H2S可能作為H2O2的上游信號(hào)介導(dǎo)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)竹根姜對(duì)青枯菌的抗性

周大祥，熊 書

(1.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶萬(wàn)州 404100；2.重慶大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶市基因功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400300；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶萬(wàn)州 404120)

H2S可能作為H2O2的上游信號(hào)介導(dǎo)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)竹根姜對(duì)青枯菌的抗性

周大祥1,2，熊 書3

(1.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶萬(wàn)州 404100；2.重慶大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶市基因功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400300；3.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶萬(wàn)州 404120)

為探討H2S和H2O2在茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)竹根姜抗姜瘟病過程中的上下游關(guān)系，以竹根姜幼苗為研究對(duì)象，采用MeJA、NH2OH+MeJA、AsA+MeJA、無(wú)菌水等進(jìn)行噴霧，觀察竹根姜發(fā)病情況，并對(duì)H2S、H2O2、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和木質(zhì)素等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，MeJA處理可以顯著降低竹根姜的病情指數(shù)，提高抗病性，而H2S合成抑制劑NH2OH和H2O2清除劑AsA均抑制MeJA誘導(dǎo)的抗病效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能夠明顯促進(jìn)H2S(主要由半胱氨酸脫巰基酶合成)和H2O2的合成以及半胱氨酸脫巰基酶的活性，提高木質(zhì)素合成相關(guān)酶(PAL和POD)活性，促進(jìn)木質(zhì)素合成。H2S合成抑制劑NH2OH可降低半胱氨酸脫巰基酶的活性并抑制H2S和H2O2的產(chǎn)生，而H2O2清除劑AsA可抑制H2O2的產(chǎn)生，但對(duì)H2S的合成和半胱氨酸脫巰基酶的活性沒有影響。由此證明，H2S可能作為H2O2的上游信號(hào)參與竹根姜對(duì)MeJA的響應(yīng)。MeJA在竹根姜細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效的信號(hào)傳導(dǎo)，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)分子H2S和H2O2的產(chǎn)生，激活木質(zhì)素合成相關(guān)酶的活性，促進(jìn)木質(zhì)素的合成，提高竹根姜對(duì)青枯菌的抗性。

硫化氫；過氧化氫；茉莉酸甲酯；竹根姜；青枯菌

茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(methyl jasmonate，MeJA)作為外源信號(hào)分子，已被證明能夠廣泛誘導(dǎo)植物的抗病反應(yīng)[1]。大量的研究結(jié)果表明，外源施用JA或MeJA可有效誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)和木質(zhì)素的合成，進(jìn)而提高植物抗病性[2]。硫化氫(hydrogen sulphide,H2S)是一種近年來發(fā)現(xiàn)的信號(hào)分子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]和逆境脅迫[4-5]中起重要作用。植物主要通過L/D-半胱氨酸脫巰基酶催化半胱氨酸分解成H2S[6]。對(duì)甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)抵御病原體入侵的研究證實(shí)，來自L-半胱氨酸脫巰基酶的H2S起重要作用[7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，H2S作為信號(hào)分子在植物的抗病應(yīng)答[8]中起重要作用。前期研究結(jié)果表明，0.1 mmol·L-1的MeJA處理可顯著誘導(dǎo)竹根姜內(nèi)源信號(hào)分子H2S和H2O2的迸發(fā)，降低姜瘟病的發(fā)生[9]。但H2S和H2O2之間的關(guān)系以及它們與木質(zhì)素合成的關(guān)系還不清楚。因此，本研究以竹根姜為材料，探討H2S和H2O2在MeJA誘導(dǎo)竹根姜抗姜瘟病過程中的上下游關(guān)系及其對(duì)木質(zhì)素合成的影響，有望解決MeJA誘導(dǎo)竹根姜抗病機(jī)制上值得探討和尚待明確的問題。

1 材料與方法

1.1 材 料

姜瘟病病原菌為青枯菌(Ralstoniasolanacearum)，致病性姜青枯菌于2013年6月自重慶市榮昌縣盤龍鎮(zhèn)三合村罹病竹根姜分離，4號(hào)生理小種，生化型為Ⅳ型，TTC培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，酸水解酪蛋白1 g，葡萄糖5 g，瓊脂18 g，加水至1 000 mL，pH7.0，滅菌放涼加入過濾滅菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的TTC 5 mL)培養(yǎng)，菌懸液接種竹根姜后鑒定為致病性姜青枯菌。供試竹根姜為四川地方品種，竹根姜無(wú)菌苗由重慶文理學(xué)院陳澤雄提供，竹根姜無(wú)菌苗栽種于珍珠巖和泥炭土體積比為3∶7的基質(zhì)中，溫度28～30 ℃、16 h·d-1光照(2 000～3 000 lx)，相對(duì)濕度60%～80%，竹根姜生長(zhǎng)至5～7葉時(shí)，莖基部注射接種。同時(shí)配制0.1 mmol·L-1的MeJA水溶液、0.8 mmol·L-1的H2S合成抑制劑羥胺(hydroxylamine,NH2OH)和1 mmol·L-1的H2O2清除劑抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)水溶液(均購(gòu)于Sigma公司)，過濾滅菌。

1.2 姜青枯菌培養(yǎng)

致病性姜青枯菌在NA液體培養(yǎng)基上搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，配成3×108mL-1菌懸液，備用。

1.3 MeJA誘導(dǎo)竹根姜對(duì)姜瘟病的抗性

試驗(yàn)設(shè)置4組處理:①單獨(dú)用MeJA噴霧處理竹根姜葉片，保濕24 h；②NH2OH噴霧處理竹根姜葉片保濕24 h后,再用MeJA噴霧處理保濕24 h；③AsA噴霧處理竹根姜葉片保濕24 h后,再用MeJA噴霧處理保濕24 h；④無(wú)菌水噴霧處理為對(duì)照。2 d后再接種致病性姜青枯菌液0.5 mL，15 d后按姜瘟病5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載病級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)和誘抗效果[10]，每個(gè)處理各10株，重復(fù)3次。

1.4 MeJA誘導(dǎo)機(jī)制研究

1.4.1 處 理 各處理同“1.3”，2 d后再接種致病性姜青枯菌液0.5 mL，分別于0、2、4、6、9、12和15 d取樣竹根姜塊，-80 ℃保存，備用。每個(gè)處理重復(fù)3次，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

1.4.2 H2S質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定 H2S的質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定根據(jù)Sekiya等[11]的亞甲基藍(lán)法，在670 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果單位為nmol·g-1。

1.4.3 H2O2質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定 H2O2質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定按照J(rèn)iang等[12]的方法進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果單位為nmol·g-1。

1.4.4 半胱氨酸脫巰基酶活性測(cè)定 半胱氨酸脫巰基酶活性的測(cè)定是通過測(cè)定半胱氨酸(含二硫蘇糖醇：DTT)釋放的H2S來實(shí)現(xiàn)的。半胱氨酸脫巰基酶活性的測(cè)定參考Riemenschneider等[13]的方法，略有改動(dòng)。取0.1 g竹根姜塊，加0.9 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)勻漿,離心取上清。1 mL的反應(yīng)體系包括:0.4 mL 0.6 mmol·L-1半胱氨酸、0.2 mL 2.5 mmol·L-1DTT、0.3 mL 100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 9.0)和0.1 mL的上清液。加入半胱氨酸后置于37 ℃反應(yīng)40 min，最后加入100 μL 30 mmol·L-1的FeCl3(溶于1.2 mol·L-1的HCl)和100 μL 30 mmol·L-1的N,N-二甲基-對(duì)苯二胺(溶于7.2 mol·L-1的HCl)終止反應(yīng)。在670 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果單位為nmol·g-1·min-1。

1.4.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)活性測(cè)定 參照Moerschbacher等[14]的方法提取粗酶液，略有改進(jìn)。PAL活性測(cè)定參照薛應(yīng)龍[15]的方法。POD活性測(cè)定參照張志良[16]的方法。

1.4.6 木質(zhì)素濃度測(cè)定 木質(zhì)素的提取和濃度測(cè)定按照Musel等[17]的方法，在280 nm處測(cè)定吸光度值，測(cè)定結(jié)果單位為A·g-1。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA誘導(dǎo)竹根姜對(duì)姜瘟病的抗性

前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，分別用MeJA、NH2OH和AsA噴霧處理后，對(duì)未接種青枯菌的竹根姜生長(zhǎng)沒有影響。用0.1 mmol·L-1的MeJA處理竹根姜幼苗后再接種青枯菌，能夠顯著降低病情指數(shù)(P<0.05)(表1)，提高了竹根姜的抗性。而先用NH2OH或者AsA噴霧后再用MeJA處理，竹根姜的病情指數(shù)較MeJA處理均有所上升，誘抗效果較差。

表1 MeJA誘導(dǎo)竹根姜對(duì)姜瘟病的抗性

注：同一列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Values followed by different letters in the same column are significantly different(P<0.05).The same as below.

2.2 H2S合成抑制劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)的竹根姜H2S質(zhì)量摩爾濃度及半胱氨酸脫巰基酶活性的影響

研究結(jié)果表明，0.1 mmol·L-1的MeJA可誘導(dǎo)竹根姜H2S質(zhì)量摩爾濃度和半胱氨酸脫巰基酶活性明顯上升，且在處理2 d達(dá)到最大值，其后一直保持在較高水平；NH2OH可顯著抑制半胱氨酸脫巰基酶的活性，進(jìn)而抑制H2S的合成(圖1)。由此證明，半胱氨酸脫巰基酶參與MeJA誘導(dǎo)的H2S的合成。

圖1 H2S合成抑制劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)竹根姜H2S質(zhì)量摩爾濃度及半胱氨酸脫巰基酶活性的影響

2.3 H2S合成抑制劑和H2O2清除劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)竹根姜H2O2質(zhì)量摩爾濃度變化的影響

如圖2所示，MeJA處理的竹根姜內(nèi)源H2O2質(zhì)量摩爾濃度急劇升高，且始終保持在較高水平；同時(shí)，NH2OH和AsA能顯著逆轉(zhuǎn)MeJA誘導(dǎo)的竹根姜H2O2質(zhì)量摩爾濃度增加。由此推測(cè)H2S介導(dǎo)MeJA誘導(dǎo)的H2O2合成。

圖2 H2S合成抑制劑和H2O2清除劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)竹根姜H2O2質(zhì)量摩爾濃度變化的影響

2.4 H2O2清除劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)的竹根姜H2S質(zhì)量摩爾濃度及半胱氨酸脫巰基酶活性的影響

研究結(jié)果表明，AsA對(duì)MeJA誘導(dǎo)的H2S產(chǎn)生和半胱氨酸脫巰基酶活性的增加都沒有影響(圖3)。由此證明H2S可能作為H2O2的上游信號(hào)參與竹根姜對(duì)MeJA的響應(yīng)。

2.5 H2S合成抑制劑和H2O2清除劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)的竹根姜木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性的影響

PAL是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，參與木質(zhì)素、植保素和酚類物質(zhì)的合成，其活性與植物抗病性密切相關(guān)。POD在植物細(xì)胞壁的交聯(lián)、木質(zhì)素的合成與積累中起重要作用。

用MeJA、NH2OH和AsA處理竹根姜，15 d內(nèi)木質(zhì)素合成相關(guān)酶PAL和POD活性的變化如圖4所示。無(wú)菌水噴霧處理的2種酶活性比較穩(wěn)定，MeJA處理后PAL和POD活性在前期迅速升高，第9天達(dá)到峰值，其后一直保持在較高水平。先用NH2OH或AsA噴霧后再用MeJA處理，PAL和POD的活性接近對(duì)照，說明PAL和POD的活性受到抑制。結(jié)果表明，MeJA處理短時(shí)間提高胞內(nèi)H2S和H2O2質(zhì)量摩爾濃度，進(jìn)而激活木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，促進(jìn)木質(zhì)素的合成，提高竹根姜的抗病性。NH2OH和AsA可顯著抑制MeJA誘導(dǎo)的PAL和POD活性的增加。

2.6 MeJA、NH2OH和AsA處理后竹根姜木質(zhì)素濃度的動(dòng)態(tài)變化

MeJA、NH2OH和AsA處理后，竹根姜木質(zhì)素濃度的變化見圖5。MeJA處理的竹根姜，與對(duì)照相比木質(zhì)素的積累非常明顯，在第12天達(dá)到峰值，隨后略微降低。NH2OH和AsA可顯著抑制MeJA誘導(dǎo)的竹根姜木質(zhì)素的合成。

圖3 H2O2清除劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)竹根姜H2S質(zhì)量摩爾濃度及半胱氨酸脫巰基酶活性變化的影響

圖4 H2S合成抑制劑和H2O2清除劑對(duì)MeJA誘導(dǎo)竹根姜PAL和POD活性的影響

3 討 論

MeJA作為一種誘導(dǎo)因子,參與植物對(duì)病原菌的信號(hào)傳遞和應(yīng)答反應(yīng),在植物抗病反應(yīng)中有著極其重要的作用[18]。Ahn等[19]發(fā)現(xiàn)用0.1 mmol·L-1的MeJA可以有效提高水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性,但有關(guān)MeJA誘導(dǎo)竹根姜對(duì)姜青枯菌的抗病反應(yīng)，尚未有研究報(bào)道。本研究結(jié)果表明，施用0.1 mmol·L-1的MeJA能夠降低竹根姜的病情指數(shù)，提高竹根姜對(duì)姜瘟病的抗性，而NH2OH和AsA會(huì)抑制MeJA誘導(dǎo)的抗病效果。

研究表明，植物體內(nèi)含有抗病防衛(wèi)基因，這些基因翻譯特定的防衛(wèi)蛋白，當(dāng)植物體內(nèi)的MeJA迅速積累達(dá)到正常水平的數(shù)十倍時(shí)，即誘導(dǎo)植物的抗病性反應(yīng),包括激活病程相關(guān)蛋白、促進(jìn)木質(zhì)素、植保素和酚類積累。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MeJA或JA需要多級(jí)信號(hào)分子傳導(dǎo)才能充分誘導(dǎo)植物的抗病性反應(yīng)[20]，目前已證實(shí)，H2O2和H2S是植物體內(nèi)主要的兩種信號(hào)傳遞分子。作為活性氧自由基的H2O2，可在植物受到病原菌侵染或激發(fā)子誘導(dǎo)時(shí)大量產(chǎn)生(活性氧迸發(fā))，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上激活植物體內(nèi)各種防衛(wèi)基因的表達(dá)，進(jìn)而傳遞誘導(dǎo)下游防御反應(yīng)如木質(zhì)素(細(xì)胞壁的強(qiáng)化)、植保素的合成和病程相關(guān)蛋白的積累[21]。H2S作為一種新發(fā)現(xiàn)的信號(hào)分子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]和抗病應(yīng)答[8]中起重要作用。

研究表明，在植物中H2O2和H2S存在相互作用，比如在狗牙根中H2S可通過改變H2O2的水平抵御干旱脅迫[5]。那么竹根姜在抗病過程中H2O2與H2S又存在怎樣的關(guān)系呢？本試驗(yàn)結(jié)果顯示，H2S合成抑制劑NH2OH可抑制MeJA引起的H2S和H2O2質(zhì)量摩爾濃度以及半胱氨酸脫巰基酶活性的增加。H2O2清除劑AsA對(duì)MeJA引起的H2S產(chǎn)生和半胱氨酸脫巰基酶活性的增加都沒有影響，但可抑制H2O2的產(chǎn)生。由此證明H2S可能作為H2O2的上游信號(hào)參與竹根姜對(duì)MeJA的響應(yīng)。

結(jié)果還說明，MeJA在竹根姜細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效的信號(hào)傳遞，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)分子H2S和H2O2的水平，將抗病信號(hào)傳遞并放大到整個(gè)植株，進(jìn)而激活木質(zhì)素合成相關(guān)酶(PAL和POD)，促進(jìn)木質(zhì)素的合成，提高竹根姜的抗病性。目前H2S在植物生命活動(dòng)中的作用機(jī)制研究剛剛開始，今后還需要提供更多的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方面的證據(jù)證實(shí)其功能。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

H2S Functions an Upstream Signal before H2O2in Methyl Jasmonic-induced Resistance of ‘Zhugenjiang’ Ginger (ZingiberofficinaleRoscoe) toRalstoniasolanacearum

ZHOU Daxiang1,2and XIONG Shu3

(1.College of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou Chongqing 404100, China; 2.Chongqing Key Lab of Genetic Function and Regulation, College of Life Science, Chongqing University, Chongqing 400030, China; 3.Department of Basic Medicine, Chongqing Three Gorges Medical College, Wanzhou Chongqing 404120, China)

To explore the role of H2S and H2O2in the induced resistance of Bacterial Wilt of Ginger in ‘Zhugenjiang’ ginger with methyl jasmonate (MeJA), the seedlings of ‘Zhugenjiang’ ginger were treated with MeJA, NH2OH+MeJA, AsA+MeJA and sterile water, and incidence of disease were observed and several biological resistance components(H2S, H2O2, PAL, POD and lignin) were determined. The results showed that significantly low disease indexes of ‘Zhugenjiang’ ginger were detected in the treatment of MeJA, and the induced disease resistances of MeJA were inhibited by hydroxylamine (NH2OH) functioning as H2S synthesis inhibitor and ascorbic acid (AsA) served as H2O2scavenger. Further study showed that the synthesis of H2S (mainly be synthesized by cysteine desulfhydrase) and H2O2, the activity of cysteine desulfhydrase, the activation of lignin synthases (PAL and POD) were significantly promoted. NH2OH could reduce the activity of cysteine desulfhydrase and inhibit the synthesis of H2O2and H2S. AsA could inhibit the synthesis of H2O2, and it had no effect on the synthesis of H2S and the activity of cysteine desulfhydrase. These results indicated that H2S may play a role in the response of MeJA to disease-resistant as an upstream signal of H2O2. By regulating the levels of H2S and H2O2, MeJA can activates the activity of lignin biosynthesis enzymes, promote the synthesis of lignin, and increase resistance againstRalstoniasolanacearum.

Hydrogen sulphide; Hydrogen peroxide; Methyl jasmonate; ‘Zhugenjiang’ ginger(ZingiberofficinaleRoscoe);Ralstoniasolanacearum

ZHOU Daxiang, male,associate professor,Ph.D. Research area:plant physiology research. E-mail：675753786@qq.com

XIONG Shu,female,lecturer.Research area:plant physiology research.E-mail:dqzhou79@163.com

日期：2017-05-22

2016-03-20

2016-05-07

重慶市自然科學(xué)基金(cstc2016jcyjA2132)；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ1502601)；重慶三峽學(xué)院院級(jí)重點(diǎn)項(xiàng)目。

周大祥，男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锷韺W(xué)。E-mail：675753786@qq.com

熊 書，女，講師，研究方向?yàn)橹参锷韺W(xué)。E-mail:dqzhou79@163.com

Q945.79

A

1004-1389(2017)05-0775-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.034.html

Received 2016-03-20 Returned 2016-05-07

Foundation item The Natural Science Foundation of Chongqing(No.cstc2015jcyjA1211);Scientiffc and Technological Research Program of Chongqing Municipal Education Commission(No. KJ1502601); the Key Project of Chongqing Three Gorges University.