小滴法精子冷凍在流程化治療無精子癥中的應(yīng)用體會

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.09.086

[摘要] 目的 探討小滴法精子冷凍在流程化治療無精子癥的臨床效果及相關(guān)治療措施。 方法 方便選取該院2009年1月—2014年12月接受小滴法精子冷凍技術(shù)不育男性180例開展回顧性分析，按WH05人類精液檢查與處理實驗手冊要術(shù)進行精液檢查后，梗阻性無精子癥患者120例，非梗阻性無精子癥患者60例；另選取40例取精困難不育男性正常精液按此方法冷凍（對照組），統(tǒng)計、分析精液常規(guī)正常的40例取精困難不育患者、120例梗阻性無精子癥患者、60例非梗阻性無精子癥患者精子復(fù)蘇率、妊娠率。 結(jié)果 對照組中40例取精困難不育患者中解凍40例，精子的復(fù)蘇率均大于60%，其中18例獲得女方妊娠（18/40）妊娠率45%；梗阻性無精子癥120例中解凍30例，獲得女方妊娠 12例（12/30）妊娠率40%；非梗阻性無精子癥60例解凍25例獲得女方妊娠10例（10/25）妊娠率40%。 結(jié)論 小滴法精子冷凍在流程化治療無精子癥中的應(yīng)用效果較好，同時由于每次凍存的最小冷凍液體劑量僅為20μL，載體為目前成熟的商品化載體，技術(shù)操作簡單、價格相對低廉，具有臨床推廣應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞] 小滴法精子冷凍；流程化治療；無精子癥

[中圖分類號] R69 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）03（c）-0086-03

Application Experience of Droplet Sperm Cryopreservation in the Processed Treatment of Azoospermia

HU Hao-rui

Assisted Reproductive Department， Guiyang Maternity and Child Health Care Hospital， Guiyang， Guizhou Province， 550002 China

[Abstract] Objective To discuss the clinical effect of droplet sperm cryopreservation in the processed treatment of azoospermia and related treatment experience. Methods 180 cases of infertile males receiving the droplet sperm cryopreservation from January 2009 to December 2014 were convenient selection retrospectively analyzed and WH05 human semen examination showed that there were 120 cases of patients with obstructive azoospermia and 60 cases of patients with non-obstructive azoospermia， and the normal semen of 40 cases of infertile males with semen procurement difficulty were selected as the control group， and the recovery rate and pregnant rate of the three groups were counted and analyzed. Results In the control group， the sperm of 40 cases unfreezed， and the recovery rate of sperms was more than 60%， and 18 cases obtained pregnancy （18/40） and pregnancy rate was 45%， in the 120 cases with obstructive azoospermia， the sperms of 30 cases unfreezed， and 12 cases obtained pregnancy，（12/30） and the pregnancy rate was 40%， and in the 60 cases of patients with non- obstructive azoospermia， the sperms of 25 cases unfreezed， and 10 cases obtained pregnancy and the pregnant rate was 40% （10/25）. Conclusion The application effect of droplet sperm cryopreservation in the processed treatment of azoospermia is better， at the same time， the minimum freezing liquid dosage is only 20μL and the carrier is the mature commercialization carrier， and the technical operation is simple and the price is relatively low， which is worth clinical promotion and application.

[Key words] Droplet sperm cryopreservation； Processed treatment； Azoospermia

據(jù)調(diào)查，工業(yè)化國家中生育年齡夫婦中，罹換不育癥的人群比例達(dá)到10%～15%[1]。其中，單獨的男、女性因素各為35%，其余30%屬于是共同因素[2]。在不育男性中，無精子癥占比達(dá)到5%～20%；在普通人群中，無精子癥占比則為2%[3]。無精子癥中，非梗阻性無精子癥占71%，其中34%為唯支持細(xì)胞綜合征，9%為克氏綜合征，9%為精子成熟阻滯，5%為Y染色體微缺失，4%為隱睪癥，4%為外傷，4%為外源性雄激素補充，4%為遺傳因素等；梗阻性無精子癥占29%[4]?；谝陨喜煌臒o精子癥病因，有不同的處理方式。但規(guī)范化的治療，以給男性一個機會，尤其是非梗阻性無精子癥患者的精子保存技術(shù)進展，將對這部分人群的生育力保存給出一個好的解決答案。在目前由作者提出的流程化治療方案[5]中，作為玻璃化冷凍的小滴法精子冷凍技術(shù)目前是該院的主要冷凍方式之一。為了探討小滴法精子冷凍在流程化治療無精子癥的臨床效果，該研究方便選取了該院2009年1月—2014年12月接受小滴法精子冷凍技術(shù)的無精子癥患者180例為研究對象，將其與另外接受小滴法精子冷凍技術(shù)的40例取精困難不育男性的精子復(fù)蘇率、妊娠率進行對比分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析該院接受小滴法精子冷凍技術(shù)不育男性180例，平均年齡（34.10±5.14）歲，療程平均（6.1±3.2）年。所有患者均按WHO人類精液檢查與處理實驗手冊要術(shù)進行精液檢查后，診斷為梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥。其中梗阻性無精子癥120例，非梗阻性無精子癥60例，排除因勃起功能障礙、不射精、逆行射精癥的不育男性。另有40例取精困難不育男性正常精液按此方法冷凍。

1.2 診療流程

不育男性診療流程[5]如下（圖1）：①按照WHO人類精液處理和檢驗實驗手冊第5版，連續(xù)3次精液處理后未見精子；②若是診斷為梗阻性無精子癥，則予以手術(shù)治療或是人類輔助生殖技術(shù)；③若是診斷為特發(fā)性無精子癥，則予以藥物治療（不建議不治療或是直接采取AID等他精法助孕）。當(dāng)藥物治療無效的情況下，采取AID等他精法助孕；藥物治療有效，再次進行睪丸活檢發(fā)現(xiàn)精子或是在精液中發(fā)現(xiàn)精子，此時予以精子凍存并擬行人類輔助生殖技術(shù)助孕。

1.3 方法

將梗阻性無精子癥與非梗阻性無精子癥患者（治療后獲得極少量精子的）的附睪液或睪丸組織提取物予250 g離心力離心取沉淀備用。將取精困難不育男性精液以percoll液40%上層液面、80%下層液面250 g離心力20 min密度梯度離心并精子洗滌劑洗滌后備用。將兩組精子分別與該院自配精子玻璃化冷凍試劑按1：1混勻靜置5 min后置于冷凍盒上方液氮液平面上20 cm處約1 min，按20 μL/滴滴入液氮。精子冰滴墜入冷凍盒中大皿內(nèi)收集后無菌鑷鑷取移入冷凍管中保存。所有操作中物品及液氮均為一人一器，冷凍管半浸入液氮后冰滴存入后封口干式保存以減少可能得保存罐中液氮流入的污染。同時也為取出解凍時鑒別是否有氮液流入冷凍管中的風(fēng)險判斷。

1.4 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計、分析精液常規(guī)正常的40例取精困難不育患者、120例梗阻性無精子癥患者、60例非梗阻性無精子癥患者精子復(fù)蘇率、妊娠率。

2 結(jié)果

冷凍結(jié)果，作為對照的精液常規(guī)正常的40例取精困難不育患者中解凍40例，精子的復(fù)蘇率均大于60%，其中18例獲得女方妊娠（18/40）妊娠率45%。梗阻性無精子癥120例中解凍30例獲得女方妊娠 12例（12/30）妊娠率40%。非梗阻性無精子癥60例解凍25例獲得女方妊娠10例（10/25）妊娠率40%。

3 討論

無精子癥的病因復(fù)雜，其治療一直是泌尿男科學(xué)領(lǐng)域難題之一，臨床上尚無確切療法，臨床診療也存在諸多不規(guī)范的問題，如：檢查項目選擇不當(dāng)，以致于出現(xiàn)過度診斷治療的情況，這不僅會對患者身心造成傷害，更會給患者及其家庭帶來較大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，基于此，規(guī)范診療流程具有必要性[5]。

根據(jù)是否存在梗阻因素，可將無精子癥分為兩大類，一是梗阻性無精子癥；二是非梗阻性無精子癥。男性生育力保存，尤其是非梗阻性無精子癥患者男性生育力的保存是目前臨床治療中的一個非常重要的問題。在以往，非梗阻性無精子癥患者被認(rèn)為是無法治愈的，一般建議領(lǐng)養(yǎng)或是供精。自90年代以來，輔助生殖醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，為非梗阻性無精子癥患者治療提供了技術(shù)支持，通過外科取精技術(shù)即可由患者睪丸內(nèi)獲得精子，其后卵泡漿內(nèi)單精子注射技術(shù)實現(xiàn)女方妊娠。但是，從患者睪丸內(nèi)取精存在一定的失敗率，而反復(fù)睪丸外科活檢取精會對睪丸功能產(chǎn)生不利影響，根據(jù)Verheyen G等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，第一次睪丸活檢發(fā)現(xiàn)精子的患者中，30%在第二次活檢時無法找到精子?；诖?，對第一次活檢找到的睪丸精子予以冷凍保存十分必要。同時，對于非梗阻性無精子癥患者而言，稀少精子凍存也有利于減少其不必要的供精人工受精和供精體外受精-胚胎移植技術(shù)的實施。同時，卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的應(yīng)用，實現(xiàn)了臨床妊娠率、胚胎種植率的有效提升。2004年靳鐳等[7]用凍融PESA精子（經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)）進行ICSI獲得成功妊娠。

該研究中，選取了該院2009年1月—2014年12月接受小滴法精子冷凍技術(shù)不育男性180例開展回顧性分析，根據(jù)研究結(jié)果顯示梗阻性無精子癥120例中解凍30例獲得女方妊娠 12例（12/30）妊娠率40%。非梗阻性無精子癥60例解凍25例獲得女方妊娠10例（10/25）妊娠率40%，與前人研究相符，凍融精子予以ICSI是可行的。

由此提示，小滴法精子冷凍技術(shù)臨床應(yīng)用效果較好，一方面玻璃化冷凍無需使用冷凍保護劑，通過極高的凍融速率令精子細(xì)胞內(nèi)外液之間幾乎同步實現(xiàn)液態(tài)與玻璃態(tài)的轉(zhuǎn)換，精子細(xì)胞內(nèi)外不會產(chǎn)生冰晶，有效避免了機械性損傷、理化損傷的出現(xiàn)[8]；同時玻璃化精子冷凍時，每次凍存的最小冷凍液體劑量僅為20 μL，載體均為目前成熟的商品化載體，技術(shù)操作簡單。

4 結(jié)論

玻璃化精子冷凍液為作者自配，價格遠(yuǎn)較商品化試劑低廉。對于在西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)的人類輔助生殖技術(shù)機構(gòu)開展存在較適宜的條件，對于減輕西部經(jīng)濟收入較低家庭的負(fù)擔(dān)有益，值得臨床推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Singh K，Jaiswal D.Human male infertility： a complex multifactorial phentype[J].Reprod Sci，2011，18（5）： 418-425.

[2] Krausz.Male infertility： pathogenesis and clinical diagnosis[J].Best Pract Res ClinEndocrinoLMetab，2011，25（2）：271-285.

[3] Kolettis PN. The evaluation and management of the azoospermic patient[J].J Androl，2002，23（3）：293-305.

[4] Gudeman SR，Townsend B. Fischer K，et al.Etiology of azoospermic in a military population[J].J Urol，2015，193（4）： 1318-1321.

[5] 胡皓睿.200例無精子癥流程化診療體會[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015（4）： 85-86.

[6] Verheyen G， De C I， Tournaye H， et al. Comparison of four mechanical methods to retrieve spermatozoa from testicular tissue[J]. Human Reproduction， 1995， 10（11）：2956-2959.

[7] 靳鐳，王俊霞，朱桂金，等.凍融經(jīng)皮抽吸附睪精子卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射1例分娩報告[J].中華男科學(xué)雜志，2004， 10（3）：227-228.

[8] 葛斌，楊智敏，刁英，等.無保護劑玻璃化冷凍技術(shù)在凍存PESA精子中的實用性研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（1）：91-93.

（收稿日期：2016-12-25）