結腸癌細胞HIF-1α及MDR1 miRNA 重組慢病毒干擾體系多藥耐藥研究

楊光磊 胡巖芳 胡延偉 王 釗 張仕東 葛國慶

結腸癌細胞HIF-1α及MDR1 miRNA 重組慢病毒干擾體系多藥耐藥研究

楊光磊 胡巖芳 胡延偉 王 釗 張仕東 葛國慶

目的 研究HIF-1α及MDR1 miRNA 重組慢病毒干擾體系的多藥耐藥性。方法 收集結腸癌切除的標本60例，用福爾馬林(10%)浸泡，制成蠟塊存檔標本。通過觀察HIF-1α與P-gp的表達和分布情況，找出二者關聯(lián)。并構建miRAN干擾體系，研究重組慢病毒干擾體系和結腸癌細胞多藥耐藥的關系。結果 HIF-1α的表達與患者的性別、年齡、腫瘤的位置以及腫瘤分化的程度無關(P>0.05)，而與Dukes分期、淋巴結轉移有關。HIF-1α表達與P-gp的表達呈顯著正相關(γ=0.613，P<0.05)。LoVo 細胞對 ADR、VCR及5-Fu的敏感性均有不同程度的恢復，但沉默HIF-1α前后并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，沉默 MDR1基因后，LoVo細胞對 ADR 與 VCR 的耐藥性有所逆轉，沉默 MDR1 基因表達對二者化療敏感性變化無明顯影響。結論 HIF-1α與P-gp的表達不受患者的性別、年齡、腫瘤位置、分化程度的影響，HIF-1α表達與P-gp的表達呈顯著正相關，說明HIF-1α通過與 MDR1/P-gp 的相互作用最終參與了結腸癌多藥耐藥的發(fā)生。

結腸癌；HIF-1α；miRNA；P-糖蛋白；多藥耐藥；慢病毒載體

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:545～547)

結腸癌是死亡率很高的惡性腫瘤之一，對結腸癌患者的治療主要是化療，不同的患者對化療敏感性不同，其中多藥耐藥性(MDR)是化療最終失敗的主要原因[1]。所以研究多藥耐藥基因及其編碼的蛋白就具有重要意義[2]。P-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)是1種跨膜藥物轉運蛋白，多種化療藥物在體內(nèi)的運轉都需要P-gp，P-糖蛋白能將攝入細胞內(nèi)的藥物排出，維持細胞藥物的低濃度水平。如果P-gp 蛋白過表達則出現(xiàn)對化療藥物的耐藥性，最終導致化療失敗。研究發(fā)現(xiàn)在缺氧情況下缺氧誘導因子HIF-1α表達提升[3]。HIF-1α 的過表達造成腫瘤細胞對化療藥物耐藥性增強，并且HIF-1α 還會與MDR1/P-gp 相互作用并參與到結腸癌的多藥耐藥中，所以控制 HIF-1α 的表達水平，就可以在基因水平上實現(xiàn)對結腸癌多藥耐藥的逆轉[4]。 鑒于此，本課題通過觀察結腸癌組織標本中HIF-1α與P-gp的表達和分布情況，檢測4種結腸癌細胞株經(jīng)低氧處理后 HIF-1α與 MDR1/P-gp的表達變化情況；利用 Invitrogen 公司的 BLOCK-i TTMLentiviral PolⅡmiR RNAi表達體系構建慢病毒載體，再由pc DNATM6.2-GW/Em GFP-miR-HIF-1α(MDR1)質(zhì)粒，通過BP/LR反應，將 Em GFP-miR-HIF-1α和 Em GFP-miR-MDR1 的表達框整合重組到產(chǎn)毒質(zhì)粒p Lenti6/V5-DEST里面，然后通過慢病毒混和包裝質(zhì)粒的載體包裝病毒，最后通過293FT細胞產(chǎn)毒從而構建出慢病毒載體介導的 HIF-1α 與 MDR1 2套miRNA干擾體系，研究結腸癌細胞多藥耐藥的相關因素，從而在臨床上可以從基因層面控制癌細胞的多藥耐藥性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集我院 2013至2015年間的結腸癌切除的標本60例，用福爾馬林(10%)浸泡，制成蠟塊存檔標本。60例結腸癌患者中男女各30例，年齡22～88歲；Dukes分期：AB 期32例，CD 期28例；病變分布：左面31例，右面29例；癌細胞分化程度：高、中分化37例，低分化23例；其中有20例伴隨淋巴結發(fā)生轉移。

1.2 研究方法

(1)使用免疫組織化學染色和雙標染色技術，觀察HIF-1α 和 P-gp 的分布及表達，研究它們的分布及表達與臨床病理參數(shù)的關系[5]。

(2)分別在常氧和低氧培養(yǎng)條件下，檢驗 HIF-1α 與 MDR1/P-gp 的表達變化情況，探討低氧環(huán)境對HIF-1α 及 MDR1/P-gp 表達的影響[6]。

(3)采用三維培養(yǎng)的方法分別建立穩(wěn)定感染 HIF-1α 或 MDR1 miR重組慢病毒及親本LoVo細胞的多細胞球(MCS)培養(yǎng)體系，模擬腫瘤細胞生存的微環(huán)境，經(jīng)低氧培養(yǎng)處理，建立LoVo MCS耐藥模型，用流式細胞術檢測各組LoVo MCS的細胞周期分布情況；再利用Western blot技術檢測HIF-1α及MDR1 miR在低氧誘導下的LoVo MCS水平與相應目的基因的沉默效果并與常氧培養(yǎng)的正常LoVo MCS中目的基因蛋白表達情況作比較。

(4)分別在常氧、低氧條件下得到ADR、VCR、5-Fu 和 CPT-11 4種藥物，用MTT法檢測多藥耐藥性變化，并在低氧誘導的LoVo MCS多藥耐藥的模型水平[7]，分別檢測 HIF-1α和MDR1兩套miR重組慢病毒感染組細胞對上述4種化療藥物耐藥性的變化，找出兩者之間關系。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 HIF-1α的表達與結腸癌病理特征的關系

HIF-1α蛋白陽性表達率為 58.6% (35/60)，陰性表達率為41.4%(25/60)。HIF-1α的表達與患者的性別、年齡、腫瘤位置及分化程度無關(P>0.05)，與Dukes分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表1。

表1 HIF-1α 與 P-gp的表達及與病理特征關系/例

2.2 HIF-1α與P-gp表達相關性研究

HIF-1α 與 P-gp 的相關性用Spearman 等級相關分析，SHIF-1α表達與P-gp的表達呈顯著正相關(γ=0.613，P<0.05)，見表2。

表2 HIF-1α與P-gp表達相關性/例

2.3 Lo Vo MCS經(jīng)不同藥物作用后IC50的比較

4種藥物在低氧處理后的LoVo MCS中敏感性均有不同程度下降，IC50值均高于相應的常氧組(ADR、VCR、5-Fu，均P<0.01，顯著耐藥；CPT-11，P>0.05，差異不顯著)。LoVo MCS/LVV-HIF-1α miR組中沉默HIF-1α基因后，LoVo細胞對 ADR、VCR及5-Fu的敏感性均有不同程度的恢復，但沉默 HIF-1α前后并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。對于 LoVo MCS/LVV-MDR1 miR組，沉默MDR1基因后，LoVo細胞對ADR與VCR 的耐藥性有所逆轉，而5-Fu與CPT-11的IC50值與低氧組相比無明顯差異(P>0.05)，表明沉默MDR1基因表達對二者化療敏感性變化無明顯影響。見表3。

表3 各組 LoVo MCS經(jīng)不同藥物作用后IC50的比較

3 討論

1992年人類發(fā)現(xiàn)基因缺氧反應原件的核因子，它就是HIF-1。它廣泛存在哺乳動物，包括人類的細胞中[8]。HIF-1包括HIF-1α和HIF-1β，HIF-1α和HIF-1β均屬堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子家族中的亞族蛋白[9]。HIF-1是由2個亞單位結合而構成異的異源二聚體[10]，觀察發(fā)現(xiàn)HIF-1β不但存在于正常細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，而且在缺氧細胞中也有表達。不同的是HIF-1α僅在缺氧細胞的核中表達，在有氧條件下被素蛋白酶系統(tǒng)降解。研究 HIF-1α 對腫瘤的各種影響具有深遠意義[11]。腫瘤中往往存在著缺氧微環(huán)境，造成缺氧環(huán)境有3個原因，一是由于腫瘤血管結構和功能出現(xiàn)異常，二是由于微循環(huán)障礙導致供氧不足，三是腫瘤細胞大量繁殖，耗氧增加從而導致缺氧[12]。在這種缺氧環(huán)境下，HIF-1α與腫瘤的多種生物學特性都存在關聯(lián)。HIF-1α 可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)眾多轉錄調(diào)控因子對缺氧做出適應性反應，從而維持腫瘤細胞的能量代謝，促進新生血管形成，促使腫瘤侵襲或轉移，并誘導腫瘤耐藥性增強。實驗表明HIF-1α 表達與腫瘤的耐藥存在密切關系[13]。因此闡明 HIF-1α 對結腸癌多藥耐藥的影響有助于實現(xiàn)逆轉腫瘤耐藥和提高化療效果。

數(shù)據(jù)顯示HIF-1α與MDR1/P-gp 在低氧環(huán)境下的表達明顯上升，這與文獻報道在結腸癌細胞中的研究結果相一致。 HIF-1α與P-gp 存在共表達和過表達現(xiàn)象，分析兩者相關表達，可以看到HIF-1α與P-gp在結腸癌組織中的表達呈顯著正相關(P<0.01)，說明HIF-1α與P-gp相互關聯(lián)，相互作用，并共同參與了結腸癌的多藥耐藥性的發(fā)生。低氧條件下誘導結腸癌親本LoVo MCS產(chǎn)生MDR表型，形成有效的耐藥模型，對ADR、VCR及5-Fu均產(chǎn)生不同程度耐藥，對CPT-11的影響不大。沉默MDR1基因可以逆轉由P-gp經(jīng)典耐藥途徑介導的LoVo MCS對ADR和VCR產(chǎn)生的耐藥；沉默 HIF-1α 基因可以有效逆轉LoVo MCS對 ADR、VCR及5-Fu產(chǎn)生的耐藥。耐藥逆轉機制可能與其誘導MDR1/P-gp的表達、參與細胞周期的調(diào)控、抑制細胞凋亡等多因素相關。

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(編輯：甘 艷)

Multidrug Resistance of Colon Cancer Cells HIF-1α and MDR1 miRNA LentivirusInterference System

YANGGuanglei，HUYanfang，HUYanwei，etal.

XingtaiPeople’sHospital，Xingtai，054031

Objective To study multidrug HIF-1α and MDR1 miRNA lentivirus system interference resistance.Methods60 cases of colon cancer resection specimens soaked with the formalin(10%)，made of wax block archived specimens.Correlation between HIF-1α and P-gp were detected by observing their expression and distribution.Build，recombinant lentivirus relationship miRAN system interference interference system and colon cancer cells multidrug resistance.Results The gender，age，location of the tumor and the degree of tumor differentiation were independent of the expression of HIF-1(P>0.05)，which was related to Dukes stage and lymph node metastasis.SHIF-1 expression was significantly positively correlated with P-gp expression(γ=0.613，P<0.05).ADR，VCR and LoVo cells on the sensitivity of 5-Fu had different degrees of recovery，but there was no significant difference between before and after silencing HIF-1 alpha(P>0.05)，MDR1 gene silencing，the drug resistance of LoVo cells to ADR and VCR have reversed，silencing the expression of MDR1 had no significant effect on the change of chemotherapy sensitivity.Conclusion HIF-1α and P-gp expression are not affected by gender，age，and location，differentiation degree.HIF-1α and P-gp expression are positively correlated，and HIF-1α eventually involved in the occurrence of colon cancer multidrug resistance by interacting with MDR1/P-gp.

Colon cancer；HIF-1α；miRNA；P-gp；Multidrug resistance；Lentiviral vectors

054031 河北省邢臺市人民醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.007

R735.3+5

A

1001-5930(2017)04-0545-03

2016-05-09

2016-11-04)