陶瓷膜對脫脂乳中酪蛋白與其他組分的高效分離

張瑞華，張書文，劉 鷺，逄曉陽，蘆 晶，汪建明，呂加平,*

陶瓷膜對脫脂乳中酪蛋白與其他組分的高效分離

張瑞華1,2，張書文1，劉 鷺1，逄曉陽1，蘆 晶1，汪建明2,*，呂加平1,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技 術(shù)學(xué)院，天津 300457）

量化200 nm陶瓷膜脫除乳清蛋白、乳糖、灰分和鈣的能力。在50 ℃條件下，對脫脂乳進(jìn)行3 倍濃縮，之后連續(xù)2 次補(bǔ)水至原體積進(jìn)行稀釋過濾，濃縮倍數(shù)均為3，最終得到3 次濾液，計算各組分總脫除率。結(jié)果表明乳糖脫除率為85.81%，α-乳白蛋白脫除率為79.27%，β-乳球蛋白脫除率為71.64%，灰分脫除率為62.16%，鈣脫除率為35.64%。稀釋過濾完畢后膜的純水膜通量衰減系數(shù)為89.27%，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%氫氧化鈉和0.5%的硝酸溶液進(jìn)行清洗，膜通量的恢復(fù)系數(shù)為99.07%。

微濾；陶瓷膜；脫除率；膜通量

在乳品工業(yè)中，微濾主要應(yīng)用于除菌和體細(xì)胞。因為在過濾過程中不需要加熱，所以該方法受到易熱變性產(chǎn)品的廣泛歡迎[1]。近年來，微濾用于分離脫脂乳中的酪蛋白和其他組分的研究與日俱增[2-4]。微濾分離過程與傳統(tǒng)的酸化和酶凝方法不同，是基于分子質(zhì)量和直徑的不同，大部分乳清蛋白、乳糖、礦物質(zhì)和水能透過膜成為滲透液，酪蛋白不能透過膜留在截留液中[5]。通過微濾得到的截留液，可以用于制作干酪[6]，得率與脫脂乳相比明顯增加[7]。Neocleous等[8]研究表明，低濃縮倍數(shù)微濾截留液可成功應(yīng)用于切達(dá)干酪的生產(chǎn)。Brandsma等[9]研究表明高濃縮倍數(shù)截留液可生產(chǎn)馬蘇里干酪。

通過微濾得到的天然乳清蛋白（serum protein，SP）與干酪乳清蛋白（whey protein，WP）相比，基本上是無菌、無脂肪，而且有更好的溶解性、起泡性、凝膠性[10]。在干酪生產(chǎn)之前脫除乳清蛋白生產(chǎn)天然乳清蛋白濃縮物（SPC）可以很好地替代干酪乳清蛋白濃縮物（WPC）。

以脫脂乳為原料，利用膜技術(shù)進(jìn)行高效分級分離，滲透液用來生產(chǎn)高品質(zhì)的乳清蛋白產(chǎn)品，而截留液可以直接用于干酪生產(chǎn)，所產(chǎn)干酪的組成成分與傳統(tǒng)干酪類似，這樣既提升效率又減少了環(huán)境的污染。本研究目的是建立一個多階段微濾過程，對脫脂乳中的酪蛋白和其他組分進(jìn)行分離。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳40 kg 北京昌平區(qū)盛隆養(yǎng)殖場。

硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、硝酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、尿素、磷酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二硫代蘇糖醇、羥丙基甲基纖維素、三羥甲基胺基甲烷、α-乳白蛋白（α-lactalbuminn，α-La）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

圖 1 陶瓷膜中試設(shè)備Fig. 1 Schemic of pilot-scale ceramic membrane microfiltration

沃迪殺菌機(jī) 上海沃迪科技有限公司；FT-15碟片式離心機(jī) 英國Armfield公司；200 nm孔徑管式陶瓷膜、陶瓷膜中試設(shè)備（圖1） 上海凱鑫分離技術(shù)有限公司；2300全自動微量凱式定氮儀 丹麥Foss集團(tuán)有限公司；EPS301電泳儀 美國GE Healthcare公司；Ease?FC凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha公司；Colorflex EZ臺式色差儀 美國Hunterlab公司；pH計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀、聚乙烯醇涂層毛細(xì)管柱（65 cm×50 μm） 美國Beckman公司；3K15離心機(jī) 德國Sigma公司；AA-6300原子吸收分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂乳微濾操作工藝

原料乳經(jīng)巴氏殺菌、離心脫脂后，投料36 kg進(jìn)行微濾操作（膜孔徑200 nm、進(jìn)口壓力0.25 MPa、出口壓力0.12 MPa、料液溫度50 ℃），將巴氏脫脂乳濃縮3 倍（得到12 kg截留液和24 kg透過液，此過程為第1階段），之后將截留液用去離子水稀釋成原體積再進(jìn)行3 倍濃縮（12 kg截留液中加入24 kg去離子水，此過程為第2階段）。此稀釋過程再重復(fù)1 遍（此過程為第3階段），最終得到一份濃縮倍數(shù)為3的12 kg截留液和3 份24 kg的透過液。膜孔徑、進(jìn)出口壓力和濃縮倍數(shù)均經(jīng)過優(yōu)化。

1.3.2 濃縮倍數(shù)與脫除率的計算

濃縮倍數(shù)計算如式（1）所示：

式中：MR為脫脂乳的質(zhì)量/kg；MP為濃縮到某一時刻透過液的質(zhì)量/kg。

膜對物質(zhì)A（可為蛋白質(zhì)、乳糖或灰分）脫除率的計算如式（2）所示：

式中：M1為滲透液中物質(zhì)A的質(zhì)量/kg；M2為脫脂乳中物質(zhì)A的質(zhì)量/kg。

1.3.3 料液成分分析

采用凱式定氮的方法，分別測定脫脂乳、各階段截留液和滲透液中的總氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮含量，其中總氮含量按照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定；非蛋白氮含量參照GB/T 21704—2008《乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定》方法測定；截留液中非酪蛋白氮含量的測定采用文獻(xiàn)[11]方法；滲透液中非酪蛋白氮的測定采用文獻(xiàn)[12]方法。各蛋白含量計算如式（3）～（6）所示：

另外乳糖含量根據(jù)SN/T 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的測定方法》測定；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》方法測定，固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》方法測定。

1.3.4 顏色分析

采用色差儀來測定脫脂乳、各階段截留液與透過液溶液顏色的變化，儀器使用前先用白板進(jìn)行校正。將樣品置于室溫1 h后，分別測定各樣品的L*、a*和b*值。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

采用SDS-PAGE判定各階段截留液和濾過液中蛋白種類和大致含量。其分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，其中脫脂乳稀釋12 倍，截留液均稀釋30 倍，滲透液均稀釋2 倍，與2 倍樣品緩沖液（體積比1∶1）混合，沸水浴5 min，取10 μL上樣，電泳結(jié)束后，將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R250溶液中染色2 h，然后用脫色液搖床脫色過夜至背景清晰并攝像。

1.3.6 毛細(xì)管電泳分析

[13]的方法，采用毛細(xì)管電泳定量分析脫脂乳與透過液的α-La、β-Lg含量。將樣品與樣品緩沖溶液按1∶1（V/V）的比例混合，室溫放置1 h，10 000 r/min離心，取上清液，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進(jìn)樣。其操作條件為分離電壓20 kV、柱溫38 ℃、進(jìn)樣壓力0.5 psi、時間5 s、紫外檢測波長214 nm。樣品緩沖液：0.295 4 g檸檬酸鈉、0.156 g二硫代蘇糖醇、2.011 1 g三羥甲基胺基甲烷，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，調(diào)至pH 8.0。運行緩沖液：4.208 3 g檸檬酸、0.582 8 g檸檬酸鈉、0.05%羥丙基甲基纖維素，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，調(diào)至pH 3.0。

1.3.7 膜的污染與清洗

膜的污染程度使用純水通量衰減系數(shù)來衡量，其值越大表示膜污染越嚴(yán)重，計算公式（7）[14]為：

式中：J0和Jt分別為過濾前和過濾結(jié)束后僅用水清洗1 次后膜的純水通量/（L/（m2·h））。

膜的清洗效果可采用純水通量恢復(fù)系數(shù)來表示，計算公式（8）[14]為：

式中：J0和JQ分別表示膜過濾前和清洗后的純水通量/（L/（m2·h））。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 膜通量的變化

乳清蛋白和酪蛋白的直徑相差將近100 倍，所以用膜技術(shù)根據(jù)直徑的不同將乳清蛋白和酪蛋白分開是可行的[15]。由于存在膜污染使得膜通量減小，乳清蛋白通過率降低，微濾技術(shù)沒有在乳品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[16]。錯流微濾技術(shù)可以減少膜污染，料液流經(jīng)膜面時產(chǎn)生的剪切力把膜面上滯留的顆粒帶走，從而使污染層保持在一個較薄的水平[17]。本研究的膜通量基本維持在20 L/（m2·h），可以用于工業(yè)生產(chǎn)。由圖2可知，隨著時間的延長各階段膜通量不斷下降，這是由于濃差極化作用，在膜表面形成“二次膜”影響可透過成分的滲透。1 h之后3 個階段的衰減趨勢基本一致，這是因為隨著過濾的進(jìn)行，液料固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，增加了液料的黏度，降低了液料分子的通透性。階段1初始膜通量大于階段2、3初始膜通量，階段2、3初始膜通量無顯著變化，這是因為在第1階段過濾后膜污染已經(jīng)形成，之后的加水稀釋過程并沒有有效消除膜污染。

圖 2 稀釋過濾過程中膜通量隨時間的變化Fig. 2 Changes in membrane flux during microfiltration of skim milk and diluted retenates

2.2 料液組成成分的變化

表 1 各階段截留液成分組成Table 1 Composition of retentates from each sequential microfiltration stage %

表1為各階段截留液中各組分含量的變化，可以看出各階段截留液固形物、粗蛋白、非蛋白氮、非酪蛋白氮、真蛋白和乳清蛋白的含量不斷降低，這是因為隨著稀釋過濾的進(jìn)行，截留液中乳糖、乳清蛋白、小分子氮化合物和礦物質(zhì)不斷透過膜。第1階段與第2階段、第2階段與第3階段相比酪蛋白含量并沒有顯著性變化，第3階段與第1階段相比，酪蛋白含量增加。因為乳清蛋白不斷透過膜，隨著過濾的進(jìn)行酪蛋白含量應(yīng)當(dāng)減小，但是本實驗結(jié)果卻是增大的，這是由于實驗過程中不斷取樣，最終的濃縮倍數(shù)輕微有些改變。由于各階段的乳清蛋白含量顯著減小，所以各階段截留液酪蛋白占真蛋白的比值相應(yīng)顯著增加。表2為各階段透過液中各組分含量的變化，可以看出各階段透過液固形物、粗蛋白、非蛋白氮、非酪蛋白氮、真蛋白和乳清蛋白的含量隨著稀釋過濾的進(jìn)行不斷下降，這是因為各階段連續(xù)用去離子水進(jìn)行稀釋過濾，各階段可以透過的物質(zhì)逐漸減少。在各階段滲透液中沒有酪蛋白，說明該陶瓷膜可以將酪蛋白全部截留，這樣增加了截留液中酪蛋白的含量，有利于提升干酪的產(chǎn)量和降低干酪的水分含量[18]。

表 2 各階段透過液成分組成Table 2 Composition of filtrates from each sequential microfiltration stage %

2.3 pH值的變化

表 3 各階段初始液、截留液、透過液pH值變化Table 3 pH values of skim milk, and filtrates and retenates from each sequential microfiltration stage

表3中各階段初始液、截留液、透過液pH值不斷升高，這是因為在稀釋過濾過程中氫離子和緩沖鹽離子不斷被去離子水稀釋。Michael等[19]的研究表明每一階段的pH值大小順序為滲透液＞初始液＞截留液，并說明是因為料液乳清中可溶性鹽不斷被稀釋，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)此規(guī)律。

2.4 色度的變化

表 4 脫脂乳、各階段截留液和透過液色度值Table 4 Hunter L*, a*, and b*values of skim milk, and filtrates and retenates from each sequential microfiltration stage

酪蛋白膠束和脂肪球的折射率不同于在水中懸浮物質(zhì)。這種差異讓膠體微粒均勻反射全波長可見光，因此在白光下觀察牛奶時便是白色[20]。由表4可知，和脫脂乳相比各階段截留液L*值、a*值都顯著較大，這是因為截留液中酪蛋白含量的增加。此外各階段截留液L*值、a*值和b*值隨著階段的增加而增加。各階段的透過液L*值無顯著變化，這是因為透過液中基本不含有酪蛋白，均澄清透明，不會對明亮值L*產(chǎn)生影響。各階段透過液－b*值逐漸增大，這與截留液中VB的不斷滲透和補(bǔ)水稀釋作用有關(guān)。

2.5 各組分各階段脫除率的比較

圖 3 脫脂乳與各階段透過液（a）及脫脂乳與各階段截留液（b）的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE of skim milk and filtrates (a) and retenates (b) from each sequential microfiltration stage

圖 4 脫脂乳與各階段透過液毛細(xì)管電泳圖Fig. 4 Capillary electrophoresis of skim milk and filtrates from each sequential microfiltration stage

隨著稀釋過濾的不斷進(jìn)行，乳清蛋白不斷被脫除，各階段透過液中蛋白質(zhì)量濃度不斷降低。如圖3a所示，1～3階段乳清蛋白條帶逐漸變淺，說明每個階段蛋白的脫除率依次降低。1～3階段透過液中酪蛋白條帶非常淺，基本不含酪蛋白，由此可見酪蛋白通不過200 nm陶瓷膜。由圖3b可知，截留液酪蛋白條帶基本沒有變化，但是β-Lg和α-La條帶輕微變淺，說明每個階段逐漸有蛋白脫除。圖4為毛細(xì)管電泳測定結(jié)果，可以看出透過液123中都不含酪蛋白，說明酪蛋白完全被截留，與SDS-PAGE結(jié)果一致。通過圖4脫脂乳和透過液的峰面積可以計算β-Lg和α-La脫除率。

表 5 各組分各階段脫除率比較Table 5 Removal percentages of various components at each sequential microfiltration stage

如表5所示，各階段β-Lg、α-La、乳糖、灰分、鈣脫除率逐漸降低，這是由于隨著微濾的進(jìn)行，每個階段有更少的組分可以透過膜。第2階段與第3階段β-Lg脫除率不顯著，這是由于第1、2階段α-La累計脫除率較高，在截留液中β-Lg在兩種主要乳清蛋白的相對含量較高，因此有更多的β-Lg可以透過膜。

2.6 各組分累計脫除率的比較

理想狀態(tài)下，各組分3個階段累計脫除率分別為67%、89%和96%，但是本實驗所用200 nm陶瓷膜α-La的累計脫除率為79.27%，β-Lg的累計脫除率為71.64%，乳糖累計脫除率為85.81%，灰分累計脫除率為62.16%，鈣累計脫除率為35.64%。各組分累計脫除率均低于理論值可能有如下原因：存在大小不同的膜孔徑（一些膜孔徑太小以至于乳清蛋白不能通過）；在膜的出口處存在逆流壓力，減小了有效膜表面積；隨著微濾的進(jìn)行，由于濃差極化作用，在膜表面形成二次膜，阻礙了乳清蛋白的通過。

圖 5 各組分累計脫除率Fig. 5 Cumulative removal percentages of various components

如圖5所示，在所有組分中乳糖的脫除率最高，這是因為乳糖是一種二糖，分子質(zhì)量約為340 D，實驗中所用200 nm陶瓷膜的截留分子質(zhì)量約為200 kD，因此與其他物質(zhì)相比，乳糖更易發(fā)生滲透。Beckman等[21]使用孔徑0.3 μm卷式有機(jī)膜對脫脂乳進(jìn)行三段式稀釋過濾，研究發(fā)現(xiàn)對乳清蛋白脫除率為70.3%，如果要脫除95%的乳清蛋白，至少需要額外的5 次稀釋過濾，但是這樣會需要更長的時間和增加去離子水的使用量；Hurt等[22]使用孔徑為0.1 μm的均一壓差陶瓷膜對脫脂乳進(jìn)行三段式稀釋過濾后發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的脫除率高達(dá)95%以上，但是酪蛋白沒有完全截留，滲透液中含有0.2%的酪蛋白，這樣既降低了酪蛋白的得率，也會影響滲透液深加工成SPC的質(zhì)量。本研究通過毛細(xì)管電泳發(fā)現(xiàn)α-La的脫除率為79.27%，β-Lg的脫除率為71.64%，而且滲透液中不含酪蛋白，可以通過超濾制成SPC。乳中的無機(jī)鹽有一部分呈結(jié)合狀態(tài)，如鈣、鎂、磷等，這是造成灰分脫除率較低的主要原因[23-26]。乳中約有60%～70%的鈣以膠體磷酸鈣的形式存在，這部分鈣不易透過膜孔進(jìn)入滲透液，因此鈣的脫除率僅有35.64%，顯著低于其他組分，同時這也再次說明了灰分脫除率較低的原因。

2.7 膜的污染與清洗

隨著稀釋過濾的不斷進(jìn)行，凝膠層逐漸形成，膜通量由最初的28.75 L/（m2·h）降至14.5 L/（m2·h），說明膜受到一定程度的污染。稀釋過濾完畢后對200 nm陶瓷膜依次進(jìn)行純水沖洗、2%堿溶液清洗、0.5%酸溶液清洗，并在操作壓力（進(jìn)口0.2 MPa、出口0.08 MPa）條件下對純水通量進(jìn)行測定，結(jié)果見表6。根據(jù)表6的數(shù)據(jù)計算得到膜的純水通量衰減系數(shù)89.27%，說明在膜分離過程中，膜受到很嚴(yán)重的污染，但是通過純水、堿溶液、酸溶液清洗后膜通量得到很好的恢復(fù)。純水清洗后恢復(fù)系數(shù)僅為10.73%，說明純水基本起不到清洗效果。經(jīng)堿溶液清洗后，膜通量恢復(fù)至44.35%，之后再進(jìn)行酸洗，膜通量恢復(fù)系數(shù)為99.07%，說明只進(jìn)行堿洗起不到很好的清洗效果，堿洗之后進(jìn)行酸洗才能使膜通量得到很好的恢復(fù)。

表 6 不同階段陶瓷膜的純水通量Table 6 Water membrane flux before use and after each cleaning step

3 結(jié) 論

本研究選用陶瓷膜的平均膜通量在20 L/（m2·h）左右，可以用于工業(yè)化生產(chǎn)。從透過液SDS-PAGE圖和毛細(xì)管電泳圖中可以看出酪蛋白基本被截留，這有助于增加干酪的產(chǎn)量。各組分理論累計脫除率96%，本實驗所用200 nm陶瓷膜α-La的累計脫除率為79.27%，β-Lg的累計脫除率為71.64%，乳糖累計脫除率為85.81%，灰分累計脫除率為62.16%，鈣累計脫除率為35.64%。各組分累計脫除率均低于理論值95%可能有如下原因[27-29]：存在大小不同的膜孔徑（一些膜孔徑太小以至于乳清蛋白不能通過）；在膜的出口處存在逆流壓力，減小了有效膜表面積；隨著微濾的進(jìn)行，由于濃差極化作用，在膜表面形成二次膜，阻礙了一些物質(zhì)（乳清蛋白）的通過；原料奶經(jīng)過了巴氏殺菌，熱處理后，乳清蛋白變性，部分變性的β-Lg和α-La與酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白形成了復(fù)合物，從乳清相進(jìn)入了膠束相。在實際生產(chǎn)中，可以利用微濾滲透液進(jìn)行超濾制備SPC，相比于WPC其營養(yǎng)價值更高，被稱為黃金蛋白（golden protein）[30]；超濾滲透液可經(jīng)納濾和結(jié)晶制備乳糖；納濾滲透液可經(jīng)反滲透制備純水，用來補(bǔ)充微濾過程中所需要的去離子水。該方案綠色、經(jīng)濟(jì)、可循環(huán)，具有一定的市場推廣潛力。

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Efficient Separation of Casein and Other Components from Skim Milk by Ceramic Membrane

ZHANG Ruihua1,2, ZHANG Shuwen1, LIU Lu1, PANG Xiaoyang1, LU Jing1, WANG Jianming2,*, Lü Jiaping1,*
(1. Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

In this study, our objective was to quantify thecapacity of a ceramic microfiltration (MF) membrane with a pore size of 200 nm to remove whey proteins, lactose, ash and calcium from skim milk. Skim milk wasconcentrated three times by microfiltration at 50 ℃, and then the resulting retentate was diluted to the original volume followed by three-fold concentration under the same conditions as for skim milk. The same treatment was performed on the retennate obtained from the second microfiltration. During the whole process, the cumulative removal percentages of α-lactalbuminn, β-lactoglobulin, lactose, ash and calcium calculated from the three filtrates obtained were 79.27%, 71.64%, 85.81%, 62.16%, and 35.64%, respectively. After the second filtration, the pure water flux of the membrane was reduced 89.27%, and the membrane flux was recovered to 99.07% of the initial level after cleaning the membrane with 2% NaOH and 0.5% nitric acid solution.

micro ltration; ceramic membrane; removal rate; membraneux

10.7506/spkx1002-6630-201710039

TS252.41

A

1002-6630（2017）10-0236-06

張瑞華, 張書文, 劉鷺, 等. 陶瓷膜對脫脂乳中酪蛋白與其他組分的高效分離[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 236-241.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710039. http://www.spkx.net .cn

ZHANG Ruihua, ZHANG Shuwen, LIU Lu, et al. Efficient separation of casein and other components from skim milk by ceramic membrane[J]. Food Science, 2017, 38(10): 236-241. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710039. http://www.spkx.net.cn

2016-05-17

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B10）

張瑞華（1991—），男，碩士，研究方向為食品工程。E-mail：1553527430@qq.com

*通信作者：汪建明（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品工程。E-mail：wangjianming@tust.edu.cn呂加平（1963—），男，研究員，博士，研究方向為乳品加工及微生物。E-mail：lvjp586@vip.sina.com