多發(fā)性骨髓瘤不同分期患者中IL—6/IL—27的表達(dá)及臨床意義

關(guān)建民++楊書環(huán)++劉翠紅++張清德++夏天

摘要：目的 研究探討IL-27在多發(fā)性骨髓瘤（MM）不同分期患者中的表達(dá)情況，探討其意義。方法 采用ELISA 檢測(cè)MM患者及正常對(duì)照組血漿中IL-6及IL-27水平。結(jié)果 MM D-S I期患者血漿IL-27水平為（51.82±6.01）pg/ml，IL-6水平為（40.02±1.14）pg/ml，II期患者血漿IL-27水平為（55.92±5.31）pg/ml，IL-6水平為（46.99±1.01）pg/ml，III期患者IL-27水平為（60.09±8.01）pg/ml，IL-6水平為（50.54±1.98）pg/ml，明顯高于正常對(duì)照組[IL-27（8.29±4.41）pg/ml，IL-6（2.08±0.18）pg/ml]（P<0.05），組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 多發(fā)性骨髓瘤患者隨著病情進(jìn)展，IL-6/IL-27表達(dá)均增高，提示IL-6/IL-27可能與疾病進(jìn)展有關(guān)，提示了不良預(yù)后。

關(guān)鍵詞：IL-27；多發(fā)性骨髓瘤；發(fā)病機(jī)制

Expression of IL-6/IL-27 in Patients with Multiple Myeloma and its Clinical Significance

GUAN Jian-min1，YANG Shu-huan2，LIU Cui-hong2，ZHANG Qing-de1，XIA Tian2

（1.Heze Medical College，Heze 274000，Shandong，China；

2.Department of Hematology，Heze Municipal Hospital，Heze 274000，Shandong，China）

Abstract：Objective To investigate the expression of IL-27 in patients with multiple myeloma（MM）in different stages，and to explore its significance. Methods The levels of IL-6 and IL-27 in plasma of MM patients and normal controls were detected by ELISA.Results The level of serum IL-27 in patients with MM D-S I for a period of（51.82±6.01）pg/ml，IL-6（level 40.02±1.14）pg/ml，the plasma IL-27 level in patients with stage II（55.92±5.31） pg/ml，IL-6 level（46.99±1.01）pg/ml，IL-27 levels in patients with stage III（60.09±8.01）pg/ml，IL-6 level（50.54±1.98）pg/ml，significantly higher than the normal control group[IL-27（8.29±4.41）pg/ml，IL-6（2.08±0.18）pg/ml]（P<0.05），comparison between groups was statistically significant.Conclusion The patients with multiple myeloma as the disease progresses，the expression of IL-6/IL-27 was increased，suggesting that IL-6/IL-27 may be associated with disease progression，suggesting a poor prognosis.

Key words：IL-27；Multiple myeloma；Pathogenesis

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞性腫瘤，以骨髓中漿細(xì)胞惡性克隆性增生并分泌單克隆免疫球蛋白（M 蛋白）造成骨質(zhì)損害為主要特征。既往研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，IL-6細(xì)胞因子家族對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均起到較為重要的作用。IL-27是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的IL-6/IL-12細(xì)胞因子家族成員，其在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中的作用亦逐漸受到重視[3]。目前關(guān)于IL-27在多發(fā)性骨髓瘤患者中表達(dá)情況說(shuō)法不一，本研究旨在檢測(cè)不同分期狀態(tài)下多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)IL-6/IL-27表達(dá)情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 50例MM患者為2012年3月～2016年2月在菏澤市立醫(yī)院、菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院住院的患者，所有患者均符合國(guó)內(nèi)MM診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中男36例，女14例，中位年齡62（40～79）歲。臨床分期：DS I期15例，II期20例，III期15例。標(biāo)本采集時(shí)患者均不存在急、慢性感染性疾病及自身免疫性疾病等。

1.2方法 統(tǒng)一應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)MM患者外周血血漿中IL-6/IL-27水平?；颊叽_診后于化療前清晨、空腹采集外周靜脈血2～3 ml，肝素抗凝，6 h內(nèi)室溫下2000 rpm/min離心10 min，吸取血漿，分裝后儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱備用。

1.3實(shí)驗(yàn)原理 用純化的IL-6/IL-27抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被單抗的微孔中依次加入IL-6/IL-27，再與HRP標(biāo)記的IL-6/IL-27抗原結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-6/IL-27呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-6/IL-27濃度。具體流程如下：①加樣：分別設(shè)待測(cè)樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。②溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。③配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。④洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)2～3次，拍干。⑤加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl。⑥溫育：操作同②。⑦洗滌：操作同④。⑧顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。⑨終止：每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。⑩測(cè)定：以450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。健康對(duì)照組：方法同上，確定無(wú)合并急、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等。

1.4試劑 IL-6水平檢測(cè)采用北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的雙抗體方法試劑（Sheep interleukin 6，IL-6 ELISA KIT），規(guī)格96T/盒。IL-27水平檢測(cè)采用上海博研生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑（human Interleukin 27，IL-27 Elisa KIT），規(guī)格，48T/盒 。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)用（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MM D-S I期患者血漿IL-27水平為（51.82±6.01）pg/ml，II期患者血漿IL-27水平為（55.92±5.31）pg/ml，III期患者IL-27水平為（60.09±8.01）pg/ml，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），明顯高于正常對(duì)照組[（8.29±4.41）pg/ml]（P<0.05）。我們以IL-6為陽(yáng)性對(duì)照，D-S I期MM患者血漿IL-6水平為（40.02±1.14）pg/ml，II期MM患者血漿IL-6水平為（46.99±1.01）pg/ml，III期MM患者血漿IL-6水平為（50.54±1.98）pg/m，明顯高于較正常對(duì)照組[（2.08±0.18）pg/ml]（P<0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一類惡性克隆性漿細(xì)胞疾病，在血液系統(tǒng)腫瘤性疾病里預(yù)后較差，應(yīng)用化學(xué)治療的療效欠佳，近年來(lái)新型藥物的應(yīng)用及自體干細(xì)胞移植等新方法使MM的疾病緩解率有所提高。細(xì)胞因子在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，重組細(xì)胞因子已成為目前生物治療中一種重要的治療制劑，目前IL-2及IL-11等細(xì)胞因子已獲準(zhǔn)用于疾病治療，一些細(xì)胞因子（如IL-12、IFN、TNF）應(yīng)用于抗腫瘤治療已經(jīng)取得一定的效果。IL-12可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞，CTL及NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ進(jìn)而發(fā)揮強(qiáng)大抗腫瘤作用[5]，而嚴(yán)重的副作用限制了IL-12的臨床應(yīng)用。在多發(fā)性骨髓瘤患者中，IL-6是骨髓瘤細(xì)胞生存生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，在疾病進(jìn)程中，骨髓瘤細(xì)胞以及骨髓基質(zhì)細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等可以同過(guò)自分泌以及旁分泌的形式分泌IL-6，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并阻礙細(xì)胞凋亡。多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞還可以通過(guò)持續(xù)的IL-6的生成，以抵抗化療藥物誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡作用。我們的研究可以看出，多發(fā)性骨髓瘤患者IL-6的水平中位值在不同分期患者有所不同，分別Ⅰ期約（40.02±1.14）pg/ml，Ⅱ期約（46.99±1.01）pg/ml，Ⅲ期約（50.54±1.98）pg/ml，均明顯高于正常對(duì)照組患者。本研究顯示，IL-6的水平與疾病分期相關(guān)，因此IL-6水平可作為評(píng)價(jià)患者預(yù)后的重要指標(biāo)。體外研究證明[6]，多發(fā)性骨髓瘤患者的成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞，可促進(jìn)IL-6的大量分泌，而IL-6可反饋性的促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖以及增強(qiáng)骨髓瘤細(xì)胞抗凋亡作用。我們期望進(jìn)一步探討IL-6在多發(fā)性骨髓瘤中的分泌及作用機(jī)制的研究，從而為多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療提供更多理論依據(jù)，同時(shí)多發(fā)性骨髓瘤患者血清IL-6檢測(cè)標(biāo)本取材比較方便、價(jià)格便宜，作為多發(fā)性骨髓瘤患者的常規(guī)血清檢查，能幫助有效提示患者的病情及預(yù)后，為臨床治療提供更多的選擇。

IL-27作為一種新發(fā)現(xiàn)的IL-6/IL-12家族的細(xì)胞因子，是一種由p28和Ebi3組成異源二聚體的新型白介素，它能作用于活化的NK細(xì)胞和T細(xì)胞，并增強(qiáng)IL-12介導(dǎo)IFN-Y的產(chǎn)生，其抗腫瘤作用是目前所關(guān)注的焦點(diǎn)。與其他細(xì)胞因子一樣，IL-27也與腫瘤息息相關(guān)，尤其是人類急性髓系白血病，可直接抑制腫瘤細(xì)胞。IL-27抗腫瘤作用已經(jīng)在多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫阶C實(shí)，經(jīng)過(guò)IL-27刺激的腫瘤細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中形成的腫瘤，體積明顯縮小，并發(fā)現(xiàn)IL-27的抗腫瘤作用主要依賴于有特異性殺傷作用的CD8+T細(xì)胞（CTL）和體內(nèi)其他細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ[7-9]。糖蛋白130（glucoprotein130，gp130）是IL-6 和IL-27受體系統(tǒng)的共享信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白β 鏈，屬細(xì)胞因子受體超家族的成員，信號(hào)傳遞鏈gp130 激活是骨髓瘤細(xì)胞異常增殖的重要信號(hào)，主要通過(guò)gp130 而促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖[10-11]。MM作為一種漿細(xì)胞惡性腫瘤，IL-27在其發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注[12]。有不同學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[13]，給小鼠采用兩種不同的方法注射兩種不同的MM細(xì)胞系，重組人IL-27可顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)，原代MM細(xì)胞表面表達(dá)功能性的IL-27受體，IL-27通過(guò)抑制血管新生顯著抑制原代MM細(xì)胞和MM系生長(zhǎng)，從骨髓瘤患者分選出來(lái)的破骨祖細(xì)胞亦顯著表達(dá)IL-27受體，在體外IL-27可直接抑制破骨細(xì)胞分化和溶骨活性[14]。目前尚無(wú)太多關(guān)于IL-27在不同分期MM患者體內(nèi)表達(dá)分泌的報(bào)道，且說(shuō)法不一，因此我們檢測(cè)了不同分期MM患者中IL-27的表達(dá)情況，結(jié)果顯示MM患者IL-27表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，且隨著疾病進(jìn)展，IL-27表達(dá)增高，我們認(rèn)為，IL-27在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病中可能發(fā)揮著促進(jìn)MM細(xì)胞增殖、血管新生和破骨細(xì)胞活性。IL-27與IL-6在不同時(shí)期的MM患者中同樣高表達(dá)，共享同一受體亞單位gp130，發(fā)揮著相同的作用，我們期望進(jìn)一步探討IL-27在MM中的分泌及作用機(jī)制的研究，從而為為MM的臨床治療提供有關(guān)IL-27的更多理論依據(jù)，也為MM的臨床治療提供更多的選擇。

參考文獻(xiàn)：

[[1]李玲.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病危險(xiǎn)因素淺析[J].河南中醫(yī)， 2014，34（7）：1262-1263.

[2]Sanmiguel J，Bladé J，Shpilberg O，et al.Phase 2 randomized study of bortezomib-melphalan-prednisone with or without siltuximab（anti-IL-6） in multiple myeloma[J].Blood，2014，124（7）：1201-1201.

[3]Anna P，Tzimoula K.Cytokines in human leptospirosis[J].Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine&Hygiene，2015，109（12）：749.

[4]張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版.北京：科學(xué)出版社，2007：382-385.

[5]Li F，Xie X，Li S，et al.Interleukin-6 gene-174GC polymorphism and bronchial asthma risk：a meta-analysis[J].International Journal of Clinical &Experimental Medicine，2015，8（8）：12601-12608.

[6]劉晉瑋，魏秀珍，李欣，等.多發(fā)性骨髓瘤患者血清可溶性白細(xì)胞介素-6受體水平的臨床意義[J].國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，2014，37（2）：102-105.

[7]Tormo A J，Meliani Y，Beaupré L A，et al.The composite cytokine p28 cytokine-like factor 1 sustains B cell proliferation and promotes plasma cell differentiation[J].Journal of Immunology，2013，191（4）：1657-1665.

[8]Han X，Zhou D B，Duan M H，et al.CEBPα in Multiple Myeloma Patients May Lead to Increased Hepcidin[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2014，22（5）：1316-1320.

[9]Shinozaki Y，Wang S，Miyazaki Y，et al.Tumor-specific cytotoxic T cell generation and dendritic cell function are differentially regulated by interleukin 27 during development of anti-tumor immunity[J].International Journal of Cancer，2009，124（6）：1372-1378.

[10]Xia T，Li J P，Li W Q，et al.Expression of IL-27 in multiple myeloma and its cell lines[J].Zhonghua xue ye xue za zhi，2013，34（7）：626-628.

[11]夏天，李建平，李文倩，等.gp130細(xì)胞因子家族在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展[J].國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，2012，35（5）：437-441.

[12]李瑛，李軍.多發(fā)性骨髓瘤患者血清中IL-6與IL-27水平監(jiān)測(cè)的臨床應(yīng)用[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，31（4）：87-89.

[13]黃艷平，黃錦雄，韋夙，等.白介素-27在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及其臨床意義[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，32（3）：388-390.

[14]Cocco C，Giuliani N，Di C E，et al.Interleukin-27 acts as multifunctional antitumor agent in multiple myeloma[J].Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research， 2010，16（16）：4188.

編輯/成森