響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取柚葉多酚工藝及其抗氧化研究

陳建福

（漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000）

響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶提取柚葉多酚工藝及其抗氧化研究

陳建福

（漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物工程系，福建 漳州 363000）

采用纖維素酶輔助對(duì)柚葉中的多酚進(jìn)行提取，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對(duì)影響柚葉多酚提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了酶解時(shí)間、酶用量、pH、酶解溫度四因子與多酚提取率的二次多項(xiàng)式模型，并考察了其抗氧化性能。結(jié)果表明，纖維酶輔助提取柚葉多酚的最佳工藝條件為：酶解時(shí)間80 min，酶用量200 U、pH5.8、酶解溫度49℃。在此條件下柚葉多酚的提取率為35.90 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為0.582%，驗(yàn)證了回歸方程的有效性，說明響應(yīng)面模型可以較好地預(yù)測(cè)柚葉多酚的提取率，該工藝與無酶預(yù)處理的超聲輔助提取工藝相比，提取率提高了23.20%，柚葉多酚對(duì)羥自由基有一定的清除能力，并能與維生素C起協(xié)同作用。

柚葉；多酚；纖維素酶；響應(yīng)面，抗氧化

柚子，又名文旦、內(nèi)紫等，是蕓香科植物柚的成熟水果，在我國(guó)福建、廣東、廣西、湖南等14個(gè)省區(qū)均有分布[1-2]。柚子營(yíng)養(yǎng)豐富，具有豐富的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)及其他一些人體所需要的微量元素，越來越受到了人們的歡迎[3-4]。漳州是琯溪蜜柚的主產(chǎn)地，隨著蜜柚產(chǎn)量的增加，每年由于蜜柚摘取后剩下的柚葉也在逐年增加，柚葉中含有大量的多酚類等天然有效成分，因此常具有抗衰老、抗炎、抗菌、凈化空氣等功效[5-6]，被用來制作成沐浴露、塔香、洗發(fā)水、洗手液、隔離防護(hù)霜，然而由于加工技術(shù)的落后，在果農(nóng)摘完琯溪蜜柚后，沒有對(duì)柚葉深加工，造成了極大的浪費(fèi)。

本實(shí)驗(yàn)在超聲波輔助提取柚葉多酚的基礎(chǔ)上，用纖維素酶對(duì)柚葉進(jìn)行預(yù)處理，使纖維素酶分解柚葉細(xì)胞壁上的纖維素，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部的多酚類物質(zhì)更大容量地溶出，考察纖維素酶預(yù)處理對(duì)柚葉多酚提取率的影響；并通過響應(yīng)面法對(duì)影響柚葉多酚纖維素酶預(yù)處理的工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，研究其對(duì)羥基自由基的清除作用，為柚葉多酚的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱GZX-9070MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；冷凍干燥機(jī)LGJ10-C，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；電子天平BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)SCQ-3201E，上海聲彥超聲波有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-1800PC-DS2，上海美譜達(dá)儀器有限公司；高速多功能粉碎機(jī)Q-250B，上海冰都電器有限公司。

柚葉，采于漳州市平和縣的琯溪蜜柚；纖維素酶（10000 U·g-1），食品級(jí)，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；食用酒精（乙醇），食品醫(yī)藥級(jí)，河南浩宇食品添加劑有限公司；硫酸鋰，分析純，西隴化工股份有限公司；鎢酸鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸，分析純，天津市瑞金物化學(xué)品有限公司，鉬酸鈉，分析純，天津市化學(xué)試劑四廠；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法[7]，配制0.1 mg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確移取一定濃度梯度（0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2 mL）的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到10 mL容量瓶中，再分別加入6 mL的蒸餾水與0.5 mL的福林-酚試劑，搖勻，1 min后再分別加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，定容，并置于75℃水浴中10 min，冷卻，于765 nm處測(cè)定吸光度，繪制曲線，并進(jìn)行回歸，得回歸方程。用上述方法進(jìn)行測(cè)定并代入回歸方程計(jì)算得到

其中：b為柚葉多酚質(zhì)量濃度/mg·mL-1；V為提取液定容后的體積/mL；m為柚葉質(zhì)量/g。

1.2.2 超聲波輔助提取方法

將采摘的柚葉用清水浸泡洗凈，再用蒸餾水淋洗，晾干，并用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，粉碎，過篩備用。提取時(shí)，稱取一定量的柚葉粉末，裝入100 mL燒瓶中，置于超聲波清洗器中，在設(shè)定的操作條件下進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，過濾去渣，稀釋，定容，按1.2.1中的方法計(jì)算柚葉多酚的提取率。通過響應(yīng)面方法對(duì)超聲波輔助提取柚葉多酚的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了最佳工藝條件為：超聲溫度63℃、超聲功率245 W、液料比25 mL·g-1、超聲時(shí)間28min、乙醇濃度60%，柚葉多酚提取率為29.14 mg·g-1，并以此超聲輔助提取柚葉多酚的最佳工藝條件作為柚葉酶處理后的提取工藝。

1.2.3 纖維素輔助提取柚葉多酚

利用纖維素酶對(duì)柚葉進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理完后，在最佳的超聲工藝條件下，對(duì)柚葉多酚進(jìn)行提取，并計(jì)算得到柚葉多酚的提取率，酶解工藝如下：

1.2.3.1 酶解時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

固定酶用量200 U、pH5.5、酶解溫度50℃的條件下，考察不同酶解時(shí)間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min）對(duì)柚葉多酚提取率的影響。

1.2.3.2 酶用量對(duì)多酚提取率的影響

在固定酶解時(shí)間80 min、pH 5.5、酶解溫度50℃的條件下，考察不同酶用量（50 U、100 U、150 U、200 U、250 U、300 U）對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.3.3 pH對(duì)多酚提取率的影響

固定酶解時(shí)間80 min、酶用量200 U、酶解溫度50℃的條件下，考察不同pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 、6.5）對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.3.4 酶解溫度對(duì)多酚提取率的影響

固定酶解時(shí)間80 min、酶用量200 U、pH 5.5的條件下，考察不同酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）對(duì)多酚提取率的影響。

1.2.4 抗氧化能力研究

利用對(duì)羥自由基的清除能力來評(píng)價(jià)多酚的抗氧化能力，羥自由的清除能力按文獻(xiàn)[8]方法所示。

1.3 響應(yīng)面的因素與水平設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酶解時(shí)間（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）四因素為自變量，柚葉多酚提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

從圖1中可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間在20～80 min時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚提取率不斷增大，當(dāng)酶解時(shí)間超過80 min時(shí)，多酚提取率又開始下降。這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的作用時(shí)間長(zhǎng)，酶活力得到充分體現(xiàn)，酶解反應(yīng)進(jìn)行越來越徹底，多酚提取率增加，而當(dāng)酶解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，酶解作用效果不再明顯，多酚提取率甚至開始下降[9]，因此，最佳的酶解時(shí)間選擇為80 min。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

2.1.2 酶用量對(duì)多酚提取率的影響

圖2 酶用量對(duì)多酚提取率的影響

從圖2中可以看出，當(dāng)酶用量的在50～200 U時(shí)，隨著酶用量的增加，多酚提取率不斷增大，當(dāng)酶用量超過200 U時(shí)，多酚提取率又開始下降。這是因?yàn)殡S著酶用量的增加，纖維素酶與柚葉顆粒的作用點(diǎn)越來越多，增加了酶解速率，提高了多酚的溶出，當(dāng)酶用量過大時(shí)，過多的酶會(huì)堆積而包裹住柚葉顆粒，阻礙多酚的傳質(zhì)[10]。因此，最佳的酶用量選擇為200 U。

2.1.3 pH對(duì)多酚提取率的影響

從圖3中可以看出，當(dāng)pH在4.0～5.5時(shí)，隨著pH的上升，多酚提取率不斷增加，當(dāng)pH超過5.5時(shí)，多酚提取率又開始下降。這是因?yàn)閜H較低時(shí)，酸性太強(qiáng)會(huì)影響纖維素酶的構(gòu)象，從而影響酶的活力，而當(dāng)pH過大時(shí)，酸性較低，破壞了酶空間結(jié)構(gòu)中的共價(jià)健作用，而使酶變性，導(dǎo)致多酚提取率下降[11]，因此，最佳的pH選擇為5.5。

圖3 pH對(duì)多酚提取率的影響

2.1.4 酶解溫度對(duì)多酚提取率的影響

從圖4中可以看出，當(dāng)酶解溫度在40～50℃時(shí)，隨著酶解溫度的升高，多酚提取率不斷增加，當(dāng)酶解溫度超過50℃時(shí)，多酚提取率又開始下降，這是因?yàn)槊附鉁囟容^低時(shí)，酶促反應(yīng)較慢，隨著酶解溫度的升高，酶的反應(yīng)速率增加，增加了纖維素酶與柚葉顆粒細(xì)胞壁的作用頻率，多酚提取率增大，而當(dāng)酶解溫度過高時(shí)，酶活力減弱，甚至?xí)l(fā)生酶失活而喪失催能力，使得多酚提取率的下降[12]，因此，最佳的酶解溫度選擇為50℃。

圖4 酶解溫度對(duì)多酚提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化柚葉多酚提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析及結(jié)果

根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以柚葉多酚提取率（Y）為響應(yīng)值，酶解時(shí)間（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）為自變量，通過，Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析如表2、表3所示。

表2 響應(yīng)面方案及結(jié)果

表3 方差分析

利用Design-Expert 8.05b統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到柚葉多酚提取率（Y）與酶解時(shí)間（A）、酶用量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）的二次多項(xiàng)回歸方程：

由表3可知，該回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1753＞0.05），相關(guān)系數(shù)R2= 0.9147，說明有超過91%的數(shù)據(jù)可用利用該模型進(jìn)行分析，方程擬合較好；一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB、AC、BC、BD、CD對(duì)柚葉多酚提取率影響不顯著（P＞0.05）；一次項(xiàng)C、D，交互項(xiàng)AD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)柚葉多酚提取率影響極顯著（P＜0.01）；根據(jù)F值及P值均可判斷，各因素對(duì)柚葉多酚提取率影響作用順序?yàn)椋簆H＞酶解溫度＞酶用量＞酶解時(shí)間。

2.2.2 因素間的相互作用分析

圖5 酶解各因素交互作用對(duì)多酚提取率的影響

圖5 是纖維素酶對(duì)柚葉預(yù)處理過程的各工藝條件對(duì)柚葉多酚提取率的響應(yīng)面圖。圖中描述的是所考察的四個(gè)工藝條件中任意兩個(gè)因素為零水平時(shí)，另兩個(gè)工藝條件的交互作用對(duì)柚葉多酚提取率的影響。從圖5中可以看出，酶解時(shí)間和酶解溫度的響應(yīng)面曲線較陡，說明酶用量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)柚葉多酚的提取率影響最為顯著，酶解時(shí)間和pH的響應(yīng)面曲線相對(duì)較陡，說明酶解時(shí)間和pH的交互作用對(duì)柚葉多酚的影響顯著性次之，而pH和酶解溫度的響應(yīng)面曲線最為平緩，說明pH和酶解溫度的交互作用對(duì)柚葉多酚的影響最不顯著。綜合以上分析可得，影響纖維素酶輔助提取柚葉多酚提取率的主次因素順序?yàn)閜H＞酶解溫度＞酶用量＞酶解時(shí)間。

2.2.3 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證

通過回歸方程進(jìn)行預(yù)測(cè)得到纖維素酶輔助提取柚葉多酚的最佳條件為：酶解時(shí)間80.03 min，酶用量201.29 U、pH 5.76、酶解溫度49.38℃，在此最佳條件下，回歸方程預(yù)測(cè)的最大柚葉多酚提取率為36.11 mg·g-1。為實(shí)際操作的便利性，將預(yù)測(cè)的最佳工藝條件修正為：酶解時(shí)間80 min，酶用量200 U、pH 5.8、酶解溫度49℃。在此最佳條件下對(duì)柚葉多酚進(jìn)行提取，提取3次進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，柚葉多酚的平均提取率為35.90 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為0.582%，驗(yàn)證了回歸方程的有效性，說明利用響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶輔助提取柚葉多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化是可靠的，具有一定的應(yīng)用價(jià)值，且該工藝與沒有進(jìn)行酶預(yù)處理的超聲波輔助工藝相比[13]，提取率提高了23.20%，為柚葉多酚的開發(fā)與利用提供新的依據(jù)。

2.3 柚葉多酚的抗氧化能力

羥基自由基是引發(fā)各種疾病的一種強(qiáng)活性自由基，以柚葉多酚對(duì)羥自由基的清除率來考察其抗氧化性能，如圖6所示。從圖6中可以看出，柚葉多酚和維生素C對(duì)羥基自由基均有一定的清除能力，并隨著柚葉多酚和維生素C濃度的增加而增大，在相同濃度下，維生素C對(duì)羥自由基的清除率能力要強(qiáng)于柚葉多酚。但當(dāng)柚葉多酚與維生素C混合時(shí)（質(zhì)量1∶1混合），在一定濃度時(shí)，柚葉多酚會(huì)與維生素C產(chǎn)生協(xié)同作用，而使得其混合物具有較高的羥基自由基清除能力。

圖6 柚葉多酚和維生素C對(duì)·OH的清除能力

3 結(jié)論

以柚葉為原料，采用纖維素酶對(duì)柚葉中的多酚進(jìn)行輔助提取，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)影響柚葉多酚提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了二次多項(xiàng)式方程，并確定了最佳工藝條件為：酶解時(shí)間80 min，酶用量200 U，pH 5.8，酶解溫度49℃。在最佳工藝條件下，柚葉多酚的提取率為35.90 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為0.582%，驗(yàn)證了回歸方程的有效性，說明利用響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶輔助提取柚葉多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化是可靠的，具有一定的應(yīng)用價(jià)值，且該工藝與沒有進(jìn)行酶預(yù)處理的超聲波輔助工藝相比，提取率提高了23.20%，柚葉多酚對(duì)羥基自由基有一定的清除能力，并能夠與維生素C產(chǎn)生協(xié)同作用，為柚葉多酚抗氧劑的開發(fā)與利用提供新的依據(jù)。

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Optimization of Cellulose-assisted Extraction of Polyphenols from Pomelo Leaves Using Response Surface Methodology and its Antioxidant Activities

CHEN Jiɑnfu

（School of Food and Biological Engineering，Zhangzhou Institute of Technology，Zhangzhou Fujian 363000，China）

Polyphenols were extracted from pomelo leaves by cellulose-assisted extraction.Based on the single-factor experiment，the involving factors was optimized by using response surface analysis and a quadratic polynomial regression equation was established for the yield of polyphenols as function of enzymolysis time，enzyme amount，pH and enzymolysis temperature and antioxidant activities were examined.The results showed that the optimal extraction conditions of polyphenols from pomelo leaves were：enzymolysis time 80 min，enzyme amount 200U，pH 5.8，enzymolysis temperature 49℃.The yield of total flavonoids could be up to 35.90 mg·g-1under the optimal extraction condition，the relative error was 0.582%compared to the predictive value，which indicated the feasible model fitted well with the experimental data.Results showed that the response surface model could be used to predict the extraction yield of polyphenol from pomelo leaves.The extraction yield increased by 23.20%compared to ultrasonic assisted extraction technology with no enzyme pretreatment and it had good free radicals scavenging activity and synergy with vitamin C.

Pomelo Leaves；Polyphenols；Cellulose；Response Surface Methodology；Antioxidant Activities

Q55；S38

A

1009-8666（2017）04-0011-07

10.16069/j.cnki.51-1610/g4.2017.04.003

［責(zé)任編輯、校對(duì)：李書華］

2017-01-03

福建省高校杰出青年科研人才培育計(jì)劃（閩教科[2015]54號(hào)）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目計(jì)劃“柚葉多酚的分離及性能研究”（JA15688）

陳建福（1982—），男，福建南安人。漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)工藝。