益氣健脾方對(duì)脾氣虛證模型大鼠心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性的影響

李思琦，張哲，楊關(guān)林，宋囡，閔冬雨，王鳳榮

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1.研究生學(xué)院，沈陽110847；2.附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心，沈陽110032；3.附屬醫(yī)院心內(nèi)一科，沈陽110032）

益氣健脾方對(duì)脾氣虛證模型大鼠心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性的影響

李思琦1，張哲2，楊關(guān)林1，宋囡1，閔冬雨2，王鳳榮3

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1.研究生學(xué)院，沈陽110847；2.附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心，沈陽110032；3.附屬醫(yī)院心內(nèi)一科，沈陽110032）

目的探究益氣健脾方對(duì)脾氣虛證模型大鼠心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性的影響。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組，每組10只，對(duì)3組大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。模型組和治療組大鼠采取飲食干預(yù)聯(lián)合極限游泳法進(jìn)行脾氣虛造模，于實(shí)驗(yàn)第15天對(duì)3組大鼠的體質(zhì)量、肛溫、食量、飲水量及脾氣虛癥狀積分進(jìn)行測(cè)評(píng)。造模成功后，正常組和模型組采用常規(guī)飼養(yǎng)方式聯(lián)合生理鹽水灌胃，治療組采用常規(guī)飼養(yǎng)方式聯(lián)合益氣健脾中藥湯劑灌胃，時(shí)間為8周。之后分別取3組大鼠的心肌線粒體，測(cè)定心肌組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性。結(jié)果模型組大鼠的線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ和復(fù)合物Ⅳ活性明顯低于正常組（P＜0.05）；治療組大鼠的線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ和復(fù)合物Ⅳ活性與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論脾氣虛能夠造成心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生突變和缺失，導(dǎo)致呼吸鏈酶復(fù)合物活性下降，益氣健脾中藥能夠調(diào)節(jié)心肌組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ和復(fù)合物Ⅳ活性。

益氣健脾；脾氣虛；線粒體；呼吸鏈酶復(fù)合物

我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾為后天之本，氣血生化之源，脾主運(yùn)化，運(yùn)化血液和水谷精微［1］。脾臟在人體生命活動(dòng)具有不可代替的位置和作用［2-3］。通過大量研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，脾臟的生理功能對(duì)于解釋現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的某些特征同樣適用，當(dāng)脾氣虛衰時(shí)，人體的氣化無源，肌肉血脈濡養(yǎng)失司，人體會(huì)有虛衰的表現(xiàn)，機(jī)體各臟器生理功能、新陳代謝速率、免疫及循環(huán)系統(tǒng)均受到影響。若脾氣虛衰則機(jī)體臟器生命活動(dòng)異常，甚至進(jìn)入衰老階段［6-7］。

線粒體是細(xì)胞合成及儲(chǔ)藏能量的場(chǎng)所，是體內(nèi)能量交換及各物質(zhì)間進(jìn)行氧化的地點(diǎn)［8］。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ是機(jī)體內(nèi)部能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的橋梁，線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅳ穩(wěn)定性較差，受到活性氧自由基攻擊后，細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合電子的能力下降，導(dǎo)致ATP合成減少，而損傷呼吸產(chǎn)能過程［9-10］。本研究采用脾氣虛證大鼠造模，探討益氣健脾方對(duì)脾氣虛證模型大鼠心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物的選擇與分組

實(shí)驗(yàn)選擇SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量（210.34± 14.38）g，隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組，每組10只，由遼寧本溪長生生物有限公司提供。模型組和治療組大鼠采取飲食干預(yù)聯(lián)合極限游泳法進(jìn)行脾虛證造模，3組大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，除造模干預(yù)外，3組大鼠的飼養(yǎng)方式相同，對(duì)大鼠進(jìn)行顆粒飼料喂藥并供其自由飲水，定時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行溫度、濕度、光線等控制，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則［10］。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：1～14 d，模型組單日對(duì)大鼠進(jìn)行1次甘藍(lán)喂養(yǎng)（18 g/只），自由飲水，進(jìn)食后對(duì)大鼠采用極限游泳法，即將大鼠置于水中，使其自由游泳，直至大鼠首次出現(xiàn)口鼻進(jìn)入水面之下；雙日對(duì)大鼠采用豬油脂灌胃（3.0 mL），自由飲水［11］。第15天對(duì)模型組大鼠進(jìn)行脾虛證造模評(píng)估，以《實(shí)用中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)》［12］、全國老年病學(xué)會(huì)制定的“中醫(yī)脾虛證參考標(biāo)準(zhǔn)”［13］、大鼠生物學(xué)特征以及《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》［14］為參考標(biāo)準(zhǔn)：（1）體質(zhì)量明顯下降；（2）糞便溏泄、排便次數(shù)增多、肛溫變化不顯著；（3）食欲不振、進(jìn)食量明顯降低；（4）倦怠無力、毛皮失去光澤、蜷縮弓背；（5）睡眠時(shí)間增多、游泳時(shí)間顯著縮短。

1.2.2 治療方法：造模成功后，正常組和模型組采用常規(guī)飼養(yǎng)方式聯(lián)合生理鹽水灌胃，治療組采用常規(guī)飼養(yǎng)方式聯(lián)合益氣健脾中藥方［由黃芪10 g、黨參10 g、茯苓10 g、白術(shù)10 g、炙甘草3 g、丹參10 g、清半夏6 g、瓜蔞10 g組成，以上中藥購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院草藥局，經(jīng)生藥學(xué)鑒定均為合格藥材，均按常規(guī)煎法并濃縮成含生藥（3 g/mL）的濃縮藥液備用］灌胃，灌胃劑量為6 g/kg，2次/d，治療時(shí)間為8周。

1.2.3 儀器及試劑：精密數(shù)字電子天平、低速離心機(jī)、恒溫水浴箱、高速離心機(jī)（德國公司生產(chǎn)）、DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波儀器研究所）、蛋白核酸分析儀（美國）、電泳、電泳槽。LA TaqDNA（聚合酶寶生物工程有限公司）、EB蔗糖、細(xì)胞色素C、甘露糖、肝素、瓊脂糖等。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)評(píng)：實(shí)驗(yàn)第15天對(duì)各組大鼠進(jìn)行取材及指標(biāo)測(cè)評(píng)。

1.2.4.1 脾氣虛癥狀評(píng)分滿分為10分。糞便溏泄，2分；毛質(zhì)無光，2分；倦怠無力，2分；蜷縮弓背，2分；食量減少，1分；形體消瘦，1分。得分越高說明脾氣虛證越典型［13］。

1.2.4.2 呼吸鏈酶復(fù)合物活性測(cè)定將大鼠心肌組織放入液體氮中，并置于-70℃冰箱中冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＃?）心肌組織線粒體溶液的制備，從冰箱中取出0.6 g心肌組織，在0℃以下的冷凍中將其切碎，加入分離介質(zhì)6 mL，0℃以下離心，4 000 r/min持續(xù)4 min，取上部清液，0℃離心，10 000 r/min持續(xù)15 min。取下層沉淀物用洗液洗滌干凈后，離心并置于0.5 mL的分離介質(zhì)中保存?zhèn)溆?。?）呼吸鏈酶復(fù)合物的測(cè)定，取干凈燒杯，加入濃度為0.20 mol/L的磷酸緩沖液2.0 mL、濃度為1.25 mol/L的還原性細(xì)胞色素C 0.05 mL。倒入蒸餾水使燒杯內(nèi)溶液體積達(dá)到3.0 mL，用經(jīng)過波長為0.55 mm的連續(xù)波照射的心肌線粒體溶液進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)定后，加入固定維生素C及高鐵氰化鉀，最后測(cè)出細(xì)胞色素C完全和不完全氧化的光吸收，算出細(xì)胞色素C的數(shù)值。另取一個(gè)干凈燒杯，加入分離介質(zhì)代替心肌線粒體溶液，不加入LTris調(diào)配液，其余溶液與第一個(gè)燒杯中的溶液相同。計(jì)算出每mg心肌線粒體蛋白每分鐘消耗還原性細(xì)胞色素體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示。組間比較應(yīng)用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 組大鼠體質(zhì)量、肛溫（肛周溫度）、食量、飲水量及脾氣虛癥狀積分比較

結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、食量減少，脾氣虛癥狀積分評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組大鼠體質(zhì)量、食量升高，脾氣虛癥狀積分評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。見表1。

2.23 組大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ及Ⅳ活性比較

表1 3組大鼠體質(zhì)量、肛溫、食量、飲水量及脾氣虛癥狀積分的比較Tab.1 Comparison of body weight，rectal temperature，food intake，water intake，and spleen qi deficiency syndrome in three groups of rats

表1 3組大鼠體質(zhì)量、肛溫、食量、飲水量及脾氣虛癥狀積分的比較Tab.1 Comparison of body weight，rectal temperature，food intake，water intake，and spleen qi deficiency syndrome in three groups of rats

1）P＜0.05 vs normal group；2）P＜0.05 vs model group.

GroupnBody weight（g）Perianal temperature（℃）Food intake（g/d）Water intake（mL/d）Symptom points Normal10240.02±12.0336.42±1.0210.02±2.1823.03±6.021.11±0.22 Model10150.68±12.411）35.74±1.037.82±2.011）21.44±6.448.83±1.111）Treatment10238.55±13.372）36.05±1.129.51±2.022）22.42±6.111.45±0.632）

表2 3組大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ及Ⅳ活性的比較（s）Tab.2 Comparison of the activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexesⅡandⅣin three groups of rats

表2 3組大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ及Ⅳ活性的比較（s）Tab.2 Comparison of the activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexesⅡandⅣin three groups of rats

1）P＜0.05 vs normal group；2）P＜0.05 vs model group.

GroupnComplexⅡComplexⅣNormal104.89±1.0124.56±7.72 Model101.87±0.591）14.42±4.281）Treatment104.68±0.862）22.97±7.562）

結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ和Ⅳ表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后，與模型組比較，治療組心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ和Ⅳ表達(dá)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

當(dāng)脾氣虛衰時(shí)，線粒體功能會(huì)發(fā)生異常。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［16］發(fā)現(xiàn)，脾氣虛大鼠心肌、肝和小腸等細(xì)胞線粒體含量明顯減少，線粒體結(jié)構(gòu)異常。線粒體內(nèi)膜中存在特殊的由蛋白質(zhì)組成的能量傳遞鏈，包括呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ、Ⅳ等，這些復(fù)合物按照其氧化還原電位順序排列于線粒體內(nèi)膜，構(gòu)成兩條呼吸鏈。氧化反應(yīng)是人體活性氧的重要來源，當(dāng)能量傳遞鏈功能損傷時(shí)，會(huì)源源不斷的生成羥自由基等，而線粒體自身清除自由基能力下降，則會(huì)導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)氧化性損傷。復(fù)合物Ⅳ是性質(zhì)最不穩(wěn)定的、易受損傷的酶，當(dāng)遭到自由基的破壞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致整個(gè)呼吸鏈結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而造成復(fù)合物Ⅱ、Ⅳ功能損害，導(dǎo)致整條呼吸鏈的瓦解，使得呼吸功能發(fā)生不可逆的損傷［17］。

線粒體是儲(chǔ)藏人體能量的場(chǎng)所，提供生物體內(nèi)的生物合成、呼吸、分泌及機(jī)械運(yùn)動(dòng)等全部細(xì)胞活動(dòng)所需要的化學(xué)能［18］，在功能上與脾的“后天之本”極為相似。當(dāng)脾氣虛時(shí)，細(xì)胞內(nèi)部線粒體功能也同樣發(fā)生變化，有學(xué)者［19］在對(duì)脾氣虛大鼠線粒體進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，脾氣虛大鼠線粒體數(shù)目較正常大鼠明顯減少，且線粒體結(jié)構(gòu)亦發(fā)生了內(nèi)膜損傷、DNA突變、基質(zhì)外滲等改變。

本研究對(duì)大鼠脾氣虛證采用飲食干預(yù)+極度疲勞法進(jìn)行造模，成模效果較好，造模大鼠出現(xiàn)脾虛表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ和復(fù)合物Ⅳ活性與治療組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明大鼠在脾氣虛狀態(tài)下呼吸鏈酶復(fù)合物活性下降，線粒體功能出現(xiàn)異常，同時(shí)說明了益氣健脾中藥能夠逆轉(zhuǎn)脾虛大鼠的線粒體功能損傷。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ、Ⅳ活性治療組略低于正常組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明益氣健脾中藥能夠改善大鼠心肌功能，調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ、Ⅳ升高。

綜上所述，脾氣虛可導(dǎo)致大鼠心肌組織線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性下降，而益氣健脾中藥能夠有效緩解、逆轉(zhuǎn)，因此臨床中可使用益氣健脾中藥預(yù)防和治療脾氣虛證，改善患者的線粒體功能。機(jī)體脾虛則濕邪易困，本研究對(duì)濕邪困脾的因素研究甚少，還有待進(jìn)一步深入探討。后續(xù)將探索“脾喜燥惡濕”與“線粒體內(nèi)膜外表面pH變化”可能存在的關(guān)聯(lián)機(jī)制，為更深入探討脾虛與線粒體相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制及從脾立論防治相關(guān)系列疾病提供有力實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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（編輯 武玉欣）

Effect of a Decoction to Nourish Qi and Invigorate the Spleen on the Activity of Mitochondrial Respiratory Chain Enzyme Complexes in Cardiomyocytes of Rats with Spleen Qi Deficiency Syndrome

LI Siqi1，ZHANG Zhe2，YANG Guanlin1，SONG Nan1，MIN Dongyu2，WANG Fengrong3

（1.Graduate School of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.The Center of Traditional Chinese Medicine，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；3.Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

Objective To investigate the effect of a decoction to nourish qi and invigorate the spleen on mitochondrial respiratory chain enzyme complex activity in cardiomyocytes of rats with spleen qi deficiency syndrome.MethodsRats were randomly divided into normal，model，and treatment groups.The model and treatment groups were treated by diet intervention combined with the limit swim method.The general condition and spleen qi deficiency syndrome were assessed on day 15.After the success of the model，the normal and model groups were treated with a conventional feeding method combined with normal saline，and the treatment group was treated by diet intervention combined with a decoction to nourish qi and invigorate the spleen for 9 weeks.The activity of two mitochondrial respiratory chain enzyme complexes was observed.ResultsThe activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexⅡand complexⅣin the model group was significantly lower than the activity in the normal and treatment groups（P＜0.05）.The activity levels of complexⅡand complexⅣwere significantly different between the model group and the treatment group（P＜0.05）.ConclusionSpleen qi deficiency can cause decreased activity of mitochondrial respiratory chain enzyme complexes in myocardial cells.The decoction to nourish qi and invigorate the spleen can modulate the activity of myocardial mitochondrial respiratory chain enzyme complexesⅡandⅣ.

nourishing qi to invigorate spleen；spleen qi deficiency；mitochondria；respiratory chain enzyme complex

R541

A

0258-4646（2017）06-0515-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.008

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究一般項(xiàng)目（L2014365）作者簡介：李思琦（1983-），女，主治醫(yī)師，碩士研究生.

王鳳榮，E-mail：wfr925@126.com

2017-01-08

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