共培養(yǎng)體系下不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響

木合依扎·熱很別克，邵 偉，余 雄

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

遺傳育種與繁殖

共培養(yǎng)體系下不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響

木合依扎·熱很別克，邵 偉，余 雄

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

為提高奶山羊乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能基因的表達(dá)量，采用分離培養(yǎng)至P3代的1月齡健康薩能奶山羊乳腺上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并按2∶1的接種比例混合培養(yǎng)0、24、48、72、96、120、144和168 h（每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)）后收集細(xì)胞，以QPCR檢測(cè)各時(shí)間段SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因的表達(dá)量，比較不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：共培養(yǎng)體系下培養(yǎng)時(shí)間影響奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中SREBP、ST T5A 基因的表達(dá)量，卻對(duì)F BP3A 基因表達(dá)量沒有影響。說明共培養(yǎng)體系下奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)72 h時(shí)乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能基因的表達(dá)量最佳。

共培養(yǎng)；乳腺上皮細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；功能基因

由于乳腺功能的重要性，人們對(duì)其整體及細(xì)胞功能的研究較早，乳腺細(xì)胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發(fā)育及泌乳過程，因此，在細(xì)胞水平上研究乳腺上皮細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控是非常有意義的［1］。乳腺上皮細(xì)胞具有特殊的分泌乳汁的功能，泌乳期大量乳汁的分泌主要是由這些具有分泌活性的乳腺上皮細(xì)胞完成［2-4］。乳腺上皮細(xì)胞泌乳相關(guān)功能基因是奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中直接影響泌乳性能的基因組，其基因表達(dá)是奶山羊乳腺發(fā)育狀況的標(biāo)志。

乳脂和乳蛋白是乳中主要成分，是評(píng)估乳及乳產(chǎn)品的感官指標(biāo)。乳脂由甘油三酯和少量的甘油二酯、甘油一酯、游離脂肪酸和視黃醇組成［5］。乳中甘油三酯主要有兩個(gè)來源，一是從外周循環(huán)血液中吸收的脂肪酸；二是通過乳腺分泌細(xì)胞合成。乳中乳蛋白含量受許多因素的影響，如遺傳、生理階段、環(huán)境、疾病及飼養(yǎng)方式等［6］，乳腺是一個(gè)合成蛋白質(zhì)十分活躍的場(chǎng)所，乳蛋白的合成僅在乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行。而乳腺中 FABP3、SREBP、STAT5基因就是調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞乳脂和乳蛋白的關(guān)鍵基因。梁夢(mèng)瑤［7］采用基因過表達(dá)和基因沉默技術(shù)，驗(yàn)證了FABP3基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的功能，發(fā)現(xiàn)FABP3基因表達(dá)的變化可調(diào)控乳脂合成重要調(diào)節(jié)分子蛋白的表達(dá)，證明FABP3具有調(diào)控乳脂合成的功能。催乳素入胞后引起轉(zhuǎn)錄因子STAT5的酪氨酸磷酸化，酪氨酸磷酸化的STAT5再與乳蛋白基因上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。當(dāng)糖皮質(zhì)激素和催乳素同時(shí)存在時(shí)，STAT5和GR兩者結(jié)合形成復(fù)合物，可增強(qiáng)對(duì)靶基因的誘導(dǎo)作用［8］。因此，本研究通過共培養(yǎng)技術(shù)不同培養(yǎng)時(shí)間檢測(cè)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞SREBP、FABP3、STAT5基因的表達(dá)量，從而為確定間充質(zhì)干細(xì)胞與體細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能基因表達(dá)量的最適時(shí)間提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

從1月齡健康薩能奶山羊的乳腺組織中分離乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）和骨髓中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），將乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）經(jīng)3代純化培養(yǎng)。

1.2 儀器及試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、低速離心儀、Benchmark酶標(biāo)儀、六孔板，SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（takara）；PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）（takara）；MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Stratagene，US）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用分離培養(yǎng)至P3代的1月齡健康薩能奶山羊乳腺上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按2∶1的接種比例混合培養(yǎng)0、24、48、72、96、120、144和168 h（每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)）后收集細(xì)胞，以QPCR檢測(cè)各時(shí)間段SREBP、STAT5、FABP3基因的表達(dá)量，比較不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞SREBP、STAT5、FABP3基因表達(dá)量的影響。

1.4 方法

1.4.1 奶山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離、純化參考解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全骨髓法制備大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法，無菌采集1月齡雌性薩能奶山羊股骨，剔除肌肉、筋膜、骨膜、軟骨等，用吸有培養(yǎng)液的一次性注射器沖出骨髓。采用percoll密度梯度離心法純化細(xì)胞［9］。將分離純化的細(xì)胞培養(yǎng)至P3代。

1.4.2 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）的分離、純化 參考張以濤等［10］的乳腺上皮細(xì)胞分離、純化及傳代方法，培養(yǎng)純化至P3代。

1.4.3 奶山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）的混合培養(yǎng) 將培養(yǎng)至P3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMEC和BMSCs混合培養(yǎng)，10%FBS、5%CO2、37℃下培養(yǎng)，每48小時(shí)換液一次。

1.4.4 不同培養(yǎng)時(shí)間乳腺上皮細(xì)胞泌乳基因表達(dá)量的測(cè)定1.4.4.1細(xì)胞回收和總RNA的提取檢測(cè) 奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按2∶1的接種比例混合培養(yǎng)至0、24、48、72、96、120、144和168 h時(shí)收集細(xì)胞，并進(jìn)行總RNA的提取。用何彥林［11］的細(xì)胞收集方法與馬杰等［12］的總RNA的提取方法。之后用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)出RNA濃度以及OD260/OD280值，檢測(cè)其純度。

1.4.4.2 引物合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 各基因引物由上海博谷丁生物科技公司合成。SREBP基因引物序列為F（上游引物）：5′-TCTGGAGGCATCGCAAGC-3′，R（下游引物）：5′-GAGGTTCCAGAGGAGGCTACA-3′，產(chǎn)物大小為 149 bp；STAT5基因引物序列為 F（上游引物）：5′-CAGTGGTTTGACGGGGTGA-3′，R（下游引物）：5′-TCCAGGCGATGGTGATGC-3′，產(chǎn)物大小為181bp；FABP3基 因 引 物 序 列 為 F（上 游 引 物）：5′-CTCACCCTAAAAACACACAGCAC-3′，R（下游引物）：5′-GTGAACAAGTTTCCCTCCATCC-3′，產(chǎn)物大小為135bp。

PCR反應(yīng)條件體系：PCR Master Mix 10μL，上游引物（20 pmol/μL）0.08 μL，下游引物（20 pmol/μL）0.08 μL，cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 IU/μL）0.4 μL，ddH2O加至20 μL。

PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性12 s；59℃退火40 s；72℃延伸45 s；重復(fù)循環(huán)40次。擴(kuò)增結(jié)束后自動(dòng)分析融解曲線，確定PCR產(chǎn)物的特異性。將各基因的熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增片段的特異性和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

熒光定量的數(shù)據(jù)用△Ct值表示，ΔCt=Ct（目的基因）－Ct（GAPDH）。所得的2-△△Ct值經(jīng)SPSS18.0中的ANOVA過程進(jìn)行單因子方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA完整性檢測(cè)結(jié)果

用1%的瓊脂糖凝膠電泳和全分光光度計(jì)檢測(cè)提取總RNA模板。如圖1所示，試驗(yàn)提取的基因組DNA模板質(zhì)量良好、純度高、不需要純化，可直接用作模板DNA。

2.2 乳腺上皮細(xì)胞SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因QPCR產(chǎn)物特異性

熔解曲線如圖2～4所示，PCR產(chǎn)物均為單一峰，梯度模板熔解曲線十分集中，擴(kuò)增曲線均已光滑。說明沒有引物二聚體并擴(kuò)增產(chǎn)物特異。

圖1 DNA完整性檢測(cè)結(jié)果

圖2 FABP3基因擴(kuò)增曲線與溶解曲線

圖3 SREBP基因擴(kuò)增曲線與溶解曲線

圖4 STAT5基因擴(kuò)增曲線與溶解曲線

2.3 共培養(yǎng)體系下不同培養(yǎng)時(shí)間BMEC泌乳功能基因表達(dá)量的比較

由表1可見，乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)體系下不同培養(yǎng)時(shí)間乳腺上皮細(xì)胞SREBP基因與ST T5A 基因表達(dá)量差異顯著（P＜0.05），混合培養(yǎng)體系下乳腺上皮細(xì)胞SREBP基因表達(dá)量在24～96 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間段（P＜0.05），其中72 h時(shí)的表達(dá)量最高，96 h開始表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；乳腺上皮細(xì)胞STAT5基因表達(dá)量在72～120 h時(shí)顯著高于24～48 h時(shí)的表達(dá)量（P＜0.05），其中72 h時(shí)的表達(dá)量最高；而不同培養(yǎng)時(shí)間F BP3A 基因的表達(dá)量差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 混合培養(yǎng)體系下不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BMEC功能基因表達(dá)量的影響

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同培養(yǎng)時(shí)間條件下奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞SREBP基因與ST T5A 基因表達(dá)量在72 h時(shí)與其他時(shí)間段存在顯著差異（P＜0.05），而F BP3A 基因表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)均差異不顯著（P＞0.05）。通過3種基因表達(dá)量圖分析，當(dāng)共培養(yǎng)72 h時(shí)SREBP、ST T5A 、F BP3A 基因表達(dá)量均最高?？赡艿脑蚴枪撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞適應(yīng)共培養(yǎng)環(huán)境并開始旁分泌等功能的激活需要一段時(shí)間，當(dāng)共培養(yǎng)72 h時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，分泌的細(xì)胞因子較多，使調(diào)控通路得到實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞表面的受體從而與周圍的環(huán)境更加有效作用，為細(xì)胞因子的調(diào)控提供了條件。細(xì)胞的形態(tài)形成與其功能性是密切相關(guān)的，在共培養(yǎng)體系下觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)72 h時(shí)兩種細(xì)胞形態(tài)更接近于細(xì)胞最佳形態(tài)，因此基因的表達(dá)量得到最佳狀態(tài)。而72 h后細(xì)胞也慢慢開始進(jìn)入凋亡時(shí)期，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能開始表現(xiàn)降低，細(xì)胞的腺泡結(jié)構(gòu)不再完整，除此之外，共培養(yǎng)72 h之后共培養(yǎng)細(xì)胞的密度也越來越高，不利于細(xì)胞的增殖、分化，所以共培養(yǎng)72h時(shí)乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能基因的表達(dá)量最高。本試驗(yàn)中乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)不同的時(shí)間，對(duì)乳腺上皮細(xì)胞F BP3A 基因表達(dá)量無顯著影響，是因?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能抑制F BP3A 基因表達(dá)量，使其表達(dá)量不顯著（P＞0.05）。

王立文等［13］在奶牛乳腺上皮細(xì)胞與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的試驗(yàn)研究中表明，奶牛乳腺上皮細(xì)胞與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)至72 h時(shí)目的細(xì)胞的增殖、分化等最佳。顧勁揚(yáng)［14］在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)研究試驗(yàn)中提出，肝細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2∶1組成的最適共培養(yǎng)體系培養(yǎng)至第2天時(shí)有望為今后BAL的構(gòu)建提供理想細(xì)胞材料。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相符，所以奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)至72 h時(shí)乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能基因的表達(dá)量為最佳。

4 小結(jié)

共培養(yǎng)體系下培養(yǎng)時(shí)間影響B(tài)MEC中SREBP、STAT5基因的表達(dá)量，卻對(duì)FABP3基因的表達(dá)量沒有影響。表明共培養(yǎng)體系下奶山羊BMEC與BMSCs混合培養(yǎng)72 h時(shí)乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能基因的表達(dá)量最佳。

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Effects of Different Culture Time on Gene Expression of Mammary Gland Epithelial Cell in Dairy Goat under Co-culture System

Muheyizha·Rehenbieke，ShaoWei，Yu Xiong
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

In order toimprove the expression oflactation genes in mammarygland epithelial cells ofdairygoats,the mammarygland epithelial cells and bone marrowmesenchymal stemcells were cultured in a ratio2∶1，the expression ofSREBP，ST T5A and F BP3A were detected byQPCR at 24，48，72，96，120，144，168 h（three replicates per treatment）.The results showed that the culture time of co-culture system affected the expression of SREBP and ST T5A gene in dairy goat mammary gland epithelial cells，but had no effectonF BP3A geneexpression.Accordingtotheresults，theexpressionoflactationgeneinmammaryglandepithelialcellsafter72h ofmixedculturewasthebest.

co-culture；mammaryepithelialcell；mesenchymalstemcell；functionalgene

S827.2

A

2095-3887（2017）03-0001-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.001

2017-03-24

新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2015KL018）；2015年國(guó)家自然基金（31560645）；農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代奶產(chǎn)業(yè)體系（cars-37）；中國(guó)博士后基金委資助作者簡(jiǎn)介：木合依扎·熱很別克(1991-)，女，碩士研究生。

余雄，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料的教學(xué)與研究工作。