兒童過敏性紫癜急性期T細(xì)胞亞群及B細(xì)胞的變化及意義

張 紅，王 強(qiáng)，房 俊，董 巍(.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000，2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.兒科；b.臨床醫(yī)學(xué)實驗中心，四川 成都 60072)

兒童過敏性紫癜急性期T細(xì)胞亞群及B細(xì)胞的變化及意義

張 紅1，王 強(qiáng)2a，房 俊2b，董 巍2b
(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000，2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.兒科；b.臨床醫(yī)學(xué)實驗中心，四川 成都 610072)

目的 觀察兒童過敏性紫癜(Hench-schonlein purpura，HSP)急性期T細(xì)胞亞群及B細(xì)胞的變化，探討其在HSP發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 四川省人民醫(yī)院兒科2015年8月至2016年5月收治的急性期HSP患兒46例(HSP組)以及健康對照兒童30例(對照組)，采用流式細(xì)胞儀檢測兩組患兒外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+及B細(xì)胞CD19+、CD19+CD23+的表達(dá)。采用ELISA法測定血清IFN-γ、IL-4濃度。結(jié)果 HSP組CD3+、 CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+較對照組降低(P< 0.01)，CD3+CD8+較對照組升高(P> 0.05)。HSP組B細(xì)胞CD19+、CD19+CD23+及血清IL-4水平高于對照組(P< 0.01)，血清IFN-γ 水平低于對照組(P< 0.01)。結(jié)論 HSP患兒急性期存在Th1/Th2失衡，Th2優(yōu)勢活化；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能低下；CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的功能紊亂及B淋巴細(xì)胞的增殖、活化。

T淋巴細(xì)胞亞群；B淋巴細(xì)胞；過敏性紫癜；兒童

過敏性紫癜(hench-schonlein purpura，HSP)是兒童時期最常見的出血性疾病之一，也是兒童時期最常見的一種自身免疫性血管炎性疾病。近年來該病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢。目前其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。但其主要的病理機(jī)制目前仍公認(rèn)為是免疫應(yīng)答機(jī)制介導(dǎo)的血管炎。本文通過觀察兒童過敏性紫癜急性期外周血T細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+及其相關(guān)細(xì)胞因子、B細(xì)胞的變化，旨在探討其在HSP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 四川省人民醫(yī)院兒科2015年8月至2016年5月收治的初診HSP患兒46例(HSP組)，符合2008年歐洲疾病防治委員會和歐洲兒童腎臟病防治委員會對過敏性紫癜診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]以及2009年中華醫(yī)學(xué)會兒科分會對紫癜性腎炎的診治循證指南(試行)[2]。均為首次發(fā)病，近4周未用過糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑，采血前24小時未用過任何藥物且排除其他疾病。年齡2～13歲[(7.94±2.93)歲]，其中男27例，女19例，單純皮膚紫癜8例，皮膚紫癜合并胃腸道癥狀10例，皮膚紫癜合并關(guān)節(jié)癥狀15例，皮膚紫癜同時合并胃腸道癥狀及關(guān)節(jié)癥狀4例，紫癜腎炎9例。我院兒童保健門診2015年8月至2016年5月常規(guī)體檢的30Sichuan，例健康兒童為對照組，無過敏性疾病及免疫性疾病史，年齡3～13歲[(7.25±2.12)歲]，其中男19例，女11例。兩組兒童年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。兩組兒童家長均知情同意，本研究經(jīng)院倫理委員會討論通過。

1.2 方法 ①血液采集：采集HSP患兒急性期外周靜脈血4 ml，2 ml肝素抗凝，用于T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+，CD4+CD25+及B細(xì)胞CD19+、CD19+CD23+的檢測，2 ml不抗凝用于IL-4、INF-γ檢測。對照組用同樣方法采血制備標(biāo)本。②淋巴細(xì)胞 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+及CD23+表達(dá)檢測：分別取CD3-PC5，CD4-FITC，CD8-PE，CD4-PE，CD25-FITC，CD19-PE及CD23-FITC鼠抗人熒光單克隆抗體(Beckman coulter公司，美國)各10 μl，加入肝素抗凝血50 μl，混勻，室溫暗處放置20 min，分別加入紅細(xì)胞裂解液混勻，在流式細(xì)胞儀(Beckman coulter公司，美國)上計數(shù)5×104以上細(xì)胞，分別記錄淋巴細(xì)胞CD3+，CD3+CD4+、CD3+CD8+、 CD4+CD25+和CD19+及CD19+CD23+表達(dá)的陽性率。③血清IL-4、INF-γ檢測：采用ELISA方法檢測(欣博盛生物科技有限公司，中國)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組T淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)果比較 HSP組CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+表達(dá)水平均低于對照組(P< 0.05)，兩組CD3+CD8+表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 HSP組與對照組T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá) (%)

2.2 兩組B淋巴細(xì)胞的結(jié)果比較 HSP組CD19+、CD19+CD23+表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 HSP組與對照組B淋巴細(xì)胞表達(dá) (%)

2.3 兩組血清IL-4、IFN-γ的比較 HSP組IL-4表達(dá)水平高于對照組，IFN-γ表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

表3 HSP組與對照組血清IL-4、IFN-γ的濃度 (pg/ml)

3 討論

HSP是兒童時期最常見的一種自身免疫性血管炎性疾病。目前其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。隨著人們對HSP發(fā)病機(jī)制的深入研究，現(xiàn)認(rèn)為HSP的發(fā)病機(jī)制涉及多個方面，包括體液免疫功能異常和T淋巴細(xì)胞亞群功能異常、細(xì)胞因子、凝血機(jī)制、基因易感性和炎癥介質(zhì)等均參與了本病的發(fā)病，但其主要的病理機(jī)制目前仍公認(rèn)為是免疫應(yīng)答機(jī)制介導(dǎo)的血管炎，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群的功能異常在免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示HSP患兒急性期Th1類細(xì)胞因子IFN-γ水平降低，Th2類細(xì)胞因子IL-4的水平增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。提示HSP患兒急性期存在Th1/Th2失衡，Th2優(yōu)勢活化，與文獻(xiàn)報道一致[3～5]。急性期HSP患兒Th1/Th2細(xì)胞失衡的原因可能與：①IFN-γ水平降低，IFN-γ/ STAT1信號傳導(dǎo)通路受抑制，Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)下調(diào)；②IL-4水平增高，IL-4/ STAT6信號傳導(dǎo)通路激活，Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[6，7]。同時我們采用流式細(xì)胞儀檢測了T細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的表達(dá)，結(jié)果顯示：CD3+、CD3+CD4+，CD4+/CD8+表達(dá)降低，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。CD3+CD8+的表達(dá)較對照組增高，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道一致[8，9]。提示HSP患兒急性期存在T淋巴細(xì)胞亞群的功能紊亂。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞亞群中的另外一類具有免疫抑制性和免疫無能性的T淋巴細(xì)胞亞群，Treg細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸、阻礙靶細(xì)胞代謝，通過分泌抑制性細(xì)胞因子(IL-35、IL-10、TGF-β1)并借助膜表面分子(CTLA-4、LAG-3)發(fā)揮其免疫抑制功能[10]，它在維持自身免疫耐受和抑制外來抗原介導(dǎo)的過度免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮十分重要的作用[11]。本研究顯示HSP組CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)水平較對照組降低，與國內(nèi)外報道一致[12，13]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)下調(diào)，其免疫抑制功能不足，抑制性細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，對促炎性免疫細(xì)胞(如：T細(xì)胞、DC、Th17細(xì)胞)的抑制功能減弱，從而導(dǎo)致過度免疫反應(yīng)及炎癥損傷，引起廣泛的小血管炎和HSP發(fā)生。

CD19分子是B細(xì)胞表面分子量為95KD的糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，僅表達(dá)于正常造血系統(tǒng)的B細(xì)胞和生發(fā)中心的濾泡樹突狀細(xì)胞。CD19分子的表達(dá)在骨髓B祖細(xì)胞即開始，持續(xù)于整個B細(xì)胞成熟期，在B細(xì)胞活化過程中不消失，其表達(dá)高低代表B細(xì)胞水平。CD23是一種分子量為45KDⅡ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于激活的B細(xì)胞表面，是B細(xì)胞激活標(biāo)志之一[14]。本研究結(jié)果顯示HSP組CD19+、CD19+CD23+細(xì)胞顯著升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。提示HSP急性期存在B淋巴細(xì)胞的多克隆活化、增殖。與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道一致[9，15]。

HSP患兒急性期存在Th1和Th2失衡，主要為Th2的優(yōu)勢活化，導(dǎo)致其分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-6增多，IL-4可促上調(diào)CD23表達(dá)，促進(jìn)多克隆B細(xì)胞活化、增殖；IL-6亦能活化B細(xì)胞，進(jìn)而大量合成、分泌IgA(主要IgA1)，異常糖基化的IgA1為主[16]。異常糖基化的IgA1，不能被肝細(xì)胞識別和清除，從而自我聚集形成多聚體或形成抗原-抗體免疫復(fù)合物沉積于血管壁引起廣泛的血管炎[16]；而Th1減少，其分泌的細(xì)胞因子IL-2 水平明顯降低，IL-2水平的降低，使CTL和NK細(xì)胞等的免疫功能降低，抑制B細(xì)胞活化、增殖的作用減弱，對外來抗原的清除能力下降，從而出現(xiàn)異常的免疫應(yīng)答引起免疫損傷。B細(xì)胞的增殖、活化與T細(xì)胞亞群紊亂及其分泌的細(xì)胞因子增高有關(guān)。說明HSP患兒急性期除存在體液免疫功能和T淋巴細(xì)胞亞群功能異常外，二者還相互作用，從而導(dǎo)致HSP的發(fā)生、發(fā)展。

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The changes and significance of T lymphocyte subsets and B lymphocytes in acute stage of Hench-schonlein purpura in children

ZHANGHong1，WANGQiang2a，F(xiàn)ANGJun2b，DONGWei2b
(1.SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，China；2a.DepartmentofPediatrics，2b.CentralLaboratoryofClinicalMedicine，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

WANGQiang

Objective To observe the changes of T lymphocyte subsets and B lymphocytes in acute stage of Hench-schonlein purpura (HSP) in children and explore the role of the indexes in the pathogenesis of the disease.Methods Forty-six children with HSP at acute stage admitted in our hospital from August 2015 to May 2016 were enrolled in this study (HSP group).Thirty healthy children were simultaneously taken as control group.The expression of T lymphocyte subsets CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+and CD4+CD25+and B lymphocytes CD19+and CD19+CD23+on peripheral blood mononuclear cells were detected by a flow cytometry.The serum levels of IL-4，and IFN-γ were measured by ELISA.Results The expressions of CD3+，CD3+CD4+，CD4+/CD8+and CD4+CD25+on peripheral blood mononuclear cells were lower in the HSP group than those in the control group (P< 0.01).An increase of CD3+CD8+expression was found in the HSP group when compared to the control group but not reached significant difference (P> 0.05).The expressions of CD19+，CD19+CD23+and IL-4 level in the HSP group were higher than those in the control group (P< 0.01) while IFN level was lower than that in the controls (P< 0.01).Conclusion There is a Th1/Th2 imbalance and a predominant activation of Th2 at acute phase of the disease.In addition，there are hypofunction of CD4+CD25+regulatory T cell，functional disorder of T lymphocyte subsets CD3+，CD3+CD4+and CD3+CD8+and activation of B lymphocyte proliferation.

T lymphocyte subset；B lymphocyte；Hench-schonlein purpura；Children

王 強(qiáng)

R725

A

1672-6170(2017)02-0075-03

2016-08-24；

2016-10-31)