蒙古沙冬青深色有隔內(nèi)生真菌磷脂脂肪酸生物標(biāo)記

王少杰，左易靈，薛子可，賀學(xué)禮

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002)

蒙古沙冬青深色有隔內(nèi)生真菌磷脂脂肪酸生物標(biāo)記

王少杰，左易靈，薛子可，賀學(xué)禮

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002)

為探究深色有隔內(nèi)生真菌(DSE)磷脂脂肪酸(PLFA)生物標(biāo)記在DSE分類鑒定和土壤微生物檢測上的應(yīng)用，分別于寧夏銀川、沙坡頭、甘肅民勤和內(nèi)蒙古烏海4個樣地采集蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)根樣，分離得到DSE，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進行分類鑒定，并利用Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)檢測DSE脂肪酸組成。4個樣地共分離得到12株DSE，可劃分為7屬7種。通過對DSE脂肪酸組分進行檢測，共得到91種已知脂肪酸和12種Summed Feature型。DSE脂肪酸以C14酸、C16酸和C17酸為主，其中16∶0、16∶1 Cis 9 (ω7)、18∶2 CIS 9,12/18∶0a、18∶0 和Summed Feature 8為DSE共有脂肪酸，部分菌株中還具有特有脂肪酸組成，其可作為土壤微生物檢測的生物標(biāo)記。通過脂肪酸分析可將12株DSE分為4個類群，將3株DSE鑒定到種。結(jié)果表明，PLFAs生物標(biāo)記可作為DSE分類鑒定指標(biāo)，并為土壤微生物檢測提供依據(jù)。

DSE；磷脂脂肪酸；生物標(biāo)記

深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes，DSE)是一類定殖在植物根皮層細(xì)胞或細(xì)胞間隙的土壤內(nèi)生真菌，能夠產(chǎn)生黑色有隔菌絲和微菌核[1]。DSE廣泛分布于各種生境[2-4]，尤其在干旱半干旱[5-6]、重金屬礦區(qū)[7-8]等脅迫環(huán)境中具有較高定居率。目前，DSE分類學(xué)地位和生態(tài)學(xué)功能尚不清楚，大部分DSE只在特殊條件下才能誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生分生孢子[9]。在DSE研究中，通常結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)手段進行鑒定，徐風(fēng)美等[10]在研究油松根部真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性中，共鑒定出23種真菌，包括8種DSE。

磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)是微生物細(xì)胞膜的重要組成成分，其含量在自然生理條件下相對穩(wěn)定，具有遺傳穩(wěn)定性[11]，可作為微生物分類的重要標(biāo)記[12]。自Abel等[13]首次證實細(xì)胞脂肪酸可用于細(xì)菌鑒定之后，PLFA生物標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類鑒定，其結(jié)果與傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果一致[14]。此外，脂肪酸分析也可用于微生物分類，通過對比芽孢桿菌模式菌株進行脂肪酸組分和16S rRNA基因系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸分析能夠根據(jù)芽孢桿菌親緣關(guān)系和生物學(xué)特性進行分類[15]。不同的微生物中具有不同的PLFA組成和含量，可用來標(biāo)記特定微生物類群和生物量，用于土壤中微生物量和群落組成分析[16]。美國MIDI公司基于脂肪酸分析技術(shù)而開發(fā)的全自動微生物鑒定系統(tǒng)(Sherlock Microbial Identification System，Sherlock MIS4.5)，已廣泛應(yīng)用于微生物分類鑒定和微生物群落分析，但有關(guān)DSE磷脂脂肪酸的研究尚未見詳細(xì)報道。

本試驗以12株DSE為研究對象，通過比較脂肪酸分析法、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，以期為脂肪酸分析技術(shù)應(yīng)用于DSE分類鑒定和土壤微生物群落分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

12株供試菌株均從西北荒漠地區(qū)蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)根樣中分離得到，現(xiàn)存于河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌根生物技術(shù)研究室(表1)。

1.2 方 法

1.2.1 菌株活化培養(yǎng) 所有供試菌株均用PDA培養(yǎng)基進行活化，27 ℃黑暗培養(yǎng)20 d，觀察菌落形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

1.2.2 ITS序列擴增及比對 利用DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取DNA，作為ITS序列擴增模板。ITS擴增引物為ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)(北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司)。PCR擴增采用20 μL體系：2×PCRTaqMix 10 μL，引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，模板3.5 μL，超純水5.50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR原液進行測序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，所得ITS序列在NCBI進行Blast序列比對。

1.2.3 DSE磷脂脂肪酸提取[17]取40 mg菌株培養(yǎng)物，置于8 mL螺口玻璃管中，加入1 mL溶液Ⅰ，擰緊螺蓋，沸水浴5 min，取出震蕩5～10 s，再度沸水浴25 min；待樣品管冷卻后，加入2 mL溶液Ⅱ，蓋嚴(yán)震蕩，隨后精確控制80±1 ℃水浴10 min，冷水浴冷卻；加入1.25 mL溶液Ⅲ，快速震蕩10 min，棄去下層水相；在剩余有機相中加入3 mL溶液Ⅳ，快速震蕩5 min，待上層溶液澄清后，取三分之二有機相(大于0.3 mL)置氣相色譜樣品瓶中，備用。

其中溶液Ⅰ(皂化試劑)：45 g氫氧化鈉溶于150 mL甲醇及150 mL蒸餾水；溶液Ⅱ(甲基化試劑)：97.5 mL濃鹽酸，1 375 mL甲醇溶于65 mL蒸餾水；溶液Ⅲ(萃取試劑)200 mL正己烷(色譜純)與200 mL甲基叔丁基醚(色譜純)混合均勻；溶液Ⅳ(洗滌試劑)：10.8 g氫氧化鈉溶于900 mL蒸餾水。

1.2.4 DSE磷脂脂肪酸檢測及分析 氣相色譜系統(tǒng)采用美國Agilent 7890B型，包括全自動進樣裝置、色譜柱(19091B-102，25 m×0.200 mm×0.33 μm)及氫火焰離子化檢測器；分析軟件為 Sherlock MIS系統(tǒng)，采用SFUNGI6方法對脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣(MIDI公司提供)和樣品進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

脂肪酸數(shù)據(jù)結(jié)果利用SPSS 20進行處理，采用Ward法、塊度量標(biāo)準(zhǔn)進行聚類分析。ITS序列經(jīng)Clustal X[18]對齊后，用軟件Mega 4[19-20]進行聚類分析(方法為Neighbour-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor)。

表1 樣地概況

2 結(jié)果與分析

2.1 DSE形態(tài)學(xué)特征

由圖1可知，供試菌株在PDA培養(yǎng)基中形成不同的菌落形態(tài)，菌落顏色以灰色、黑色和褐色為主，大部分菌落中間具有“隆起”結(jié)構(gòu)，其中菌株3A SPT1218、SPT-11225和8YC菌落中具有同心輪紋結(jié)構(gòu)。通過插片觀察，供試菌株均能產(chǎn)生深色有隔菌絲，其中菌株6SPT、SPT-11225、2SPT1218、0-10MQ1717-3、8YC和4YC0-10具有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，其中菌株WH2-1和WH3-2菌絲末端膨大形成厚垣孢子。12種供試DSE菌株主要識別特征見表2。

表2 DSE形態(tài)學(xué)特征

2.2 ITS序列測定及比對

結(jié)果表明，ITS序列片段長度是525～617 bp。通過Blast序列比對，發(fā)現(xiàn)12株DSE歸于7屬，即枝孢屬Cladosporium、外瓶霉屬Exophiala、瓶霉屬Phialophora、異莖點霉屬Paraphoma、莖點霉屬Phoma、Pleosporales和埃里隔孢屬Embellisia。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株2SPT1218、6SPT、SPT-11225、0-10MQ1217-2-2、0-10MQ1217-3、8YC、WH2-1和WH3-2準(zhǔn)確鑒定到種；其他4株由于沒有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)或生長特征不明顯，只能通過ITS序列比對鑒定到屬(表3)。

1：Ⅰ.3A SPT1218 菌絲 Hypha (H)； 2：Ⅱ.6SPT 菌絲 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；3：Ⅲ.SPT-11225 菌絲 Hypha(H)、孢子 Spore(S); 4：Ⅳ.2SPT1218 菌絲 Hypha(H)、孢子 Spore(S); 5：Ⅴ.0-10MQ1217-2-2 菌絲 Hypha(H)； 6：Ⅵ.0-10MQ1717-3菌絲 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；7：Ⅶ.MQ1225菌絲 Hypha(H)；8：Ⅷ.2MQ0-10菌絲 Hypha(H)；9：Ⅸ.8YC 菌絲 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；10：Ⅹ.4YC0-10 菌絲 Hypha(H)、孢子 Spore(S)；11：Ⅺ.WH2-1 菌絲 Hypha(H)、厚垣孢子 Chlamydospore (C)；12：Ⅻ.菌絲 Hypha(H)、厚垣孢子 Chlamydospore(C)

表3 DSE序列比對

2.3 DSE脂肪酸鑒定結(jié)果和ITS序列比對結(jié)果比較

Sherlock MIS系統(tǒng)主要根據(jù)保留時間和峰值進行數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索匹配。只要數(shù)據(jù)庫有的菌種，且第1個相似指數(shù)大于0.5并與第2個相似指數(shù)相差0.1以上，則可準(zhǔn)確鑒定到種。若相似指數(shù)在0.3～0.5，可準(zhǔn)確鑒定到屬。

由表4可知，菌株3ASPT1218、6SPT和8YC在Sherlock MIS系統(tǒng)真菌數(shù)據(jù)庫中有匹配菌種，其中菌株3ASPT1218和8YC均為皮炎外瓶霉Exophialadermatitidis，相似指數(shù)分別為0.468和0.416；菌株6SPT第1鑒定結(jié)果為皮炎外瓶霉Exophialadermatitidis，相似指數(shù)為0.466，第二鑒定結(jié)果為沙門外瓶柄霉Exophialasalmonis，相似指數(shù)為0.416。與形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果比較，3ASPT1218和8YC通過Sherlock MIS系統(tǒng)能準(zhǔn)確鑒定到屬，但6SPT的ITS鑒定結(jié)果為甘瓶霉Phialophoramustea，與Sherlock MIS系統(tǒng)兩個鑒定結(jié)果明顯不同。

表4 菌株脂肪酸及ITS鑒定

2.4 兩種聚類分析方法比較

由圖2可知，12株DSE分為3大分支其中包括4個小類群。類群Ⅰ包括3株菌，0-10 MQ1217-2-2為菊異莖點霉Paraphomachrysanthemicola，4YC0-10和2MQ0-10為莖點霉屬Phoma；類群Ⅱ為埃里磚格孢屬Embellisia類群，由WH2-1和WH3-2組成；類群Ⅲ由4株菌組成，其中3ASPT1218、8YC和SPT-11225位于一小分支上，屬于外瓶霉屬Exophiala；MQ1225屬于腔菌目Pleosporales，位于另一小分支上；類群Ⅳ中，2個枝孢屬菌Cladosporium2SPT1218和0-110MQ1217-3位于一個分支，瓶霉屬菌Phialophora6SPT在另一分支。

脂肪酸聚類分析共分出2大分支其中包括4個小類群。類群Ⅰ由沙打旺埃里磚格孢Embellisiaastragalif和 2株莖點霉菌 Phoma sp.組成；類群Ⅱ中含有2種枝孢菌Cladosporium和1種埃里磚格孢Embellisia；類群Ⅲ由5株菌組成，包含2種外瓶霉菌Exophiala、2種瓶霉菌Phialophora和1種異莖點霉菌Paraphoma；類群Ⅳ為MQ1225腔菌目菌Pleosporales(圖3)。

比較以上兩種聚類圖可知，2種分類方法均可將菌種細(xì)分為4個小類群。通過脂肪酸聚類分析，可以將一些親緣關(guān)系近的菌株聚到同一小類群中，但與分子分類法相比，脂肪酸聚類分析未能完整反映出菌株的分類地位。

2.5 DSE脂肪酸成分分析

12株DSE共檢測出91種已知PLFA和12種Summed Feature型，以支鏈脂肪酸為主，C16酸種類最多，共17種；其次是C14酸和C17酸，均含10種。脂肪酸16∶0、16∶1 Cis 9 (ω7)、18∶2 CIS 9,12/18∶0a、18∶0和Summed Feature 8為12株DSE共有，除WH2-1為34.42%和2MQ0-10為37.81%之外，其他菌株中4種PLFAs的相對含量占全部脂肪酸含量的71.48%～95.5%,而其他大部分脂肪酸組分相對含量不足1%。不同樣地檢測出的PLFA種類各不相同，其中，民勤共發(fā)現(xiàn)68種，沙坡頭為64種，銀川為38種，烏海27種。沙坡頭共分離得到4株DSE，菌株P(guān)LFA種類為15～33種，其中2SPT1225含有種類為33種；民勤分離得到的4株DSE脂肪酸種類為25～36種，其中MQ1225種類為36種；銀川2株，8YC為25種，4YC0-10為21種；烏海2株，WH2-1為19種，WH3-2為13種。

此外，根據(jù)菌株中脂肪酸中出現(xiàn)的頻率，可以將PLFA分為高頻次、低頻次和微頻次，微頻次只在一種菌株中出現(xiàn)，可以作菌株的特征脂肪酸。除4YC0-10、WH2-1和WH3-2之外，其他9株DSE均發(fā)現(xiàn)有特征脂肪酸(表5)。

圖2 DSE系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 DSE的脂肪酸聚類分析

3 討 論

近年來，DSE雖然因其廣泛分布性、可培養(yǎng)性以及潛在的生態(tài)學(xué)功能[21]受到越來越多的關(guān)注，但對其種類組成和分類地位仍缺乏共識。有研究表明，前期以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的對DSE的描述和鑒定十分混亂[22]，隨著越來越多的DSE被發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征已經(jīng)不適用于菌種的分類。基于ITS序列分析的分子生物學(xué)雖已成功運用到DSE分類鑒定中，但由于真菌ITS序列高度保守性,在間隔區(qū)上表現(xiàn)的差異性較小,不適合于屬內(nèi)種及種群的標(biāo)記[23]。因此，在DSE鑒定方面，依靠形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)獲得的信息依然有限，需要結(jié)合更多的技術(shù)和資料庫。PLFA分析法[24]是基于脂肪酸可作為生物標(biāo)記物而發(fā)展起來的分析技術(shù)，主要是通過分析微生物細(xì)胞膜PLFA組分進行菌種鑒定。目前，基于PLFA分析的Sherlock MIS系統(tǒng)已廣泛用于微生物分類鑒定。吳愉萍等[25]證實該系統(tǒng)對TSBA培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌分類鑒定具有很高準(zhǔn)確率。黃朱梁等[26]在對貽貝中分離的蠟樣芽孢桿菌研究中發(fā)現(xiàn)，TSBA 培養(yǎng)待檢微生物、獲菌量控制在 100～120 mg，能夠通過Sherlock MIS系統(tǒng)準(zhǔn)確鑒定出菌種。相對于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)，PLFA分析法操作安全、簡單、快速，實驗成本低，在一定程度上能彌補其不足。

表5 DSE磷脂脂肪酸種類數(shù)及特征脂肪酸種類

本試驗利用Sherlock MIS系統(tǒng)對DSE磷脂脂肪酸組分進行檢測時發(fā)現(xiàn)，不同樣地檢測出的PLFAs種類差異顯著，這可能與分離的菌株數(shù)有關(guān)，也可能與所處的生態(tài)環(huán)境有關(guān)[27]。此外，分離自不同樣地的菌株中PLFAs組成和含量也不盡相同，說明環(huán)境條件的改變能夠影響PLFAs的組成[28]，其組成和含量變化可能有助于DSE適應(yīng)當(dāng)前的環(huán)境，兩者之間的關(guān)系尚需進一步研究。研究還發(fā)現(xiàn)，盡管不同菌株中PLFA組成和相對含量不同，但是所有供試DSE中仍含有一些共有脂肪酸。對共有PLFAs組成和相對含量進行分析，結(jié)果表明，4種共有脂肪酸組成相對含量顯著大于其他PLFAs組分，是DSE的主要PLFA組成。另外，一些DSE菌株中還存在有特有脂肪酸組成，可作為特征脂肪酸。PLFAs作為細(xì)胞膜的主要成分，是微生物遺傳物質(zhì)重要表達產(chǎn)物，與DNA具有同源性，不同菌種中其組成和含量具有菌種特異性。因此，DSE的主要脂肪酸和特征脂肪酸可為真菌脂肪酸分類和快速鑒定提供重要依據(jù)[29]，也可作為土壤中微生物檢測的生物標(biāo)記。

PLFAs主要存在于活體細(xì)胞中，其周轉(zhuǎn)速率極快且隨細(xì)胞死亡而迅速降解[30]，脂肪酸結(jié)構(gòu)與種類多樣，且對環(huán)境因素敏感，因此微生物PLFAs組成和含量會隨著提取時間和培養(yǎng)條件的變化而發(fā)生變化[31]；此外，盡管MIDI 公司為脂肪酸鑒定制定了一套嚴(yán)格的操作規(guī)范，但實際試驗過程中仍會出現(xiàn)一些操作偏差，這些因素都會影響DSE脂肪酸組成和含量的檢測，進而影響DSE的脂肪酸聚類分析。通過對比Sherlock MIS系統(tǒng)中的真菌資源庫和ITS序列基因數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Sherlock MIS系統(tǒng)中的真菌庫容較小，只收錄30屬62種真菌菌種，其最近更新時間是在2005年，使得部分DSE菌種未能通過脂肪酸分析法得到可信鑒定。

Sherlock MIS系統(tǒng)作為一種微生物鑒定方法，基于以上原因，雖然未能實現(xiàn)對所有供試DSE菌株的科學(xué)分類鑒定，但本試驗已證實脂肪酸分析法在DSE分類鑒定上的潛能。因此，對于分類系統(tǒng)尚未建立的DSE類群而言，在形態(tài)學(xué)分類基礎(chǔ)上，可通過進一步優(yōu)化脂肪酸分析，結(jié)合分子方法對其科學(xué)分類鑒定。

Reference：

[1] JUMPPONEN A R I,TRAPPE J M.Dark septate endophytes:a review of facultative biotrophic root-colonizing fungi[J].NewPhytologist,1998,140(2):295-310.

[2] MANDYAM K,JUMPPONEN A.Seeking the elusive function of the root-colonising dark septate endophytic fungi[J].StudiesinMycology,2005,53(53):173-189.

[3] RODRIGUEZ R J,WHITE JR J F,ARNOLD A E,etal.Fungal endophytes:diversity and functional roles [J].NewPhytologist,2009,182(2):314-330.

[4] PORRAS-ALFARO A,BAYMAN P.Hidden fungi,emergent properties:endophytes and microbiomes [J].Phytopathology,2011,49(1):291.

[5] KOVACS G M,SZIGETVARI C.Mycorrhizae and other root-associated fungal structures of the plants of a sandy grassland on the great hungarian plain [J].Phyton(Horn,Austria),2002,42(2):211-224.

[6] KHIDIR H H,EUDY D M,PORRAS-ALFARO A,etal.A general suite of fungal endophytes dominate the roots of two dominant grasses in a semiarid grassland [J].JournalofAridEnvironments,2010,74(1):35-42.

[7] ZHAN F,HE Y,LI T,etal.Tolerance and antioxidant response of a dark septate endophyte (DSE),exophiala pisciphila,to cadmium stress [J].BulletinofEnvironmentalContaminationandToxicology,2015,94(1):96-102.

[8] XU R,LI T,CUI H,etal.Diversity and characterization of Cd-tolerant dark septate endophytes (DSEs) associated with the roots of Nepal alder (Alnusnepalensis) in a metal mine tailing of southwest China [J].AppliedSoilEcology,2015,93:11-18.

[9] SIEBER T,GRüNIG C.Biodiversity of fungal root-endophyte communities and populations,in particular of the dark septate endophytePhialocephalafortiniis.l.[J].MicrobialRootEndophytes,2006,9:107-132.

[10] 徐風(fēng)美,王春燕,褚洪龍,等.松萎蔫病發(fā)生區(qū)和未發(fā)生區(qū)油松根部真菌群落研究[J].西北植物學(xué)報,2014,34(8):1627-1634.

XU F M,WANG CH Y,CHU H L,etal.Research on root fungal community ofPinustabuliformisin pine wilt disease damaged and undamaged areas [J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2014,34(8):1627-1634(in Chinese with English abstract).

[12] FOSTER A L,MUNK L,KOSKI R A,etal.Relationships between microbial communities and environmental parameters at sites impacted by mining of volcanogenic massive sulfide deposits,Prince William Sound,Alaska [J].AppliedGeochemistry,2008,23(2):279-307.

[13] ABEL K,PETERSON J I.Classification of microorganisms by analysis of chemical composition I.Feasibility of utilizing gas chromatography [J].JournalofBacteriology,1963,85(5):1039-1044.

[14] MOSCA A,RUSSO F,MIRAGLIOTTA L,etal.Utility of gas chromatography for rapid identification of mycobacterial species frequently encountered in clinical laboratory [J].JournalofMicrobiologicalMethods,2007,68(2):392-395.

[15] 劉國紅,劉 波,林營志,等.基于脂肪酸生物標(biāo)記與 16S rRNA 的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析比較[J].生物技術(shù)通報,2015,31(3):146-153.

LIU G H,LIU B,LIN Y ZH,etal.The comparsion ofBacillusspecies classification based on fatty acid and 16S rRNA gene [J].BiotechnologyBulletin,2015,31(3):146-153(in Chinese with English abstract).

[16] 曹艷峰,李 彥,李晨華,等.荒漠灌木梭梭 (Haloxylonammodendron) 周圍土壤微生物的空間分布[J].生態(tài)學(xué)報,2016,36(6):1628-1635.

CAO Y F,LI Y,LI CH H,etal.The spatial distribution of soil microbes around a desert shrub ofHaloxylonammodendron[J].ActaEcologicaSinica,2016,36(6):1628-1635( in Chinese with English abstract).

[17] 王秋紅,陳 亮,林營志,等.福建省青枯雷爾氏菌脂肪酸多態(tài)性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,39(8):1675-1687.

WANG Q H,CHEN L,LIN Y ZH,etal.Polymorphism of fatty acid ofRalstoniasolanacearumin Fujian province [J].ScientiaAgriculturaSinica,2007,39(8):1675-1687(in Chinese with English abstract).

[18] THOMPSON J D,GIBSON T J,PLEWNIAK F,etal.The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J].NucleicAcidsResearch,1997,25(24):4876-4882.

[19] TAMURA K,DUDLEY J,NEI M,etal.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J].MolecularBiologyandEvolution,2007,24(8):1596-1599.

[20] TAMURA K,NEI M,KUMAR S.Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004,101(30):11030-11035.

[21] 張玉潔.植物深色有隔內(nèi)生真菌 (DSE) 的研究進展[J].文山學(xué)院學(xué)報,2010,23(1):145-150.

ZHANG Y J.Research advances on dark sepatate endophytes [J].JournalofWenshanUniversity,2010,23(1):145-150(in Chinese with English abstract).

[22] 劉茂軍 張興濤 趙之偉.深色有隔內(nèi)生真菌 (DSE) 研究進展[J].菌物學(xué)報,2009,28(6):888-894.

LIU M J,ZHANG X T,ZHAO ZH W.Advances in the research of dark septate endophytes [J].Mycosystema,2009,28(6):888-894(in Chinese).

[23] 陳劍山,鄭服叢.ITS 序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(13):3785-3786.

CHEN J SH,ZHENG F C.Application of ITS Sequences in fungi classification and identification [J].JournalofAnhuiAgriculturalSciencis,2007,35(13):3785-3786(in Chinese with English abstract).

[24] WHITE D C,DAVIS W M,NICKELS J S,etal.Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate[J].Oecologia,1979,40(1):51-62.

[25] 吳愉萍,徐建明,汪海珍,等.Sherlock MIS 系統(tǒng)應(yīng)用于土壤細(xì)菌鑒定的研究[J].土壤學(xué)報,2006,43(4):642-647.

WU Y P,XU J M,WANG H ZH,etal.Application of sherlock mis in identification of soil bacteria[J].ActaPedologicaSinica,2006,43(4):642-647(in Chinese with English abstract).

[26] 黃朱梁,裘迪紅.MIDI Sherlock 微生物自動鑒定系統(tǒng)鑒定方法的建立-以貽貝中分離的蠟樣芽胞桿菌為例[J].寧波大學(xué)學(xué)報(理工版),2011,24(2):8-13.

HUANG ZH L,QIU D H.Identification ofBacilluscereusseparated from mussels using MIDI sherlock microorganism auto identification system [J].OurnalofNingboUniversity(Nsee),2011,24(2):8-13(in Chinese with English abstract).

[27] 陳曉芬,李忠佩,劉 明,等.長期施肥處理對紅壤水稻土微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志,2015.34(7):1815-1822.

CHEN X F,LI ZH P,LIU M,etal.Effect of long-term fertilizations on microbial community structure and functional diversity in paddy soil of subtropical China[J].ChineseJounralofEcology,2015,34(7):1815-1822(in Chinese with English abstract).

[28] CHANG E H,CHEN T H,TIAN G,etal.The effect of altitudinal gradient on soil microbial community activity and structure in moso bamboo plantations[J].AppliedSoilEcology,2016,98:213-220.

[29] 秦巧玲,粟婉媛,呂 均,等.GC-MS 聯(lián)用分析測定志賀菌全細(xì)胞脂肪酸組成[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(3):426-428.

QIN Q L,SU W Y,LU J,etal.GC-MS analysis of fatty acid from whole cell ofShigella[J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,2008,18(3):426-428(in Chinese with English abstract).

[30] HILL T C J,MCPHERSON E F,HARRIS J A,etal.Microbial biomass estimated by phospholipid phosphate in soils with diverse microbial communities[J].SoilBiologyandBiochemistry,1993,25(12):1779-1786.

[31] 周莉娜,蘇潤華,馬思佳,等.基于PLFA 法分析亞硝氮,硝氮和氨氮對厭氧微生物細(xì)菌群落的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2016,36(2):499-505.

ZHOU L N,SU R H,MA S J,etal.Effects of nitrite，nitrate and ammonia nitrogen on anaerobic microbial community characterized by using phospholipid fatty acid PLFA method[J].ActaScientiaeCircumstantiae,2016,36(2):499-505.

(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Phospholipid Fatty Acid Biomarkers of Dark Septate Endophytes in Roots ofAmmopiptanthusmongolicus

WANG Shaojie,ZUO Yiling,XUE Zike and HE Xueli

(College of Life Sciences,Hebei University,Baoding Hebei 071002,China)

To explore application of phospholipid fatty acid (PLFA) biomarkers in dark septate endophytes (DSE) classification,identification and detection of soil microorganisms,root samples ofAmmopiptanthusmongolicuswere collected from Yinchuan,Shapotou,Minqin and Wuhai in northwestern China.DSE strains were isolated from roots and identified by morphology and ITS sequence analysis.DSE fatty acid composition was detect by Sherlock Microbial Identification System (Sherlock MIS).A total of 12 DSE strains were separated from 4 sites,which it could be diveided into 7 genera and 7 species .The 91 known fatty acids and 12 Summed Feature were detected by the Sherlock MIS,and C14acid,C16acid and C17acid were the major fatty acids of DSE.Of these,16∶0,16∶1 Cis 9 (ω7),18∶2 CIS 9,12 / 18∶0a,18∶0 and Summed Feature 8 were the total fatty acids.Some of the strains also had the specific fatty acid composition,and specific fatty acids could be used as a biomarker for the detection of soil microorganisms.12 strains of DSE were divided into 4 groups by fatty acid analysis,and 3 strains of DSE were identified to the species.This study suggested that PLFAs biomarkers could be used as DSE classification identification indicators,and provided a basis for the detection of soil microorganisms.

DSE; Phospholipid fatty acids;Biomarker

WANG Shaojie,male,master student.Research area:biology of mycorrhizal fungi.E-mail:wsj663@163.com

HE Xueli,male,professor,doctoral supervisor.Research area:ecology and biology of mycorrhizal fungi.E-mail:xuelh1256@aliyun.com

日期：2017-05-22

2016-05-03

2016-06-18

國家自然科學(xué)基金(31170488)。

王少杰，男，碩士研究生，從事菌根生物學(xué)研究。E-mail:wsj663@163.com

賀學(xué)禮，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事菌根生物學(xué)與生態(tài)學(xué)研究。E-mail:xuelh1256@aliyun.com

Q939.96

A

1004-1389(2017)05-0781-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.036.html

Received 2016-05-03 Returned 2016-06-18

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31170488).