溶液配制成1 mg/mL的母液，分別取50 μL母液轉(zhuǎn)移至96孔板中，再加入150 μL上述細(xì)菌懸浮液，37 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)(150 r/min)18 h后在600 nm波長(zhǎng)下讀取A值。50 μL體積比為1∶4的DMSO水溶液加上150 μL細(xì)菌懸浮液的體系作為陰性對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)平行，A值取平均值。根據(jù)公式計(jì)算抑菌率：

抑菌率

2 結(jié)果分析與討論

2.1 共培養(yǎng)對(duì)真菌菌落形態(tài)的影響

為了尋找對(duì)水產(chǎn)病原菌有強(qiáng)烈作用的菌株，本研究選取616株紅樹林內(nèi)生真菌分別進(jìn)行純培養(yǎng)及與水產(chǎn)病原菌B1和B2共培養(yǎng)，根據(jù)純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的菌落形態(tài)變化和抑菌圈有無及大小等的觀察結(jié)果，篩選出162株(占總體菌株數(shù)量的26.3%)共培養(yǎng)時(shí)有顯著相互作用的內(nèi)生真菌作為后續(xù)研究的候選菌株。以QA-740為例觀察真菌共培養(yǎng)前后的菌落形態(tài)差異，從圖1可知，QA-740在純培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)青綠色孢子，孢子分布較均勻，菌落顏色呈咖啡色；在與B1共培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)較緩慢，菌落直徑較小，產(chǎn)淡黃色孢子，菌落顏色呈磚紅色；在與B2共培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)暗綠色和白色孢子，且菌落邊緣被白色孢子包圍，菌落顏色呈磚紅色，說明真菌/細(xì)菌共培養(yǎng)會(huì)影響QA-740的生長(zhǎng)狀態(tài)，使其產(chǎn)生不同顏色的孢子，導(dǎo)致菌落顏色和形態(tài)發(fā)生變化。以QA-741為例觀察真菌共培養(yǎng)前后抑菌圈的有無及大小，圖2顯示，QA-741純培養(yǎng)時(shí)菌落內(nèi)部凸起，產(chǎn)暗綠色和白色孢子，菌落邊緣規(guī)則且被白色孢子包圍；在與B1共培養(yǎng)時(shí)菌落內(nèi)部凸起且產(chǎn)白色孢子，而菌落邊緣產(chǎn)磚紅色孢子，無白色孢子包圍；在與B2共培養(yǎng)時(shí)菌落內(nèi)部凸起且產(chǎn)白色孢子，菌落邊緣產(chǎn)磚紅色孢子且被白色孢子包圍，并形成直徑為17～24mm的抑菌圈，說明QA-741對(duì)B2具有抑制作用。

圖1 QA-740純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的菌落變化圖Fig.1 Colony change maps of QA-740 after pure culture and co-culturea/d：QA-740純培養(yǎng)正/背面觀；b/e：QA-740與B1共培養(yǎng)正/背面觀；c/f：QA-740與B2共培養(yǎng)正/背面觀

圖2 QA-741純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的菌落抑菌圈變化圖Fig.2 Changes of bacterial inhibition zone of QA-741 after pure culture and co-culturea/d：QA-741純培養(yǎng)正/背面觀；b/e：QA-741與B1共培養(yǎng)正/背面觀；c/f：QA-741與B2共培養(yǎng)正/背面觀

2.2 抑菌活性篩選結(jié)果與分析

對(duì)162株內(nèi)生真菌的純培養(yǎng)和共培養(yǎng)進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取，共獲得486份粗提物(每株真菌3份粗提物，即純培養(yǎng)，與B1共培養(yǎng)，與B2共培養(yǎng)各一份)。對(duì)上述粗提物樣品進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，以抑菌率≥70%為有抑菌活性，結(jié)果見表1。由表1可知，對(duì)B1有抑制作用的粗提物樣品有75份，對(duì)B2有抑菌活性的粗提物樣品有130份，其中，有54份粗提物樣品同時(shí)對(duì)B1和B2有抑制活性，因此，共有151份粗提物樣品有抑菌活性。此外，根據(jù)表1，在對(duì)B1有抑制作用的75份粗提物樣品中，純培養(yǎng)樣品有40份(占53.3%)，與B1共培養(yǎng)的樣品有14份(占18.7%)，與B2共培養(yǎng)的樣品有21份(占28.0%)；在對(duì)B2有抑制作用的130份粗提物樣品中，純培養(yǎng)樣品有67份(占51.5%)，與B1共培養(yǎng)的樣品有27份(占20.8%)，與B2共培養(yǎng)的樣品有36份(占27.7%)。因此，從樣品所占比例上看，純培養(yǎng)樣品所占比例較大，且共培養(yǎng)的粗提物樣品對(duì)B1和B2的抑制作用具有隨機(jī)性，不存在特異性。

通過對(duì)B1有抑菌活性的粗提物樣品的分析，共篩選出19株候選菌株，這些真菌為純培養(yǎng)、與B1共培養(yǎng)和與B2共培養(yǎng)3份粗提物樣品同時(shí)有抑菌作用，或者純培養(yǎng)樣品無抑菌活性但共培養(yǎng)樣品顯示出抑菌活性。候選真菌的編號(hào)和對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)條件見表2。同樣地，對(duì)B2有抑制作用的粗提物樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，挑選出27株候選內(nèi)生真菌，其編號(hào)及培養(yǎng)條件見表2。在上述對(duì)B2有抑制作用的27株候選內(nèi)生真菌中，有8株在對(duì)B1有抑制作用的19株候選菌株中，因此共篩選出38株候選菌株。由表2可知，在這38株候選菌株中，有23株內(nèi)生真菌在純培養(yǎng)時(shí)無抑菌活性，共培養(yǎng)后顯示出對(duì)B1或B2的抑菌活性，表明抑菌活性物質(zhì)為在共培養(yǎng)條件下脅迫產(chǎn)生的，是本研究的重點(diǎn)研究對(duì)象，將結(jié)合HPLC指紋圖譜分析結(jié)果進(jìn)一步篩選。

2.3HPLC指紋圖譜篩選結(jié)果與分析

根據(jù)抑菌活性檢測(cè)結(jié)果，篩選出純培養(yǎng)粗提物無抑菌效果但共培養(yǎng)粗提物表現(xiàn)出抑菌活性的內(nèi)生真菌共23株，編號(hào)分別為：QA-49、QA-108、QA-115、QA-123、QA-137、QA-153、QA-591、QA-592、QA-597、QA-598、QA-616、QA-623、QA-653、QA-654、QA-696、QA-768、QA-2006、QA-2575、QA-2579、QA-2583、QA-2608、QA-2614和QA-2655。上述內(nèi)生真菌的粗提物經(jīng)HPLC分析，得到其指紋圖譜，觀察比較上述樣品在檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm時(shí)的HPLC色譜圖，發(fā)現(xiàn)有4株內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物較為豐富(圖3)，這些菌株的編號(hào)分別為QA-124、QA-598、QA-623和QA-712。

其中，QA-124(圖3a)純培養(yǎng)和共培養(yǎng)樣品對(duì)B1和B2均有抑制作用，其色譜峰出峰位置基本相同，但共培養(yǎng)樣品在11.5min的色譜峰強(qiáng)度比純培養(yǎng)樣品的高。同樣地，QA-712(圖3b)純培養(yǎng)和共培養(yǎng)樣品對(duì)B2均有抑制活性，其色譜峰出峰位置也基本相同，但共培養(yǎng)樣品在9, 11, 21和26min的色譜峰強(qiáng)度均明顯高于純培養(yǎng)樣品，說明真菌/細(xì)菌共培養(yǎng)會(huì)改變一些真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。QA-598(圖3c)與B1共培養(yǎng)的樣品對(duì)B1有抑制活性，其純培養(yǎng)和與B2共培養(yǎng)的樣品均無抑制作用，而從這些樣品的HPLC指紋圖譜中可看出，598-1的色譜峰數(shù)目明顯大于純培養(yǎng)和598-2的樣品，說明598-1的化合物豐富度較高，其粗提物樣品檢測(cè)到的抗菌活性可能來源于QA-598與B1共培養(yǎng)后刺激產(chǎn)生的化合物，表明真菌/細(xì)菌共培養(yǎng)可激活某些沉默基因，進(jìn)而促進(jìn)真菌產(chǎn)生類型多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物。QA-623(圖3d)純培養(yǎng)和共培養(yǎng)樣品的色譜峰均很豐富，且出峰位置基本一致，但623-2在15.8min的峰強(qiáng)度明顯高于純培養(yǎng)和623-1樣品，結(jié)合活性檢測(cè)結(jié)果中只有623-2樣品對(duì)B1有抑制作用，說明次級(jí)代謝產(chǎn)物的濃度會(huì)影響抑菌活性的結(jié)果，具體情況有待進(jìn)一步的考究和驗(yàn)證。

圖3 粗提物樣品(3 mg/mL)在檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm時(shí)的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprint chromatograms of the crude extracts(3 mg/mL)under the wavelength of 254 nm

續(xù)表1 %

續(xù)表1 %

續(xù)表1 %

1)“-” 表示抑菌率<70%

表2 候選菌株的編號(hào)及培養(yǎng)條件1)Table 2 Numbers and culture conditions of the candidate fungi

1)pure:內(nèi)生真菌純培養(yǎng)樣品；co-1：內(nèi)生真菌與B1共培養(yǎng)樣品；co-2：內(nèi)生真菌與B2共培養(yǎng)樣品；pure&co-1：內(nèi)生真菌純培養(yǎng)和與B1共培養(yǎng)樣品；pure&co-2：內(nèi)生真菌純培養(yǎng)和與B2共培養(yǎng)樣品；co-1&co-2：內(nèi)生真菌與B1或B2共培養(yǎng)樣品；pure&co-1&co-2：內(nèi)生真菌純培養(yǎng)和與B1或B2共培養(yǎng)樣品

3 結(jié) 論

目前真菌代謝產(chǎn)物的研究通常采用純培養(yǎng)的模式，而自然界的真菌和細(xì)菌是共同存在的，為爭(zhēng)奪生存空間，互相之間通過化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行斗爭(zhēng)，相互間的作用有可能誘導(dǎo)各類活性化合物的產(chǎn)生。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，真菌/細(xì)菌共培養(yǎng)可以改變真菌的菌落形態(tài)、顏色等特征，可以促進(jìn)或者抑制真菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高或者降低真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，也可以提高或者降低真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，進(jìn)而影響其抑菌活性。此外，從比例上看，真菌/細(xì)菌共培養(yǎng)前后樣品對(duì)細(xì)菌B1和B2的抑制作用不具有特異性，即有些與B1共培養(yǎng)的粗提物樣品對(duì)B2有抑制活性，而與B2共培養(yǎng)的粗提物樣品可能對(duì)B1有抑制作用。因此，真菌/細(xì)菌共培養(yǎng)技術(shù)在真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景，在后續(xù)工作中有待深入研究。

根據(jù)共培養(yǎng)前后真菌菌落形態(tài)變化的觀察結(jié)果，從616株紅樹林內(nèi)生真菌中篩選出162株內(nèi)生菌株，再根據(jù)抑菌活性檢測(cè)結(jié)果從中篩選出38株候選菌株，并通過對(duì)目標(biāo)菌株的HPLC指紋圖譜的分析篩選出4株次級(jí)代謝產(chǎn)物較豐富的目標(biāo)真菌，編號(hào)分別為：QA-124、QA-598、QA-623和QA-712，其中QA-623的HPLC色譜圖出峰數(shù)目較多，說明其次級(jí)代謝產(chǎn)物較為豐富，擬對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)并進(jìn)一步分離其次級(jí)代謝產(chǎn)物，從中尋找針對(duì)水產(chǎn)病原菌的新型抑菌活性化合物。

[1] 高劍，李赤，王燕，等. 紅樹林內(nèi)生真菌多樣性及其應(yīng)用潛能 [J]. 菌物研究, 2013, 11(3): 212-216.GAOJ,LIC,WANGY,etal.Diversityandapplicationpotentialofendophyticfungiassociatedwithmangroves[J].JournalofFungalResearch, 2013, 11(3): 212-216.

[2]ONNM,LIMP,AAZANIM,etal.Initialscreeningofmangroveendophyticfungiforantimicrobialcompoundsandheavymetalbiosorptionpotential[J].SainsMalaysiana, 2016, 45(7): 1063-1071.

[3] 宋雙, 薛艷鈺, 陸勇軍, 等. 南海紅樹林內(nèi)生真菌Fusariumsolani387# 次級(jí)代謝產(chǎn)物研究 [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 54(5): 67-71. SONG S, XUE Y Y, LU Y J, et al. The secondary metabolites of the mangrove endophytic fungusFusariumsolani387# [J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2015, 54(5)：67-71.

[4] MA Y H, LI J, HUANG M X, et al. Six new polyketide decalin compounds from mangrove endophytic fungusPenicilliumaurantiogriseum328# [J]. Marine Drugs, 2015, 13(10): 6306-6318.

[5] PETTIT R K. Mixed fermentation for natural product drug discovery [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 83: 19-25.

[6] RUTLEDGE P J, CHALIS G L. Discovery of microbial natural products by activation of silent biosynthetic gene clusters [J]. Nature Reviews Microbiology, 2015, 13(8): 509-523.

[7] PATHAK R, KUMAR R， GAUTAM H K. Cross-species induction and enhancement of antimicrobial properties in response to gamma irradiation inExiguobacteriumsp. HKG 126 [J]. Indian Journal of Microbiology, 2013, 53 (2): 130-136.

[8] ADNANI N, VAZQUEZ-RIVERA E, ADIBHATLA S N, et al. Investigation of interspecies interactions within marine micromonosporaceae using an improved co-culture approach [J]. Marine Drugs, 2015, 13: 6082-6098.

[9] DUSANE D H, MATKAR P, VENUGOPALAN V P, et al. Cross-species induction of antimicrobial compounds, biosurfactants and quorum-sensing inhibitors in tropical marine epibiotic bacteria by pathogens and biofouling microorganisms [J]. Current Microbiology, 2011, 62 (3): 974-980.

[10] 黃志堅(jiān)，陳勇貴，翁少萍，等. 多種細(xì)菌與凡納濱對(duì)蝦肝胰腺壞死癥(HPNS)爆發(fā)有關(guān) [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 55(1): 1-11. HUANG Z J, CHEN Y G, WENG S P, et al. Multiple bacteria species were involved in hepatopancreas necrosis syndrome ( HPNS) ofLitopenaeusvannamei[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2016, 55(1): 1-11.

[11] FLEGEL T W. Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 110(2): 166-173.

[12] SELIN C, STIETZ M S, BLANCHARD J E, et al. A pipeline for screening small molecules with growth inhibitory activity againstBurkholderiacenocepacia[J]. PLoS One, 2015, 10(6): e0128587.

Screening of antibacterial strains from mangrove endophytic fungi based on bacterial/fungal interactions

ZHANGLiuhong,LIYanran,LIYunlong,NINGJiaying,ZHOUYaohang,XIONGZhiyao,LIJiaxin,WANGYuru,HUANGZhijian,LIULan

(School of Marine Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China)

In order to screen out mangrove endophytic fungal strains with antibacterial activity and abundant secondary metabolites, two strains of aquatic pathogenic bacteria named asVibrioparahaemolyticusB1 andAcinetobacterjohnsoniiB2 were co-cultured with 616 strains of mangrove endophytic fungi, which were collected from Guangdong Zhuahai Qiao-Dangan island nature reserve in 2014, respectively. And then some of the endophytic fungi with obvious changes in the morphology of the colonies or produce inhibition zones after co-culture were investigated. The crude extracts of pure cultures and co-cultures were analyzed by HPLC fingerprints to find out some fungal strains that could induce new secondary metabolites and increase antibacterial effect in co-culture conditions. In addition, their antibacterial activity againstV.parahaemolyticusB1 andA.johnsoniiB2 were evaluated. It is a new strategy for these strains to produce novel antibacterial compounds.

mangrove endophytic fungi; antibacterial activity; HPLC fingerprint; secondary metabolites

2016-11-18 基金項(xiàng)目： 國(guó)家自然科學(xué)基金(21272286)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201305017)；海洋生物天然產(chǎn)物化合物庫基金(GD2012-D02-001)；中山大學(xué)2015年大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練和創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(教務(wù)[2015]105號(hào))

張柳紅(1991年生)，女；研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)；E-mail：zhanglhn@mail2.sysu.edu.cn

黃志堅(jiān)(1970年生)，男；研究方向：海洋微生物；E-mail：lsshzhj@mail.sysu.edu.cn； 劉嵐(1971年生)，女；研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)；E-mail：cesllan@mail.sysu.edu.cn

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.02.016

Q93-3

A

0529-6579(2017)02-0093-09