“重組DNA分子的模擬操作”實(shí)踐與反思

高小燕（廈門市集美中學(xué)，福建廈門361021）

“重組DNA分子的模擬操作”實(shí)踐與反思

高小燕
（廈門市集美中學(xué)，福建廈門361021）

將“重組DNA分子的模擬操作”實(shí)驗(yàn)與相關(guān)練習(xí)題有機(jī)結(jié)合，有利于促進(jìn)學(xué)生在操作、思考、討論的過程中建構(gòu)、理解與應(yīng)用生物學(xué)概念，提高探究能力與實(shí)踐能力，發(fā)展生物學(xué)核心素養(yǎng)。

重組DNA分子；模擬操作；探究能力

一、“重組DNA分子的模擬操作”內(nèi)容分析

“DNA重組技術(shù)的基本工具”一節(jié)主要介紹DNA重組技術(shù)的三種基本工具及其作用。DNA重組技術(shù)抽象，盡管教科書以類比的方式將DNA重組技術(shù)的三種基本工具形象化，如將限制性核酸內(nèi)切酶比喻成“手術(shù)刀”、將DNA連接酶比喻成手術(shù)時(shí)用到的縫合針、將基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體比喻成“分子運(yùn)輸車”，但相當(dāng)一部分學(xué)生還是難以將“酶”與其熟悉的“手術(shù)刀”相聯(lián)系，DNA重組技術(shù)的三種基本工具及其作用是學(xué)生學(xué)習(xí)的難點(diǎn)。

“重組DNA分子的模擬操作”將三種DNA重組工具具體化，使得學(xué)生認(rèn)識(shí)到剪刀代表的是限制酶EcoRI，它識(shí)別的序列是G-A-A-T-C序列，并且在G和A之間剪切開。當(dāng)學(xué)生用紅色透明膠或訂書釘時(shí)，知道只能連接被限制酶（剪刀）剪切的磷酸二酯鍵處，而不能去黏連氫鍵等。

二、“重組DNA分子的模擬操作”方法與結(jié)果

課前要求學(xué)生根據(jù)基因重組的原理，設(shè)計(jì)“重組DNA分子的模擬操作”所需要的材料與用具。學(xué)生選用紅色的兒童手工卡紙表示目的基因所在的DNA片段，以綠色手工卡紙表示環(huán)形質(zhì)粒載體，剪刀代表EcoRI限制酶，還有紅色膠布及訂書機(jī)等實(shí)驗(yàn)用具。

1.剪切。分組開展“重組DNA分子的模擬操作”實(shí)驗(yàn)。每組學(xué)生只能利用EcoRⅠ限制酶，且只能利用一種DNA連接酶。

學(xué)生先從綠色紙條的雙鏈DNA中分別選出EcoRI限制酶所識(shí)別的GAATTC序列。根據(jù)EcoRI限制酶的特性，在G-A之間用代表EcoRI限制酶的剪刀進(jìn)行“切割”獲得載體。由于限制酶切割的位點(diǎn)是磷酸二酯鍵，并沒有作用于氫鍵，此時(shí)學(xué)生會(huì)有疑問，為什么氫鍵也被“切割”了？教師應(yīng)當(dāng)進(jìn)行適時(shí)指導(dǎo)，指出用剪刀和限制酶的區(qū)別在于限制酶僅作用于磷酸二酯鍵，而剪刀實(shí)際將氫鍵也切割開了。

“切割”獲得綠色載體后，用同樣的方法將紅色紙條代表的DNA片段中的目的基因截取出來。此時(shí)，許多學(xué)生僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)EcoRI限制酶的識(shí)別序列，教師可提醒其思考，如果只“切割”一次，那么獲取的目的基因是哪段？如何與載體相連？同時(shí)，學(xué)生選擇教師提供的直線形或圓環(huán)形載體，并思考與討論載體切割后形成的DNA片段解決裁體有1個(gè)酶切位點(diǎn)或多個(gè)酶切位點(diǎn)等問題。

2.拼接。紅色、綠色兩種卡紙的切割位點(diǎn)全部切開后，學(xué)生根據(jù)所學(xué)的DNA連接酶相關(guān)知識(shí)，相同的黏性末端在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。用紅色膠布或訂書釘代表連接酶，完成一個(gè)重組DNA分子的模擬操作。并指導(dǎo)學(xué)生比較本組的拼接結(jié)果與其他組的結(jié)果，思考“為什么自己的拼接結(jié)果與其他組的不一樣？”分析原因，相互質(zhì)疑，促進(jìn)學(xué)生重新審視、正確認(rèn)識(shí)限制酶、DNA連接酶的特點(diǎn)。

3.模擬操作結(jié)果。①紅色、紅色相連接（如圖1），即目的基因與目的基因連接成環(huán)狀。②綠色、紅色相連接（如圖2、圖3），即目的基因與載體相連接。③綠色、綠色頭尾相連接（如圖4），即載體與載體相連接。

圖1 目的基因與目的基因環(huán)狀連接

圖2 目的基因與環(huán)狀載體連接

圖3 目的基因與載體連接

圖4 環(huán)狀載體與載體連接

此外，有的小組將目的基因或載體用“限制酶”酶切后，在原磷酸二酯鍵處重新連接。說明學(xué)生對(duì)限制酶作用特點(diǎn)“具有相同黏性末端的都可以連接”認(rèn)識(shí)不夠全面，故應(yīng)用相應(yīng)練習(xí)題進(jìn)行辨析。

三、“重組DNA分子的模擬操作”辨析與應(yīng)用

例題1據(jù)下列圖表回答問題：

三種限制酶特異識(shí)別的序列及切割位點(diǎn)圖示

（1）假設(shè)題目中涉及的三種限制酶能將相對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)完全剪切開，如果采用EcoRI和PstI酶切含有目的基因的DNA片段，可以能得到______種DNA片段。如果將質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段只用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶連接，可以形成的連接產(chǎn)物有________、________、_________。

（2）剪切之后的目的基因末端和質(zhì)粒載體末端可能會(huì)出現(xiàn)任意連接，酶切時(shí)最好選用選用的酶是__________、___________，可以一定程度減少無用連接。

學(xué)生1分析，該題主要考查限制酶和連接酶的特點(diǎn)。限制酶的特點(diǎn)是識(shí)別特定的DNA序列，且切割位點(diǎn)一定。連接酶的特點(diǎn)是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，相同的黏性末端均可連接。

學(xué)生2分析，第1小題的第一個(gè)空格，要求答出形成的DNA片段。由于目的基因所在的DNA片段上具有兩個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)和一個(gè)PstI酶切位點(diǎn)，采用這兩種酶進(jìn)行酶切，正如模擬操作中用剪刀模擬限制酶，切三次，應(yīng)該形成4個(gè)片段。

學(xué)生3分析，該題目要求質(zhì)粒和DNA片段只用EcoRI一種酶酶切，根據(jù)限制酶的特點(diǎn)，目的基因兩端和質(zhì)粒被限制酶酶切位點(diǎn)的黏性末端是一樣，根據(jù)DNA連接酶作用特點(diǎn)，只要黏性末端一樣即可連接。因此，有的小組將剪切開的綠色紙條和綠色紙條用膠布粘在一起，也有的將綠色紙條和紅色紙條粘在一起，還有的將紅色紙條和紅色紙條粘在一起。所以，在擁有許多個(gè)質(zhì)粒DNA、許多個(gè)目的基因所在DNA片段的前提下，可以有三種連接產(chǎn)物即質(zhì)?！|(zhì)粒、質(zhì)粒——目的基因、目的基因—目的基因連接產(chǎn)物。

教師提問：這三種連接中，哪種才是基因工程需要的？如何減少其他兩種錯(cuò)誤連接？學(xué)生思考與討論后得出：使得黏性末端多樣化。這樣就需要使用多種限制酶，但質(zhì)粒上只有SmaI和EcoRI兩種限制酶，所以答案就顯而易見了。

教師補(bǔ)充：是不是用這兩種酶切割就能完全杜絕錯(cuò)誤連接？激發(fā)學(xué)生思維沖突，因?yàn)閷W(xué)生發(fā)現(xiàn)即使應(yīng)用這兩種限制酶，也只能減少錯(cuò)誤連接，但不能杜絕錯(cuò)誤。因此，運(yùn)用例題2進(jìn)一步辨析。

例題2（2016年全國(guó)I卷）某一質(zhì)粒載體如圖所示。外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用Bam HⅠ酶切后，與用Bam HⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有________的固體培養(yǎng)基。

學(xué)生4分析：由于僅用Bam HI酶單酶酶切，得到的DNA片段有兩種。正如“重組DNA分子的模擬操作”中用剪刀分別切割目的基因所在DNA片段及質(zhì)粒載體片段，可以得到紅色的目的基因片段和綠色的質(zhì)粒載體片段。用紅色膠布或訂書釘進(jìn)行連接之后，黏性末端相同的都可以連接在一起。根據(jù)模擬操作可知，能夠形成三種連接產(chǎn)物：目的基因—目的基因、目的基因—質(zhì)粒載體、質(zhì)?！|(zhì)粒三種連接產(chǎn)物。將這三種連接產(chǎn)物一起轉(zhuǎn)化大腸桿菌，由于轉(zhuǎn)化了目的基因—目的基因的連接片段的大腸桿菌、未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不含有青霉素抗性基因所以不能區(qū)分。

筆者就“重組DNA分子的模擬操作”進(jìn)行了對(duì)比教學(xué)，一個(gè)班級(jí)先進(jìn)行模擬操作，而后做練習(xí)題，另一個(gè)班級(jí)反之，結(jié)果發(fā)現(xiàn)先進(jìn)行模擬操作的學(xué)生的兩道練習(xí)題的正確率明顯高于另一個(gè)班級(jí)?？梢姡M操作有助于具體化抽象概念，促進(jìn)學(xué)生在動(dòng)手、動(dòng)腦過程中建構(gòu)、理解與應(yīng)用生物學(xué)概念，提高理性思維能力。

［1］溫青.對(duì)培養(yǎng)學(xué)生生物學(xué)科核心素養(yǎng)的認(rèn)識(shí)［J］.福建基礎(chǔ)教育研究，2016（2）.

［2］俞紅成.高中生物學(xué)科核心素養(yǎng)的教學(xué)培養(yǎng)策略［J］.中學(xué)生物教學(xué)，2016（4）.

（責(zé)任編輯：陳欣）