MicroRNA通用探針?lè)ǖ慕⒓安剪斒暇』颊哐獫{microRNA-146a的檢測(cè)

程慧敏，魏青青，張 歡，劉金玲，韓小虎，王大力，王興龍

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MicroRNA通用探針?lè)ǖ慕⒓安剪斒暇』颊哐獫{microRNA-146a的檢測(cè)

程慧敏1，2，魏青青2，張 歡2，劉金玲2，韓小虎2，王大力3，王興龍1

目的 建立一種通用、敏感、特異的microRNA檢測(cè)方法，用于檢測(cè)布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a的表達(dá)，探討其作為診斷標(biāo)識(shí)的可能性。方法 以microRNA-146a模擬物為待檢物，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)退火溫度、探針濃度、試劑盒選擇進(jìn)行優(yōu)化，建立特異敏感的通用檢測(cè)方法；從布病患者和正常健康人血漿樣本提取RNA，應(yīng)用通用探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)，比較布病患者血漿microRNA-146a的表達(dá)變化。結(jié)果 建立了優(yōu)化的通用探針?lè)?，與染料法相比特異性更強(qiáng)、擴(kuò)增范圍更大，具有通用檢測(cè)能力。應(yīng)用通用探針?lè)z測(cè)布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a，發(fā)現(xiàn)布病患者血漿中microRNA-146a的表達(dá)被抑制(P<0.01)，表明其可能作為布病診斷的分子標(biāo)識(shí)。結(jié)論 經(jīng)優(yōu)化的通用探針?lè)ㄊ且环N通用、敏感、特異的檢測(cè)方法，可用于microRNA的檢測(cè)，microRNA-146a可能作為布病診斷的標(biāo)識(shí)分子。

通用探針?lè)?；正交設(shè)計(jì)；microRNA-146a；布魯氏菌病

microRNA (miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為19-22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,可以作為疾病特征性標(biāo)識(shí)[1]。但因其片段較短，易降解且表達(dá)量不高，多采用熒光定量法進(jìn)行檢測(cè)。不同microRNA同源性較高[2]，探針?lè)ǖ奶禺愋赃h(yuǎn)高于染料法，但是熒光定量探針?lè)ㄔ跈z測(cè)目的基因時(shí),需要針對(duì)每個(gè)microRNA設(shè)計(jì)探針進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)成本高，操作要求高[3]，在臨床檢測(cè)中受到一定限制。本研究在TaqMan熒光定量PCR的基礎(chǔ)上建立一種通用探針?lè)?，通過(guò)設(shè)計(jì)新的通用探針和引物，使用正交設(shè)計(jì)法對(duì)多因素進(jìn)行優(yōu)化，不僅能擴(kuò)大檢測(cè)范圍和靈敏性，也為熒光定量法microRNA檢測(cè)條件的優(yōu)化提供參考[4-6]。最后應(yīng)用通用探針?lè)▽?duì)布病患者血漿中的microRNA-146a進(jìn)行檢測(cè)，探討其作為診斷標(biāo)識(shí)的可能性。

1 材料與方法

1.1 模擬物合成與樣本準(zhǔn)備 模擬物由上海吉瑪公司合成，序列為Has-microRNA-146a-5p(5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′),12 000 r/min離心5 min，將模擬物稀釋至0.2 μmol/L。布魯氏菌病患者血漿樣本來(lái)源于黑龍江農(nóng)墾總局總醫(yī)院，試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，抗體滴度在1∶50以上視為陽(yáng)性，健康志愿者血漿樣本來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心鼠疫布病防治基地。收集清晨空腹全血樣本2 mL，采用枸櫞酸鈉抗凝管，4 ℃靜置4 h后4 000 g/min離心5 min，小心分離上層血漿后保存于-80 ℃。

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 RNA提取采用傳統(tǒng)trizol法(Invitrogen，TRIzol○R Reagent)，取200 μL血漿，加入相應(yīng)體積trizol后，震蕩混勻，靜置5 min。加入40 μL氯仿，震蕩，靜置5 min后4 ℃ 12 000 g 25 min。吸去上層至新管，加200 μL異丙醇-20 ℃過(guò)夜,4 ℃ 12 000g離心 25 min棄上清。用200 μL 75%酒精洗滌RNA沉淀一次，使RNA重懸,4 ℃ 12 000 g離心15 min。棄上清，倒置控干酒精，加15 μL DEPC水溶解，-80 ℃保存。超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000)測(cè)定RNA濃度均>100 ng/μL,OD268/OD280=1.8-2.0。

將20份健康志愿者血漿樣本RNA各取2 μL制成混合RNA樣本。將混合RNA樣本、布魯氏菌病患者血漿RNA樣本和健康志愿者血漿RNA樣本各20份分別加Poly(A)尾，布魯氏菌病患者和健康志愿者加尾產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照天根生化科技(北京)有限公司miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT CAG AGC CAC CTG GGC AAT TTT TTT TTT TVN-3′，由Takara公司合成。反應(yīng)在金屬浴(卡尤迪H2O3-100C)中進(jìn)行，完成后cDNA保存于-20 ℃。

1.3 通用探針?lè)ń⑴c條件的優(yōu)化 建立通用探針?lè)?，microRNA-146a上游引物序列：5′-TGA GAA CTG AAT TCC ATG GGT T-3′，通用下游引物序列：5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′，通用探針：5′-FAM-CAG AGC CAC CTG GGC AAT TT-BHQ1-3′[7]，序列均由Takara公司合成。

采用正交設(shè)計(jì)，對(duì)通用探針?lè)ǖ姆磻?yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，主要包括試劑盒、退火溫度和探針濃度。與普通PCR不同，多數(shù)熒光定量PCR試劑盒多將Taq酶,buffer,dNTPs,MgCl2等制成混合溶液，因?yàn)榛旌先芤号浔炔煌?，Taq酶不同等，故擴(kuò)增效率也不同。本實(shí)驗(yàn)將不同試劑盒混合溶液作為一個(gè)可變因素[8]，結(jié)合溫度、探針濃度共3因素，選定4個(gè)水平。以microRNA-146a為例，對(duì)濃度為0.2×10-2μmol/L模擬物microRNA-146a進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物長(zhǎng)66 bp。設(shè)計(jì)因素及其水平,見(jiàn)表1。[L16(4)3]正交設(shè)計(jì)表，見(jiàn)表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液購(gòu)于康維世紀(jì)的GoldStar TaqMan Mixture (Low ROX)，Takara公司的Premix Ex Taq(Probe qPCR)試劑盒，TRANSGEN biotech公司的2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒，天根生化科技公司的SuperReal PreMix(Probe)。將反應(yīng)體系縮小至10 μL，反正程序按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)在美國(guó)Bio-Rad公司的IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，每次試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 正交設(shè)計(jì)因素及其水平
Tab.1 Influential factors and counts of orthogonal design

水平Counts因素Factors試劑盒MasterMix退火溫度(℃)AnnealingTemperature探針濃度(μmol/L)Probeconcentration1GoldStarTaqManMixture620.22PremixExTaq60.70.43EasyTaqPCRSuperMix58.40.64SuperRealPreMix550.8

表2 [L16(4)3]正交設(shè)計(jì)表
Tab.2 [L16(4)3]Orthogonal design table

因素Factors試驗(yàn)編號(hào)Experimentsnumber試劑盒MasterMix退火溫度(℃)AnnealingTemperature探針濃度(μmol/L)Probeconcentrration11112122313341445212622372348241931310324113311234213414144211543216443

1.4 通用探針?lè)ㄔu(píng)價(jià) 將通用探針?lè)ㄅcSYBR GreenI染料法進(jìn)行對(duì)比，在臨床樣本中對(duì)通用探針檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)包括性能和通用性兩方面。性能的評(píng)價(jià)是將混合的RNA樣本加Poly(A)尾，分別取4、2、0.4 μL加尾產(chǎn)物用于逆轉(zhuǎn)錄，使用通用探針?lè)ê蚐YBR Green I染料法擴(kuò)增血漿樣本中的microRNA-146a、microRNA-122和microRNA-155，比較通用探針?lè)ê蚐YBR GreenI染料法的性能方面的差別。通用性評(píng)價(jià)是將混合的RNA樣本加poly(A)尾，取4 μL加尾產(chǎn)物用于逆轉(zhuǎn)錄，使用通用探針?lè)ê蚐YBR Green I染料法擴(kuò)增血漿樣本中的microRNA-155、microRNA-146b、microRNA-223、microRNA-181c、microRNA-27a、microRNA-29a、microRNA-29b-1、microRNA-146a共8條microRNA，探索通用探針?lè)▽?duì)不同microRNA擴(kuò)增的通用性。實(shí)驗(yàn)均以RNase free H2O作為陰性對(duì)照。

1.5 通用探針?lè)ǖ膽?yīng)用 將模擬物進(jìn)行10倍梯度稀釋，共5個(gè)濃度梯度(0.2-0.2×10-4μmol/L)，應(yīng)用最佳反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR，繪制microRNA-146a標(biāo)準(zhǔn)曲線。將20例布魯氏菌病患者和20例健康志愿者分為患病組和健康組，統(tǒng)計(jì)樣本信息。應(yīng)用通用探針?lè)?，根?jù)microRNA-146a標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算臨床樣本microRNA-146a濃度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件和Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 通用探針?lè)ǖ慕⒑蜅l件的優(yōu)化 通用探針?lè)ǖ脑硎窃诩覲oly(A)尾之后，用與含有通用探針互補(bǔ)序列的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用通用引物、通用探針和microRNA特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)一次逆轉(zhuǎn)錄可檢測(cè)多個(gè)不同的microRNA分子，而優(yōu)化的擴(kuò)增體系是確保擴(kuò)增效率的關(guān)鍵。以microRNA-146a為例，設(shè)計(jì)通用引物和探針，并對(duì)通用探針?lè)ǖ捏w系進(jìn)行摸索和優(yōu)化。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試劑盒種類、退火溫度以及探針濃度三因素相互獨(dú)立，P>0.05。分析3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差， σ<0.5。熒光定量擴(kuò)增Ct值見(jiàn)表3，對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析[9]。第1、4、9、11、14次試驗(yàn)，擴(kuò)增效果極差，循環(huán)數(shù)大于40。第7和12次實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)差σ>0.5，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，結(jié)果不可靠。在其余9次實(shí)驗(yàn)中，第3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)增曲線完整平滑,見(jiàn)圖1。3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)σ=0.14，Ct=31.28，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)Ct值提高了,檢測(cè)濃度下限提高10倍，見(jiàn)圖1和圖2。在第3次實(shí)驗(yàn)中，使用2×GoldStar TaqMan Mixture，探針濃度為0.6 μmol/L，退火溫度為58.4 ℃。比較多次實(shí)驗(yàn)可以得出最佳反應(yīng)程序：第一階段95 ℃預(yù)變性10 min；第二階段95 ℃變性15 s，58.4 ℃退火和延伸40 s，收集熒光信號(hào)，進(jìn)行40次循環(huán)。最佳反應(yīng)體系見(jiàn)表4。通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化通用探針?lè)ǚ磻?yīng)條件，提高了檢測(cè)的靈敏性，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍。

表3 [L16(4)3]正交設(shè)計(jì)結(jié)果
Tab.3 [L16(4)3] Orthogonal design result

試驗(yàn)編號(hào)Experimentnumber重復(fù)1Repeat1重復(fù)2Repeat2重復(fù)3Repeat3標(biāo)準(zhǔn)差σStandarddeviationCt平均值CtMeanvalue135.79N/A6.19——232.132.5231.580.47088632.06667331.3431.1231.390.14364331.283334N/AN/AN/A——534.0834.0534.080.01732134.07632.9233.0832.990.08020832.99667733.04N/A31.431.13844232.235832.7232.6632.620.05033232.666679N/AN/AN/A——1035.4834.9736.660.86685335.7033311N/A37.57N/A——1236.6134.1233.231.7519834.653331334.0534.0934.190.07211134.1114N/AN/AN/A——1535.0434.1734.530.4371534.581634.2333.9734.790.41904734.33

圖1 優(yōu)化前試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of non-optimizational real-time PCR reaction

圖2 正交設(shè)計(jì)第3次試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curve of optimizational real-time PCR reaction

表4 優(yōu)化的血漿microRNA-146a熒光定量PCR體系
Tab.4 Optimizational real-time PCR reaction of plasma microRNA-146a

反應(yīng)成分Reactioncomponents反應(yīng)體系/μLReactionsystem終濃度Finalconcentration2×GoldStarTaqManMixture51×10×buffer11×Primer(F)0.20.2μmol/LPrimer(P)0.20.2μmol/LProbe0.60.6μmol/LRNAfreeH2O3—Total10—

2.2 通用探針?lè)ǖ拿舾行院吞禺愋?在臨床樣本檢測(cè)中，通用探針?lè)ǖ男阅苊黠@優(yōu)于SYBR Green I染料法，見(jiàn)表5。將兩種檢測(cè)方法進(jìn)行縱向?qū)Ρ龋?dāng)加尾產(chǎn)物量不同時(shí)，通用探針?lè)ㄖ屑游伯a(chǎn)物量越高，循環(huán)數(shù)越小，即通用探針?lè)梢詼?zhǔn)確的區(qū)分出血漿樣本中目標(biāo)microRNA的含量，含量越高，越容易檢測(cè)。但是SYBR Green I染料法檢測(cè)microRNA-122時(shí)，加尾產(chǎn)物量越高反而循環(huán)數(shù)越小，對(duì)于血漿樣本中的目標(biāo)microRNA濃度的檢測(cè)并不準(zhǔn)確，在檢測(cè)microRNA-155時(shí)，陰性對(duì)照也產(chǎn)生了熒光信號(hào)，表明SYBR Green I染料法只有在microRNA濃度較高時(shí)才能檢測(cè)到，靈敏性差。將兩種檢測(cè)方法進(jìn)行橫向?qū)Ρ?，在檢測(cè)同一條microRNA的相同加尾產(chǎn)物量時(shí)，通用探針?lè)ǖ撵`敏性均高于染料法，且陰性對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)，不存在干擾，在進(jìn)行大量樣本篩查時(shí)具有較大優(yōu)勢(shì)。

表5 SYBR Green I染料法和通用探針?lè)ㄐ阅鼙容^結(jié)果
Tab.5 Efficiency comparison results of SYBR Green I assay and universal probe assay

加尾產(chǎn)物量(μL)Poly(A)prudct(μL)染料法SYBRGreenIassay探針?lè)║niversalprobeassaymiR-146amiR-155miR-122miR-146amiR-155miR-122434.7234.8797535.5408233.6879729.6488133.22255235.8436.4399237.3085734.3976230.4812733.670340.436.1636.1163236.6971238.19017—36.19771陰性對(duì)照—36.60477————

2.3 通用探針?lè)ㄍㄓ眯?在臨床樣本檢測(cè)中，使用通用探針?lè)ê蚐YBR GreenI染料法對(duì)隨機(jī)挑選的8條microRNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表6。通用探針?lè)蓪?duì)8條microRNA進(jìn)行檢測(cè)，除microRNA-146a,其余血漿樣本中microRNA循環(huán)數(shù)均在35個(gè)循環(huán)及以下，陰性對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增。雖然通用探針?lè)ㄔ跀U(kuò)增microRNA時(shí)循環(huán)數(shù)較大，但是SYBR Green I染料法陰性對(duì)照均產(chǎn)生了熒光信號(hào)，對(duì)目標(biāo)microRNA存在干擾，如microRNA-223和microRNA-155，血漿樣本和陰性對(duì)照循環(huán)數(shù)接近，結(jié)果難以判斷。綜上，說(shuō)明通用探針?lè)ň哂辛己玫奶禺愋院屯ㄓ眯浴?/p>

表6 SYBR Green I染料法和通用探針?lè)ㄍㄓ眯员容^結(jié)果
Tab.6 Universal comparison results of SYBR Green I assay and universal probe assay

Ct值CtvaluemiR-146amiR-146bmiR-223miR-155miR-29amiR-181cmiR-27amiR-29b-1染料法SYBRGreenIassay樣本Sample33.9029.8832.9433.5831.8735.3932.3734.64陰性Control37.2533.3233.5234.0735.4337.5939.6736.73探針?lè)║niversalprobeassay樣本Sample37.6931.1432.6432.0934.6735.6935.6035.73陰性Control————————

2.4 通用探針?lè)z測(cè)布魯氏菌病患者血漿microRNA-146a 將模擬物microRNA-146a進(jìn)行10倍梯度稀釋，應(yīng)用通用探針?lè)?，得到microRNA-146 a擴(kuò)增曲線，對(duì)數(shù)圖見(jiàn)圖3。根據(jù)microRNA-146a擴(kuò)增曲線繪制microRNA-146a標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4。該標(biāo)準(zhǔn)曲線包括5個(gè)數(shù)量級(jí)，下限可至20 pmol/L。R2=0.9816,K=-3.112,E=1.09，表明具有良好的線性關(guān)系，各稀釋度間相關(guān)性好、誤差小。成功建立microRNA-146a標(biāo)準(zhǔn)曲線，可進(jìn)一步對(duì)每一例血漿樣本中的microRNA-146a進(jìn)行絕對(duì)定量分析。

將通用探針?lè)☉?yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)，比較布魯氏菌病患者和健康志愿者血漿樣本中的microRNA-146a表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)樣本基本信息，患病組年齡在4到71歲之間，20人中女性有7人，健康組年齡在16到83歲之間，20人中女性有9人，患病組和健康組年齡和性別差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.1)?；疾〗M者抗體滴度均大于50 IM/mL,健康組試管凝集試驗(yàn)呈陰性。根據(jù)microRNA-146a標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用絕對(duì)定量分析方法[10]計(jì)算樣本中microRNA-146a的濃度?；疾〗M血漿microRNA-146a濃度從14.74 nmol/L到8 447.26 nmol/L(95%CI：23.45-1 799.86)，健康組microRNA-146a濃度從97.99 nmol/L-140 192.41 nmol/L(95%CI：17 013.24-48 218.79)?；疾〗M和健康組樣本基本信息及數(shù)據(jù)結(jié)果，見(jiàn)表7。

圖4 模擬物microRNA-146a標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of microRNA-146a mimics

表7 樣本信息及數(shù)據(jù)結(jié)果
Tab.7 Information and result of plasma sample

特征信息Characteristics患病組(n=20)Brucellosis健康組(n=20)HealthyvolunteerP樣本信息Sampleinformation平均年齡Meanage46.0547.85>0.1年齡95%CIAge95%CI37.48-54.6239.62-56.08性別(女,%)Sex(Female,%)35%45%>0.1抗體滴度范圍(IΜ/mL)SATtiter(IM/mL)50-800——數(shù)據(jù)結(jié)果Resultofanalysis濃度平均值(nmol/L)MeanConcentration911.6632616.02<0.01標(biāo)準(zhǔn)差σStd.Deviation1897.8233338.24抽樣標(biāo)準(zhǔn)誤差Std.ErrorofMean424.37 7454.66濃度95%CIConcentration95%CI23.45-1799.8617013.24-48218.79濃度最大值(nmol/L)Upperconcentration(nmol/L)8447.26140192.41濃度最小值(nmol/L)Lowerconcentration(nmol/L)14.7497.99

比較患病組和健康組血漿microRNA-146a表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Levene檢驗(yàn)方差不齊,P<0.05，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P<0.01，患病組和健康組血漿microRNA-146a表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；疾〗M和健康組血漿microRNA-146a表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，患病組血漿microRNA-146a表達(dá)水平低于健康組，繪制柱狀散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖5。

圖5 患病組與健康組血漿microRNA-146a表達(dá)差異Fig.5 Expression of plasma microRNA-146a in patients group and control group

3 討 論

MicroRNA作為一類基因表達(dá)調(diào)控分子，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著非常重要的作用[11]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可作為疾病的診斷標(biāo)志物用于疾病診斷[12-13]，因此，有關(guān)microRNA的檢測(cè)方法的文章呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。目前的檢測(cè)方法主要有兩大類，一是基于染料法的通用檢測(cè)方法，一次加尾逆轉(zhuǎn)錄后可以檢測(cè)很多個(gè)靶標(biāo)分子[14-15]，另一個(gè)是基于特定microRNA序列的探針?lè)?，一次只能檢測(cè)一個(gè)靶標(biāo)分子[16-17]。從原理上看，前者通用性好，但特異性不足，后者特異性較好，但通用性不足，成本高，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜。而通用探針?lè)▌t是結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)，一步逆轉(zhuǎn)錄后可以用探針實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)分子的檢測(cè)。

本研究中，我們對(duì)通用探針?lè)ㄟM(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，設(shè)計(jì)了新的通用探針，對(duì)影響探針?lè)ǖ囊蛩夭捎谜辉O(shè)計(jì)的方法進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，從而建立了敏感特異的檢測(cè)方法。從優(yōu)化過(guò)程的數(shù)據(jù)看，引物探針濃度、退火溫度和所用檢測(cè)試劑均會(huì)影響檢測(cè)效率。采用正交設(shè)計(jì)方法比單個(gè)因素逐步優(yōu)化的優(yōu)勢(shì)在于，能夠?qū)ふ业蕉鄠€(gè)因素相互作用及同步優(yōu)化的作用[18]。所以，盡管設(shè)計(jì)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)數(shù)大，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化能夠獲得最優(yōu)的反應(yīng)條件，這也為其它檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化提供借鑒。同時(shí)對(duì)通用探針?lè)ǖ男阅芎屯ㄓ眯赃M(jìn)行了討論，發(fā)現(xiàn)該方法與常用的SYBR GreenI染料法相比具有良好的性能和通用性，在檢測(cè)臨床樣本時(shí)，對(duì)于靶標(biāo)microRNA反應(yīng)靈敏高效，可同時(shí)可對(duì)多條microRNA進(jìn)行檢測(cè)，且特異性好、沒(méi)有干擾。

布魯氏菌病是一種慢性感染性疾病，布魯氏菌感染宿主后會(huì)抑制宿主免疫，使細(xì)菌能夠在宿主內(nèi)生存繁殖[19]。因此，感染布魯氏菌的患者會(huì)表現(xiàn)一定的免疫抑制，而這種免疫狀態(tài)的改變可能作為診斷的標(biāo)記。MicroRNA-146a是一類與免疫調(diào)控相關(guān)的microRNA分子，已經(jīng)證實(shí)其參與了很多免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[20-21]。本研究中，我們比較分析了布病患者血漿中microRNA-146a的表達(dá)，并與健康人進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染布魯氏菌的患者血漿中microRNA-146a的表達(dá)水平被顯著抑制，這提示microRNA分子可能作為一個(gè)布病診斷的分子標(biāo)記。但是，由于本研究中只比較分析了數(shù)量較少的樣本，這種規(guī)律還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。另一方面，microRNA-146a作為一種調(diào)控分子，會(huì)因各種因素的影響發(fā)生變化，所以這種變化不是布魯氏菌感染所特異的，因此，在作為診斷標(biāo)識(shí)的過(guò)程中，還需考慮其它因素。

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Development of a universal probe based microRNA assay and detection of plasma microRNA-146a of human brucellosis

CHENG Hui-min1，2,WEI Qing-qing2,ZHANG Huan2,LIU Jin-ling2,HAN Xiao-hu2, WANG Da-li3,WANG Xing-long1

(1.InstituteofMilitaryVeterinary,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun130122,China; 2.ShenyangAgricultureUniversity,Shenyang110866,China; 3.PestisandBrucellosisTherapeuticBase,ChineseCentersforDiseaseControlandPrevention,Baicheng137000,China)

We developed a universal probe based microRNA detection assay and applied it to detect microRNA-146a in human brucellosis,testing the possibility of using it as diagnosis signature. By using orthogonal design,the annealing temperature,probe concentration and commercial kits were optimized and the assay was developed. Total RNAs were isolated from plasma of human brucellosis and healthy control,and microRNA-146a was detected and compared. Results reveal that the optimized universal probe assay was established,which was more specific than the SYBR GreenI assay,and had a wider range of amplification. Compared with healthy control,the application of universal probe assay for the detection of serum microRNA-146a in patients with brucellosis was significantly inhibited (P<0.01). Implying the potential of microRNA-146a as biomarker in diagnosis of brucellosis.It is suggested that universal probe based assay is a universal,specific and sensitive method for microRNA detection. MicroRNA-146a represents a potential biomarker for human brucellosis diagnosis.

universal probe assay; orthogonal design; microRNA-146a; human brucellosis

Wang Xing-long,Email: wangxl-2006@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.011

王興龍,Email:wangxl-2006@163.com

1.軍事獸醫(yī)研究所,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，長(zhǎng)春 130122； 2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),沈陽(yáng) 110866； 3.中國(guó)疾病預(yù)防控中心鼠疫布病防治基地,白城 137000

R378.5

A

1002-2694(2017)05-0441-08

2016-07-21 編輯：王曉歡