四對結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)基因功能的初步研究

劉靜儀，賈俊楠，李衛(wèi)民，張俊杰，高基民

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四對結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)基因功能的初步研究

劉靜儀1，賈俊楠2，李衛(wèi)民2，張俊杰3，高基民1

目的 探討結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)中的4對基因的功能，為研究結(jié)核分枝桿菌的傳播機制提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。方法 選取結(jié)核分枝桿菌TA系統(tǒng)VapBC家族中4對基因，包括VapC4個毒素基因(Rv1720c、Rv2103c、Rv2494和Rv3408)和VapB4個抗毒素基因(Rv1721c、Rv2104c、Rv2493、Rv3407)，在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中分別構(gòu)建嚴謹型阿拉伯糖誘導(dǎo)質(zhì)粒體系及乙酰胺誘導(dǎo)穿梭質(zhì)粒體系觀察VapC對細菌生長的抑制作用，及其對應(yīng)的VapB解除抑制作用。結(jié)果 在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌的實驗結(jié)果一致，Rv2103c具有一定抑制作用和 Rv2104c具有消除抑制作用，其余3對毒素-抗毒素基因未見到明顯的對細菌生長的抑制和消除抑制的作用。結(jié)論 成功構(gòu)建了VapBC家族在大腸桿菌及恥垢分枝桿菌中的表達體系，并發(fā)現(xiàn)了一對TA系統(tǒng)基因?qū)毦L的抑制和消除抑制的作用。

結(jié)核分枝桿菌；毒素-抗毒素系統(tǒng)；VapBC家族

結(jié)核病(tuberculosis，TB)，主要由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起。據(jù)WHO報道，2015年全球約140萬人死于結(jié)核病，新發(fā)病例約1 040萬。由此可見，結(jié)核病仍是威脅人類健康的重大傳染性疾病。另一方面，隨著結(jié)核病與HIV等免疫缺陷性疾病的并發(fā)、耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant TB,MDR-TB)及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively-resistant TB,XDR-TB)的不斷增加，對于結(jié)核病的診斷及治療都陷入了瓶頸。結(jié)合多學(xué)科開展新方向研究勢在必行。

全基因組測序技術(shù)迅猛發(fā)展，已經(jīng)形成了一個巨大的數(shù)據(jù)庫。充分利用該數(shù)據(jù)庫資源，篩選出有意義的功能基因，從而更有針對性地進行生物學(xué)驗證，以加快對生命過程的理解速度，已經(jīng)成為目前研究的熱點。毒素-抗毒素系統(tǒng)(toxin-antitoxin system，TAs)最早發(fā)現(xiàn)于某些低拷貝質(zhì)粒，通過分裂后致死效應(yīng)(the postsegregation killing effect)保證其在細菌中的穩(wěn)定遺傳[1]。其主要組成包括一個穩(wěn)定的毒素蛋白(toxin)和一個不穩(wěn)定的抗毒素蛋白(antitoxin)，抗毒素蛋白通過與毒素蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，抑制其活性。隨著深入研究，有證據(jù)顯示TAs 在應(yīng)激狀態(tài)下并非完全的介導(dǎo)細菌程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)殺滅細菌，而更傾向于抑制細菌生長[2-3]。在饑餓、低氧等應(yīng)激條件下，結(jié)核分枝桿菌可自發(fā)的進入生長停滯，臨床表現(xiàn)為較長時間的潛伏期，并且現(xiàn)有抗結(jié)核藥物不能快速有效的消滅休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌。當機體免疫力下降(如營養(yǎng)不良、HIV感染等)，休眠結(jié)核分枝桿菌可以重新增殖，產(chǎn)生新的傳播。因此以結(jié)核分枝桿菌的TAs為出發(fā)點，研究結(jié)核病的休眠機制對探討某些廣泛流行譜系或菌株為何具有高致病性與強傳播力非常重要。

結(jié)核分枝桿菌中確認或疑似TAs共計79個，涵蓋多個家族，包括VapBC(50)、MazEF(10)、YefM/YoeB(1)、RelBE(2)、HigBA(2)、ParDE(2)等[4]。TypeⅡTAs作為結(jié)核分枝桿菌TAs中最大的家族[5-6]，包括VapBC、MazEF、HigBA、RelBE、ParDE等。國內(nèi)外文獻對MazEF、RelBE的報道較多，但對VapBC的系統(tǒng)研究較少。隨著全基因組序列分析在結(jié)核分枝桿菌研究中的廣泛推廣，通過生物信息學(xué)分析得到36對可能有功能的TAs基因[7]，并有一部分基因的功能在大腸桿菌或結(jié)核分枝桿菌中得到了驗證，其中VapBC家族的部分毒素基因僅在大腸桿菌中具有抑菌功能，另有一部分在恥垢分枝桿菌中驗證為抑菌性[8]。但是聯(lián)合生物信息學(xué)方法篩選可能與譜系傳播能力有關(guān)的TAs，并在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中構(gòu)建誘導(dǎo)表達體系驗證的工作報道較少。

Supply[9]采用全基因組序列分析在全球范圍流行的北京譜系M.TB，結(jié)果提示VapC47(Rv3408)、VapC37(Rv2103)具有強烈分化；同時，根據(jù)前期工作基礎(chǔ)，使用生物信息學(xué)研究方法，即proven評分及蛋白空間預(yù)測[10]，篩選出一個可能與北京譜系傳播相關(guān)的toxin基因——Rv2494。因此我們嘗試在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中同時構(gòu)建誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，以初步鑒定所選取的四個基因是否具有毒素功能。并進一步建立有效的蛋白表達體系。以期為篩選更多譜系相關(guān)TAS建立生物信息學(xué)與分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基 大腸桿菌E.coliDH5ɑ、BL21(DE3)、BL(DE3)plysS和BW25113感受態(tài)細胞分別接種于LB和M9培養(yǎng)基。恥垢分枝桿菌MC2155接種于7H9液體培養(yǎng)基(涂布于7H10固體培養(yǎng)基)；大腸桿菌中選用質(zhì)粒pBAD33、pET 21cc、pET28a，恥垢分枝桿菌中選用質(zhì)粒pACE、pMV261(均由北京師范大學(xué)張俊杰教授課題組惠贈)；培養(yǎng)基的抗生素工作濃度分別為，在大腸桿菌中，氨芐青霉素100 u/mL，氯霉素100 u/mL，卡那霉素50 u/mL，潮霉素150 u/mL；恥垢分枝桿菌中，卡那霉素25 u/mL，潮霉素50 u/mL。

1.1.2 主要試劑和儀器HindⅢ、XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ、ClaⅠ、EcoRⅠ、BglⅡ等限制性內(nèi)切酶及T4連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及包涵體純化試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司。電穿孔儀選用Bio-rad Gene Pulser Xcell。

1.2 方法

1.2.1 VapC與VapB同源蛋白毒性與抗毒性的鑒定

1.2.1.1 大腸桿菌 將4個毒素基因(VapC12、VapC37、VapC38、VapC47)分別克隆入pBAD 33載體[11]，轉(zhuǎn)化入E.coliBW25113，將測序鑒定為陽性克隆的pBAD33-VapC工程菌，均勻涂布于含有或不含有0.2%阿拉伯糖溶液的M9固體培養(yǎng)基(氯霉素100 u/mL)，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察菌體生長情況；將4個毒素-抗毒素共表達基因(VapBC12、VapBC37、VapBC38、VapBC47)分別克隆入pET21cc載體，轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE)，將測序鑒定為陽性克隆的pET21cc-VapBC工程菌，均勻涂布于含有或不含有終濃度為1mM IPTG的LB固體培養(yǎng)基(氨芐青霉素100 u/mL)，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察菌體生長情況。

1.2.1.2 恥垢分枝桿菌 將4個毒素基因(VapC12、VapC37、VapC38、VapC47)分別克隆入pACE穿梭載體[12]，電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌感受態(tài)(電轉(zhuǎn)條件為2 500 V，25 μF，1 000 Ω，2mm)[13]，將測序鑒定為陽性克隆的pACE-VapC工程菌，均勻涂布于含有或不含有0.1%乙酰胺溶液的7H10固體培養(yǎng)基(潮霉素50 u/mL)，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌體生長情況；隨后，構(gòu)建帶有4個抗毒素基因(VapB12、VapB37、VapB38、VapB47)的pMV261-VapB穿梭質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)入由上述同源pACE-VapC工程菌制備而成的感受態(tài)細胞中，最后將同時帶有pACE-VapC與pMV261-VapB的工程菌均勻涂布于含有或不含0.1%乙酰胺的7H10固體培養(yǎng)基(潮霉素50 u/mL、卡那霉素25 u/mL雙抗)，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌體生長情況。

1.2.2 Rv2103c的蛋白表達與純化

1.2.2.1 pET28a-Rv2103c重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將Rv2103c毒素基因克隆入原核表達質(zhì)粒pET-28a，轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE)plysS感受態(tài)細胞，經(jīng)T7通用引物測序鑒定為陽性克隆的工程菌重命名為pET28a-Rv2103c。

1.2.2.2 Rv2103c的蛋白表達 將構(gòu)建成功的pET28a-Rv2103c工程菌以1∶100的比例接種于1 000 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50 u/mL)，37 ℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD=0.4-0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的ITPG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8 h，4 ℃ 5 000 r/min離心收菌。

1.2.2.3 Rv2103c的蛋白純化 將菌體沉淀超聲破菌后離心收集沉淀，利用康為世紀his標簽包涵體蛋白純化試劑盒洗脫雜蛋白，回收目的蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以M.TB標準菌株H37Rv基因組DNA為模板，擴增帶有不同酶切位點的VapC、VapB基因目的片段，將擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(見圖1)；挑取轉(zhuǎn)化成功的單菌落擴大培養(yǎng)，以上游與下游引物做菌落PCR鑒定，有目的條帶的樣品送予北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序鑒定(見圖2)。

M:100 bp Plus DNA Ladder; 1: Rv1720c (390 bp); 2: Rv2103c (435 bp); 3: Rv2494 (426 bp); 4: Rv3408 (411 bp).圖1 toxin基因PCR擴增的目的基因片段Fig.1 PCR amplification of the target toxin gene

圖2 pET21cc-VapBC12重組質(zhì)粒測序結(jié)果(Clone Mgr Suite 7)Fig.2 Sequencing result of recombinant plasmid pET21cc-VapBC2(Clone Mgr Suite 7)

2.2 毒素蛋白對大腸桿菌生長的抑制作用 將4個毒素基因分別克隆入pBAD33質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBW25113，分別在含有和不含有0.2%阿拉伯糖誘導(dǎo)劑的M9固體培養(yǎng)基上均勻涂布，37 ℃培養(yǎng)過夜?？梢妏BAD 33-Rv2103c在含有0.2%阿拉伯糖的M9固體培養(yǎng)基上完全抑制菌落生長。在不含有0.2%阿拉伯糖的M9固體培養(yǎng)基上能夠正常生長，且未見與pBAD 33對照組菌落存在差異。同時，其抗毒素基因Rv2104c對此種抑菌作用有解除作用(見圖3)。

左1，左2：涂布順序；右1：VapC毒素基因的誘導(dǎo)驗證；右2：VapBC毒素-抗毒素基因的誘導(dǎo)驗證Left is the diagrammatic presentation,right is the identification of VapC and VapBC,respectively.圖3 大腸桿菌中VapC與VapB同源蛋白的毒素與抗毒素功能的鑒定Fig.3 Identification of the functions of toxin VapC and homologous antitoxin VapB in E. coli

左1，左2：涂布順序；右1：VapC毒素基因的誘導(dǎo)驗證；右2：VapB抗毒素基因的誘導(dǎo)驗證Left is the diagrammatic presentation,right is the identification of VapC and VapB,respectively.圖4 恥垢分枝桿菌中VapC與VapB同源蛋白的毒素與抗毒素功能的鑒定Fig.4 Identification of toxin VapC and homologous antitoxin VapB in M. smegmatis

2.3 毒素蛋白對恥垢分枝桿菌生長的抑制作用 將4個毒素基因分別克隆入pACE質(zhì)粒，抗毒素基因分別克隆入pMV 261質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入恥垢分枝桿菌感受態(tài)。涂布于含有或不含有0.1%乙酰胺溶液的7H10固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察菌體生長情況(見圖4)。可見，在恥垢分枝桿菌中，Rv2103c仍具有毒素作用，其抗毒素基因Rv2104c具有一定抑制作用。

2.4 Rv2103c的表達與純化 ITPG誘導(dǎo)pET28a-Rv2103c重組菌表達后收菌，將超聲破碎后離心所得的上清與沉淀分別SDS-PAGE電泳(見圖5)。結(jié)果顯示，沉淀中與目的蛋白(約15.95 kD)大小接近的位置有一明顯條帶；大量表達后收集超聲破碎后沉淀做包涵體蛋白純化，得到較高純度的目的蛋白(見圖6)。

M:marker;1:the whole induced bacteria;2:supernatant after centrifugation;3:precipitation after centrifugation圖5 小量誘導(dǎo)表達的蛋白可溶性鑒定Fig.5 Protein soluble identification by a small amount of induced expression

M:marker;1:supernatant after centrifugation;2、3:purification圖6 大量誘導(dǎo)表達的蛋白純化(包涵體)Fig.6 Protein purification by a large amount of induced expression (inclusion protein)

3 討 論

目前的研究顯示，結(jié)核分枝桿菌全基因組上共有79個可能的TAs，其中VapBC家族基因所占比例最高(50/79)[5]。前期工作中，我們通過生物信息學(xué)技術(shù)得到以譜系劃分的toxin基因SNP突變位點，我們從中選取了4個具有一定譜系特征，且有不同生物信息學(xué)預(yù)測的毒素基因進行初步生物學(xué)功能驗證。結(jié)果表明，僅VapC37(Rv2103c)對大腸桿菌的生長具有顯著抑制作用。在所選的4個毒素基因中，VapC12(Rv1720c)在大腸桿菌中的毒素驗證有過報道[10]，與本文研究結(jié)果一致，即對大腸桿菌沒有明顯抑制作用?？紤]到大腸桿菌與分枝桿菌性質(zhì)上存在的差異，我們選取快生長分枝桿菌模式菌株——恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)MC2155，進一步驗證所選取的4對毒素抗毒素基因是否具有抑制細菌生長的功能，結(jié)果顯示僅VapC37(Rv2103c)具有明顯的抑菌作用，VapC12(Rv1720c)、VapC38(Rv2494)對恥垢分枝桿菌的生長沒有抑制作用，與已有實驗報道相符合；但是本實驗中VapC38(Rv2494)對恥垢分枝桿菌的生長無抑制作用，與已有實驗報道不符[8]。在多次重復(fù)實驗確認重組質(zhì)粒構(gòu)建正確的情況下，我們猜測產(chǎn)生此種差異的原因可能是選用的質(zhì)粒不同。本實驗所用質(zhì)粒均由北京師范大學(xué)張俊杰教授課題組惠贈，參考其前期研究成果，同樣存在與相關(guān)報道不相符的實驗結(jié)果。例如，利用pACE構(gòu)建的毒素基因誘導(dǎo)表達體系中，Rv1942c、Rv1495對大腸桿菌及恥垢分枝桿菌的生長均無明顯抑制作用；而將毒素基因整合入pHR100質(zhì)粒[8]的生物學(xué)驗證實驗中，Rv1942c、Rv1495對大腸桿菌及恥垢分枝桿菌的生長均有明顯抑制作用。這提示我們，有必要對已有報道為有功能的毒素基因再次鑒定，以驗證是否存在假陽性結(jié)果。

前期研究中(data not shown)，我們通過對2 347株已知結(jié)核分枝桿菌全基因組序列與H37Rv標準株比對，得到107 654個SNP位點，利用生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可將其進一步劃分為7個譜系。針對結(jié)核分枝桿菌全基因組上已標注的TAs，我們以譜系為單位，對所有79個toxin基因SNP位點進行整理歸納。其中l(wèi)ineage2(東亞譜系)、lineage4(歐美譜系)、lineage3所攜帶的非同義突變SNP遠高于其他譜系。Lineage2、Lineage3、Lineage4是已知的“現(xiàn)代”譜系，帶有更多的toxin基因突變位點，符合“現(xiàn)代”譜系高致病性、強傳播力的特征。這提示我們探索高致病性“現(xiàn)代”譜系與驗證為具有生物學(xué)功能的毒素抗毒素系統(tǒng)是否存在相關(guān)性，為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的檢測與診斷，提供新的研究思路。

[1] Engelbergkulka H,Glaser G. Addiction modules and programmed cell death and antideath in bacterial cultures[J]. Microbiology,1999,53(53): 43-70.

[2] Gerdes K,Christensen SK,L?bner-Olesen A. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci[J]. Nat Rev Microbiol,2005,3(5): 371-382.

[3] Hayes F. Toxins-antitoxins: plasmid maintenance,programmed cell death,and cell cycle arrest[J]. Science,2003,301(5639): 1496-1499.

[4] Sala A,Bordes P,Genevaux P. Multiple toxin-antitoxin systems inMycobacteriumtuberculosis[J]. Toxins,2014,6(3): 1002-1020.

[5] Georgiades K,Raoult D. Genomes of the most dangerous epidemic bacteria have a virulence repertoire characterized by fewer genes but more toxin-antitoxin modules[J]. PLoS One,2011,6(3): 1387-1387.

[6] Sala A,Bordes P,Fichant G,et al. Toxin-antitoxin loci inMycobacteriumtuberculosis[M]// Prokaryotic Toxin-Antitoxins. Berlin,Springer Berlin Heidelberg,2013: 295-314.

[7] Zaychikova MV,Zakharevich NV,Sagaidak MO,et al.Mycobacteriumtuberculosistype II toxin-antitoxin systems: genetic polymorphisms and functional properties and the possibility of their use for genotyping[J]. PLoS One,2015,10(12).

[8] Ramage HR,Connolly LE,Cox JS. Comprehensive functional analysis ofMycobacteriumtuberculosistoxin-antitoxin systems: implications for pathogenesis,stress responses,and evolution[J]. PLoS Genet,2009,5(12): 1000767.

[9] Merker M,Blin C,Mona S,et al. Evolutionary history and global spread of theMycobacteriumtuberculosisBeijing lineage[J]. Nat Genet,2015,47(3): 242-249.

[10] Li XY,Li Y,Zhang Y,et al. The epidemiological characteristics of Beijing lineageMycobacteriumtuberculosisfrom a National Referral Center in China[J]. Biomed Environ Sci,2015,28(7): 539-543.

[11] Guzman LM,Belin D,Carson MJ,et al. Tight regulation,modulation,and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter[J]. J Bacteriol,1995,177(14): 4121-4130.

[12] Xian YB,Cui LD,Zhang JJ. Characterization of toxin-antitoxin systems inMycobacteriumtuberculosis[J]. Acta Microbiologica Sinica,2011,51(2): 214. (in Chinese)

賢一博,崔麗丹,張俊杰.結(jié)核分枝桿菌中毒素-抗毒素系統(tǒng)的鑒定[J].中國微生物學(xué)報，2011，51(2)：214.

[13] Lu YY,Huangpu YM. High efficiency electro-genetic transformation ofMycobacteria[J]. J Beijing Med Univ,2000,32: 178-181. (in Chinese)

路艷艷,皇甫永穆.電穿孔法對分枝桿菌進行高效基因轉(zhuǎn)化[J].北京大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版,2000,32(2):178-181.

Function of four pairs of genes in toxin-antitoxin system ofMycobacteriumtuberculosis

LIU Jing-yi1,JIA Jun-nan2,LI Wei-min2,ZHANG Jun-jie3,GAO Ji-min1

(1.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryforTechnologyandApplicationofModelOrganisms,SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China; 2.NationalTuberculosisClinicalLaboratoryofChina,CapitalMedicalUniversityAffiliatedBeijingChestHospital,Beijing101149,China; 3.KeyLaboratoryofCellProliferationandRegulationBiology,MinistryofEducation,SchoolofLifeSciences,BeijingNormalUniversity,Beijing100875,China)

We discussed the function of four pairs of genes in the toxin-antitoxin system ofMycobacteriumtuberculosis,providing theoretical foundation and scientific basis for studying the transmission mechanism ofMycobacteriumtuberculosis. Four pairs of genes which belong toVapBCfamily,including fourVapCgenes (Rv1720c,Rv2103c,Rv2494,Rv3408) and fourVapBgenes (Rv1721c,Rv2104c,Rv2493,Rv3407) were chosen. We constructed a serial of arabinose-induced hybrid plasmid system inEscherichiacoliand a serial of acetamide-induced hybrid plasmid system inMycobacteriumsmegmatisrespectively,in order to observe the potential inhibition effect ofVapCand the release inhibition of homologousVapB. Results showed that only one toxin gene(Rv2103c) showed the function of bacteriostasis in bothE.coliandM.smegmatisand the homologous antitoxin gene(Rv2104c) could release the inhibition of growth. We built the inducible systems ofVapBCfamily in bothE.coliandM.smegmatisrespectively and found only a pair of toxin and antitoxin genes(Rv2103c,Rv2104c) had the function of inhibition and release for the growth of bacteria. And two pairs of toxin genes(Rv1720c,Rv2494) did not have the function of inhibition for the growth of bothE.coliandM.smegmatis. Whereas,another toxin geneVapC47(Rv3408) also did not have the bacteriostastic activity,only this result was not consistent with the existing literature. We speculated that the reason for this kind of difference may be the different inducible systems we used. Cause the other three results were consistent with all existing literature and the doubtful result also appeared in other reports,so our protocol could be confirmed as reliable,and we would use it to build inducible systems and make further functional identification of certain toxin and antitoxin genes that we are interested in.

Mycobacteriumtuberculosis; toxin-antitoxin system; VapBC family

Gao Ji-min,Email: jimingao64@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.005

國家自然科學(xué)基金(81273144)；北京市自然科學(xué)基金B(yǎng)類重點項目(KZ201510025024)

高基民，Email:jimingao64@163.com

1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點實驗室，溫州 325035； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國家結(jié)核病臨床實驗室，北京 101149； 3.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部細胞增殖及調(diào)控生物學(xué)重點實驗室，北京 100875

R378.9

A

1002-2694(2017)05-0413-05

2016-12-09 編輯：劉岱偉

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81273144) and the Beijing Natural Science Foundation Program and Scientific Research Key Program of Beijing Municipal Commission of Education (No. KZ201510025024)