多烯磷脂酰膽堿對奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶所致荷瘤裸鼠肝損傷的保護(hù)作用

徐盟，費(fèi)倩，孟瀟，李金娜，張?zhí)煜?，王穎

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腫瘤科，沈陽110022）

多烯磷脂酰膽堿對奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶所致荷瘤裸鼠肝損傷的保護(hù)作用

徐盟，費(fèi)倩，孟瀟，李金娜，張?zhí)煜?，王穎

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腫瘤科，沈陽110022）

目的探討多烯磷脂酰膽堿對奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶所致肝損傷的保護(hù)作用。方法30只BALB/c裸鼠皮下種植結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞制備荷瘤裸鼠模型，隨機(jī)分為3組:肝損傷組，實(shí)驗(yàn)首日腹腔注射奧沙利鉑（6 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，同時(shí)連續(xù)7 d腹腔注射氟尿嘧啶（20 mg·kg-1·d-1）；多烯磷脂酰膽堿組，在給予等量氟尿嘧啶和奧沙利鉑前30 min，腹腔注射多烯磷脂酰膽堿（85 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共7 d；荷瘤空白組，注射生理鹽水作為對照。取各組裸鼠肝臟，石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的變化；制作超薄切片，電子顯微鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；制作10%肝組織勻漿，黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法檢測過氧化氫酶（CAT）活性。結(jié)果肝損傷組裸鼠肝臟的胞質(zhì)局部溶解，線粒體膜破損，細(xì)胞核膜水腫模糊，肝竇擴(kuò)張，多烯磷脂酰膽堿部分逆轉(zhuǎn)了這些損傷。與荷瘤空白組相比，肝損傷組SOD和CAT的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與肝損傷組相比，多烯磷脂酰膽堿組SOD和CAT的表達(dá)升高（P＜0.05）。說明多烯磷脂酰膽堿能減輕化療藥物對肝臟的毒性作用，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)論多烯磷脂酰膽堿對氟尿嘧啶聯(lián)合奧沙利鉑引起的肝損傷具有預(yù)防、保護(hù)作用，該作用可能與其膜修復(fù)和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用有關(guān)。

多烯磷脂酰膽堿；結(jié)腸癌；肝損傷；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶

有研究［1］報(bào)道，近四分之一的晚期結(jié)直腸癌患者在確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。目前對肝轉(zhuǎn)移的有效治療手段是新輔助化療聯(lián)合轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)［2］，因?yàn)榛熆梢钥s小肝轉(zhuǎn)移灶，使原本失去手術(shù)機(jī)會的部分患者重新獲得根治性切除的機(jī)會［3］，延長無瘤生存時(shí)間［4-5］。但是如果化療時(shí)產(chǎn)生肝損傷，反而可能增加患者的圍術(shù)期死亡率。化療藥物是很常見的導(dǎo)致肝損傷的因素之一，表現(xiàn)形式多樣，常見的有奧沙利鉑引起肝竇擴(kuò)張，氟尿嘧啶引起炎癥反應(yīng)等［6-9］。本研究選取多烯磷脂酰膽堿作為主要研究藥物，通過制備荷瘤裸鼠模型，觀察經(jīng)多烯磷脂酰膽堿干預(yù)后的肝臟組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)改變以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）的表達(dá)水平，從而為結(jié)直腸癌新輔助化療中防止肝損傷提供用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞庫提供）；1640液體培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶/胰蛋白酶液（美國Hyclone公司）；SOD、CAT蛋白定量試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；奧沙利鉑注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；多烯磷脂酰膽堿注射液（賽諾菲制藥有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與荷瘤裸鼠模型制備

采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)HCT116細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，密度為1×107/mL。將裸鼠右腋窩處皮膚消毒，用1 mL注射器抽取0.2 mL細(xì)胞懸液于消毒部位皮下接種，SPF級飼養(yǎng)室繼續(xù)喂養(yǎng)觀察。30只裸鼠均于第5天出現(xiàn)肉眼可見的瘤塊，第7天瘤塊體積增長至約100 mm3。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與標(biāo)本制備

采用隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)方法，取荷瘤裸鼠30只，隨機(jī)分為多烯磷脂酰膽堿組、肝損傷組、荷瘤空白組，每組10只。肝損傷組：實(shí)驗(yàn)首日腹腔注射奧沙利鉑（6 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，同時(shí)連續(xù)7 d腹腔注射氟尿嘧啶（20 mg·kg-1·d-1）；多烯磷脂酰膽堿組：在給予等量氟尿嘧啶和奧沙利鉑前30 min，腹腔注射多烯磷脂酰膽堿（85 mg·kg-1·d-1）0.2 mL，共7 d；荷瘤空白組：腹腔注射生理鹽水作對照。

給藥結(jié)束后將各組裸鼠麻醉處死，迅速剔除裸鼠腹部體毛并用碘伏和75%乙醇做消毒處理，用無菌手術(shù)剪在裸鼠腹部做正中切口，并將皮膚向兩側(cè)分離以暴露腹腔，取出肝臟。每只裸鼠用眼科剪剪去肝組織約0.2 g，剪碎，加入0.86%冷生理鹽水，用組織搗碎機(jī)以10 000 r/min上下研磨制成10%組織勻漿，離心留取上層清液，按試劑盒說明書加樣后，用酶標(biāo)儀測定SOD和CAT水平。每只裸鼠剪取肝組織2塊，1塊迅速浸入10%甲醛固定液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色制成肝臟HE染色切片；1塊立即置于2.5%戊二醛液中固定，1%鋨酸后固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片，鈾鉛雙重染色制成電鏡超薄切片。分別在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

荷瘤裸鼠肝組織HE染色顯示：給藥結(jié)束后，荷瘤空白組裸鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，未見肝竇擴(kuò)張及炎癥細(xì)胞浸潤（圖1A）；肝損傷組2例出現(xiàn)明顯肝竇擴(kuò)張（圖1B）；多烯磷脂酰膽堿組9只裸鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，未見肝竇擴(kuò)張及肝細(xì)胞壞死等損傷表現(xiàn)，僅1例可見輕度肝竇擴(kuò)張（圖1C）。

2.2 肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變

圖1 肝臟的組織學(xué)表現(xiàn)HE×100Fig.1 Pathology of liver samples HE×100

給藥結(jié)束后，荷瘤空白組肝細(xì)胞核膜光滑，核仁清楚，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖2A）；肝損傷組肝細(xì)胞核型不規(guī)則，核膜局部水腫模糊，胞質(zhì)局部溶解，線粒體外膜破損，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張（圖2B）；多烯磷脂酰膽堿組肝細(xì)胞核膜光滑，胞質(zhì)內(nèi)有較多結(jié)構(gòu)完整的線粒體，偶見線粒體外膜破損（圖2C）。

2.3 肝臟組織SOD和CAT的表達(dá)結(jié)果

圖2 肝臟的電鏡超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)鈾鉛雙重染色×15 000Fig.2 Ultrastructure of liver samples Uranyl acetate and lead citrate staining×15 000

多烯磷脂酰膽堿組、肝損傷組、荷瘤空白組SOD表達(dá)水平分別為（1.76±0.36）、（1.44±0.31）、（2.45± 0.32）U/mg prot，CAT表達(dá)水平分別為（40.10±2.44）、（34.11±3.34）、（58.9±2.04）U/mg prot。與荷瘤空白組相比，肝損傷組SOD和CAT的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與肝損傷組相比，多烯磷脂酰膽堿組SOD和CAT的表達(dá)升高（P＜0.05）。證明了多烯磷脂酰膽堿能減輕化療藥物對肝臟的毒性作用，抑制肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3 討論

目前的腫瘤化療研究通常采用裸鼠腋下注射腫瘤細(xì)胞制作荷瘤裸鼠模型，并在腹腔注射化療藥物來進(jìn)行模擬。本研究采用的結(jié)腸癌荷瘤裸鼠是一個(gè)較好的用于研究防止奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶導(dǎo)致肝損傷的動(dòng)物模型。SOD和CAT是機(jī)體內(nèi)2種主要的過氧化物酶，存在于各種組織和器官內(nèi)，在肝臟中含量最高。在細(xì)胞膜被破壞、發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時(shí)，SOD和CAT的活性明顯增強(qiáng)。研究［10］表明，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是肝損傷的主要發(fā)生機(jī)制之一。它的原理是氧自由基產(chǎn)生過多，無法快速有效清除，逐漸堆積進(jìn)而引起肝損傷。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生時(shí)抗氧化酶活性增強(qiáng)，從而修復(fù)組織和細(xì)胞器的損傷，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化作用［11］。目前有研究［12］表明多烯磷脂酰膽堿能增強(qiáng)CAT、SOD和谷胱甘肽還原酶的活性，加強(qiáng)受損細(xì)胞膜的修復(fù)，并對組織損傷有一定抗氧化治療作用。本研究中，多烯磷脂酰膽堿組SOD和CAT的表達(dá)升高可以證實(shí)多烯磷脂酰膽堿能通過增強(qiáng)SOD和CAT活性，減輕化療藥物的毒性作用，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而修復(fù)化療性肝損傷。

越來越多的研究［6］發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑為主的化療可能導(dǎo)致肝竇梗阻綜合征的發(fā)生。肝竇梗阻綜合征是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損害致肝竇流出道阻塞所引起的肝內(nèi)竇型門靜脈高壓癥，以門脈高壓為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者可進(jìn)展為肝衰竭。主要組織學(xué)改變包括肝竇擴(kuò)張、肝內(nèi)淤血壞死［7］。本研究的光鏡結(jié)果證實(shí)了這一觀點(diǎn)，同時(shí)通過多烯磷脂酰膽堿組與肝損傷組對照，也證實(shí)了多烯磷脂酰膽堿對奧沙利鉑所致肝組織損傷的確具有一定保護(hù)作用。

多烯磷脂酰膽堿的主要活性成分是1，2二亞油酰磷脂酰膽堿，它與人體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)高度相似，能增加膜流動(dòng)性。由于該藥的這一特性，它常被用于保肝治療，起修復(fù)肝細(xì)胞膜作用。但預(yù)防性用于化療所致肝損傷中并不多見，也無統(tǒng)一的用藥指導(dǎo)。本研究的肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果證實(shí)了奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶方案化療可致膜結(jié)構(gòu)明顯損傷，也證實(shí)了多烯磷脂酰膽堿對化療性肝損傷具有有效的保護(hù)作用。

總之，本研究從組織結(jié)構(gòu)和蛋白分子水平闡明多烯磷脂酰膽堿通過抑制肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、修復(fù)細(xì)胞膜、減輕肝竇內(nèi)皮損傷，減少奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶方案化療所致肝損傷的發(fā)生。據(jù)此結(jié)果推測，在進(jìn)行奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶方案化療的同時(shí)應(yīng)用多烯磷脂酰膽堿，不失為一種安全、有效的保肝治療方法。

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（編輯 陳姜）

Effects of Polyene Phosphatidylcholine on Hepatic Injury of Tumor-bearing Nude Mice Induced by Oxaliplatin and 5-fluorouracil Chemotherapy

XU Meng，F(xiàn)EI Qian，MENG Xiao，LI Jinna，ZHANG Tianxiang，WANG Ying

（Department of Oncology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110022，China）

Objective To study the protective effect of polyene phosphatidylcholine on hepatic injury induced by oxaliplatin and 5-fluorouracil.MethodsA subcutaneous tumor model was established by transplanting colocarcinoma HCT116 cells into 30 nude mice，which were randomized into three groups.The polyene phosphatidylcholine group was injected with polyene phosphatidylcholine（85 mg·kg-1·d-1）and 5-fluorouracil（20 mg·kg-1·d-1）for 7 days，and then injected with oxaliplatin（6 mg·kg-1·d-1）for 1 day.The hepatic injury group was injected with 5-fluorouracil（20 mg·kg-1·d-1）for 7 days and oxaliplatin（6 mg·kg-1·d-1）for 1 day.The tumor-bearing blank group was injected with normal saline.Hepatic injury was observed with ultrathin pathological sections.Liver homogenates were prepared to detect superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）activity.ResultsIn the hepatic injury group，pathological sections revealed dissolved cellular cytoplasm，mitochondrial membrane damage，cell membrane edema，and fuzzy，sinusoidal cell expansion.There were no obvious hepatic injuries observed in the polyene phosphatidylcholine group.The expression of SOD and CAT were lower in the hepatic injury and polyene phosphatidylcholine groups compared to the tumor-bearing blank group（P＜0.05）.The expression of SOD and CAT were higher in the polyene phosphatidylcholine group compared to the hepatic injury group（P＜0.05）.ConclusionPolyene phosphatidylcholine has a protective effect on hepatic injury induced by oxaliplatin and 5-fluorouracil，which may be related to its effect on membrane repair and inhibition of oxidative stress.

polyene phosphatidylcholine；colon cancer；hepatic injury；superoxide dismutase；catalase

R735.3

A

0258-4646（2017）06-0544-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.015

沈陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F13-316-1-69）

徐盟（1990-），女，碩士研究生.

王穎，E-mail：wang_ying@sj-hospital.org

2016-10-24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：