二穗短柄草 FRUITFULL1基因表達(dá)分析及RNA干擾和過表達(dá)載體的構(gòu)建

李海峰，韓 英，王冰華

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100；2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

二穗短柄草 FRUITFULL1基因表達(dá)分析及RNA干擾和過表達(dá)載體的構(gòu)建

李海峰1,2，韓 英2，王冰華2

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100；2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為了揭示 BdFUL1的生物學(xué)功能，利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法，分析二穗短柄草轉(zhuǎn)錄因子 FRUITFULL1-2( BdFUL1-2)的結(jié)構(gòu)、序列特征以及與不同植物 AP1/FUL的親緣關(guān)系，構(gòu)建進(jìn)化樹。利用定量RT-PCR等分子生物學(xué)方法，分析非生物逆境和外源激素處理條件下兩個轉(zhuǎn)錄本 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達(dá)水平。結(jié)果表明： BdFUL1屬于典型的植物MADS-box基因，與小麥的 WFUL1有很近的親緣關(guān)系；在高溫、低溫、干旱脅迫以及不同激素ABA、6-BA和SA處理下， BdFUL1-1的表達(dá)水平顯著升高，暗示 BdFUL1可能通過激素信號傳導(dǎo)而參與響應(yīng)非生物脅迫。同時，構(gòu)建 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的RNA干擾和過表達(dá)載體。

短柄草；FRUITFULL；非生物脅迫；RNA干擾；過表達(dá)

FUL(FRUITFULL) 基因?qū)儆谥参?AP1/FUL的FUL亞家族，是被子植物所特有的[1]。在模式植物擬南芥，糧食作物水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)，果蔬類作物番茄(Solanumlycopersicum) 基因組中都有FUL同源基因存在。在木本植物桃樹(Prunuspersica)、蘋果(MalusdomesticaBorkh) 和葡萄(Vitisvinifera) 等基因組中也發(fā)現(xiàn)有FUL同源基因[2]。

擬南芥中,FRUITFULL(FUL)基因和APETALA1(AP1)以及CAL一起調(diào)控花分生組織的發(fā)育。同時，在花發(fā)育早期和花發(fā)育晚期，F(xiàn)UL基因分別調(diào)控花序分生組織和心皮及角果的發(fā)育[3]。

在普通小麥中有3個FUL-LIKE同源基因： WFUL1(VRN1)、 WFUL2和 WFUL3。 WFUL1(VRN1) 是應(yīng)答低溫誘導(dǎo)、參與春化作用的特征基因[4]； WFUL2和B類以及E類基因相互作用，可能具有A類基因的功能。進(jìn)一步研究表明 WFUL1可能通過上調(diào) WFUL3基因，促進(jìn)植物開花[5]。

水稻基因組中有3個FUL-LIKE亞家族成員，分別為 OsMADS14、 OsMADS15、 OsMADS18。 OsMADS15突變體dep內(nèi)稃皺縮，嚴(yán)重失去內(nèi)稃的主要結(jié)構(gòu)，而只發(fā)育形成兩側(cè)的邊緣結(jié)構(gòu)，同時外稃和穎片伸長[6]，這說明 OsMADS15/DEP在內(nèi)稃的發(fā)育上起著主要作用。另外， OsMADS14、 OsMADS15、 OsMADS18和 OsMADS34冗余的調(diào)控營養(yǎng)階段向生殖階段的過渡[7]。

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)是一種廣泛生長在溫帶的一年生草類植物。由于體型矮小，易于種植，生命周期短，基因組比較小等特點，2001年Draper等率先建議把短柄草作為模式植物開展研究[8]。二倍體基因型 Bd-21基因組測序已經(jīng)完成，預(yù)測到25 532個編碼蛋白質(zhì)的基因[9]。

短柄草基因組中有3個FUL-LIKE基因，分別為 BdFUL1、 BdFUL2a和 BdFUL2b基因[10]。其中 FUL1和水稻中的 OsMADS14同源。在前期研究中，竇艷華等[11]克隆二穗短柄草 BdFUL1基因的cDNA序列，分析該基因的可變剪接和表達(dá)模式。在此基礎(chǔ)上，本研究分析高溫、低溫、NaCl、PEG、ABA、6-BA、SA脅迫處理條件下兩個轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，并構(gòu)建該基因的RNA干擾和過表達(dá)載體，為進(jìn)一步解析該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

二穗短柄草 Bd-21，剝?nèi)ネ怙蛢?nèi)稃的種子，放置于人工氣候箱的培養(yǎng)皿中，26 ℃、光照16 h催芽萌發(fā)；1周后移栽到裝有營養(yǎng)基質(zhì)的小盆中，4 ℃春化室春化2周，然后移入西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室人工氣候室。生長條件為26 ℃光照16 h；22 ℃暗培養(yǎng)8 h。抽穗后3 d取小穗提取總RNA。脅迫處理選用水培2周的幼苗。培養(yǎng)條件同樣為26 ℃光照16 h；22 ℃暗培養(yǎng)8 h。

1.2 方 法

1.2.1 序列分析 運用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Blast搜索同源的蛋白質(zhì)序列，并進(jìn)行同源序列比對。運用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對。運用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 引物的設(shè)計 引物設(shè)計運用Primer Premier 5 軟件，定量引物BDF1DLPF、BdF1DLPR1、BdF1DLPR2,RNAi載體引物BDF1IFPF1、BDF1IFPR1、BDF1IFPF2、BDF1IFPR2和過表達(dá)載體引物BdF1OF、BdF1OR1、BdF1OR2的設(shè)計參照 BdFUL1基因組序列以及成熟mRNA BdFUL1-1和 BdFUL1-2的不同拼接位點(表1)。

表1 引物序列

1.2.3 脅迫處理條件下表達(dá)水平的分析 選用水培2周的幼苗進(jìn)行各種非生物脅迫處理。冷脅迫處理為4 ℃，熱脅迫處理為45 ℃，干旱脅迫處理用0.2 g/mL PEG-6000，鹽脅迫處理用 200 mmol/L NaCl，激素處理分別為100 mol/L ABA、20 μmol/L 6-BA和1 mmol/L SA。取材時間點為處理2 h，冷脅迫和熱脅迫處理取幼苗葉片，其他脅迫處理取幼苗的根，提取RNA，26 ℃未脅迫處理的幼苗作為對照。

RNA的提取運用Trizol(上海生工生物工程有限責(zé)任公司)方法，按照說明書操作。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit,Fermentas,Canada)合成第1鏈cDNA，按照說明書操作。qRT-PCR方法參照文獻(xiàn)[11]，具體如下：用CFX96 Real-time PCR detection Systems,按照SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)操作說明進(jìn)行熒光定量RT-PCR。PCR反應(yīng)體系15 μL,含0.5 μL cDNA(5.0 ng/μL),7.5 μL SYBR Premix ExTaq(2×,上海生工生物有限工程公司),各0.75 μL上、下游引物(10 pmol/μL),ddH2O 5.5 μL。擴增條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,55 ℃退火30 s,40個循環(huán); 65 ℃延伸10 s，共61個循環(huán)。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)和3次試驗重復(fù)。按竇艷華等[11]描述的方法分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 RNAi載體的構(gòu)建 中間載體選用改造后在多克隆位點連接上GUS內(nèi)含子的pBSK載體，最終載體選用上海交通大學(xué)楊洪全教授實驗室改造的雙元載體pHB。 PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后，先用NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，連接到同樣雙酶切的pBSK上。PCR產(chǎn)物再用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，連接到同樣雙酶切的上步重組pBSK質(zhì)粒上。第二步重組的質(zhì)粒和pHB分別用HindⅢ和SacⅠ雙酶切，連接。陽性克隆分別用菌落PCR或雙酶切鑒定并經(jīng)測序確認(rèn)。

1.2.5 過表達(dá)載體的構(gòu)建 載體同樣選用雙元載體pHB，PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切,連接到同樣雙酶切的pHB載體上。陽性克隆分別用菌落PCR和雙酶切鑒定并經(jīng)測序確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

根據(jù)竇艷華等[11]克隆得到的 BdFUL1基因的序列，NCBI的Blastp分析結(jié)果表明 BdFUL1-2屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族，具有MADS-box和K-box兩個保守的功能結(jié)構(gòu)域(如圖1)。將 BdFUL1基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線分析和BLAST比對發(fā)現(xiàn)， BdFUL1-2與小麥、水稻、玉米FUL-LIKE轉(zhuǎn)錄因子有較高的同源性，其中與小麥 WFUL1同源性最高，達(dá)到87%。

圖1 BdFUL1-2的保守結(jié)構(gòu)域

采用DNAMAN軟件對短柄草、小麥、水稻、玉米、擬南芥、番茄的FUL-like轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多重序列比對。結(jié)果顯示(圖2)，僅氨基末端的MADS-box區(qū)域比較保守，其余區(qū)域則存在明顯差異(圖2)。結(jié)構(gòu)的相似和差異顯示，F(xiàn)UL蛋白的功能既具有保守性又發(fā)生了分化。使用MEGA 5.1軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果表明單子葉和雙子葉植物的FUL-like轉(zhuǎn)錄因子存在差異，單子葉植物的FUL-like轉(zhuǎn)錄因子蛋白存在3個分支。其中 BdFUL1與小麥WFUL1、水稻 OsMADS14、玉米ZMM4和ZMM15從屬于FUL1分支，可能具有相似功能。

2.2 非生物脅迫處理下 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達(dá)水平

運用qRT-PCR的方法，分析 BdFUL1-1、 BdFUL1-2的在各種脅迫處理下的表達(dá)。結(jié)果顯示(圖4)，低溫和高溫脅迫條件下， BdFUL1的兩個可變拼接的表達(dá)量均有所上升，特別是 BdFUL1-1的表達(dá)水平顯著升高，明顯高于對照和同樣條件處理下 BdFUL1-2的表達(dá)水平；ABA、6-BA、SA處理條件下， BdFUL1的兩個可變拼接的表達(dá)量也均有所上升，同時 BdFUL1-1表達(dá)水平明顯高于 BdFUL1-2；NaCl處理條件下, BdFUL1的兩個可變拼接的表達(dá)水平則無明顯變化。

2.3 RNAi載體的構(gòu)建

為了分別沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達(dá)，分別設(shè)計2對引物，擴增不同的cDNA片段，特異的沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2。BDF1IFPF1和BDF1IFPR2組合擴增的片段則同時沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2。圖5-A、5-B、5-C分別顯示RT-PCR擴增得到的的3個cDNA片段，與預(yù)期大小一致。圖5-D顯示3個片段克隆到pMD-18T載體后雙酶切驗證的結(jié)果。圖6-A～6-C為3個不同的片段反向和正向連接到中間載體后，分別用HindⅢ和SacⅠ雙酶切鑒定的結(jié)果，條帶與預(yù)期大小一致。圖6-D是連接到pHB上最終的3個重組載體 BdFUL1-RNAi1、 BdFUL1-RNAi2和 BdFUL1-RNAi3分別用HindⅢ和SacⅠ雙酶切的鑒定結(jié)果，酶切片段分別和圖5-A～5-C泳道的片段一致。在雙酶切鑒定的基礎(chǔ)上，測序結(jié)果顯示序列完全正確，表明成功構(gòu)建了3個RNAi載體。

圖2 FUL蛋白序列比對

AP1/FUL蛋白質(zhì)在NCBI數(shù)據(jù)庫上的登錄號 Accession numbers for AP1/FUL proteins in NCBI：AtAP1：NP_177074；At FUL / At AGL8：NP_568929；At CAL / At AGL10：NP_564243；AtAGL79：NP_189645；SlFUL1：AAM33098；SlFUL2：NP_001294867； OsMADS14：NP_001051300； OsMADS15： NP_001058720 ； OsMADS18：NP_001060225； OsMADS20： AAO92341； BdFUL1/ BdMADS33：AIG21841；BdFUL2/ BdMADS10：ADQ92357； BdFUL3/ BdMADS3：AIG21814 BdMADS31：AIG21840；ZAP1：AAB00081；ZMM3：AAG43200；ZMM4：NP_001105151；ZMM15：ABW84393；WFUL1/VRN1：AAP33790； WFUL2：CAM59049； WFUL3：ABG21009

CK-L：對照幼苗的葉片 Leaves of control seedlings；C-L：低溫處理幼苗的葉片 Leaves of low temperature-treated seedlings；H-L：高溫處理幼苗的葉片 Leaves of high temperature-treated seedlings；CK-R：對照幼苗的根 Roots of control seedlings；PEG-R、NaCl-R、ABA-R、6-BA-R和SA-R：分別表示PEG、NaCl、ABA、6-BA和SA處理幼苗的根 PEGR,NaClR,ABAR,6-BAR and SAR:represent leaves of treated seedlings by PEG,NaCl,ABA,6-BA and SA,respectively

A:引物BDF1IFPF1和BDF1IFPR1擴增的RT-PCR產(chǎn)物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF1 and BDF1IFPR1; B:引物BDF1IFPF2和BDF1IFPR2擴增的RT-PCR產(chǎn)物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF2 and BDF1IFPR2; C:引物BDF1IFPF1和BDF1IFPR2擴增的RT-PCR產(chǎn)物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF1 and BDF1IFPR2; D:3個重組pMD-18T載體NotⅠ和BamHⅠ雙酶切的結(jié)果 NotⅠ and BamHⅠ digestion of three recombinant pMD-18T vectors

A-C：PCR產(chǎn)物反向和正向序列連接到中間載體后HindⅢ和SacⅠ 雙酶切的驗證結(jié)果 Verification with double digestion of bridge vectors by HindⅢ and SacⅠ after RT-PCR products were cloned in forward and reverse direction respectively；D：最終載體HindⅢ和SacⅠ 雙酶切的驗證結(jié)果 Double digestion of final recombinant vector by HindⅢ and SacⅠ

2.4 過表達(dá)載體的構(gòu)建

在構(gòu)建RNA干擾載體的基礎(chǔ)上，同時還構(gòu)建該基因兩個可變拼接的過表達(dá)載體，分別命名為pHB- BdFUL1-1和pHB- BdFUL1-2。

圖7-A顯示RT-PCR擴增得到的FUL1-1和 FUL1-2的序列，片段大小與預(yù)期的633 bp和732 bp一致。圖7-B顯示2個目的片段已經(jīng)分別連接到pHB上,切出與圖7-A同樣大小的條帶。經(jīng)過測序驗證，表明已成功構(gòu)建 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的過表達(dá)載體。

A:編碼cDNA Encoding cDNA；1. BdFUL1-1;2. BdFUL1-2。B：最終重組載體HindⅢ和XbaⅠ 雙酶切結(jié)果 Final recombinant vectors digested by HindⅢ and XbaⅠ;3.pHB- BdFUL1-1；4.pHB- BdFUL1-2;M.DNA Marker

3 討 論

3.1FUL-like基因具有廣泛的生物學(xué)功能

擬南芥FUL基因調(diào)控花序、花分生組織的發(fā)育，還影響心皮、角果和葉片的發(fā)育[3]。小麥 FUL1響應(yīng)春化作用[4]。水稻中FUL基因調(diào)控內(nèi)稃的發(fā)育，更重要的是通過調(diào)控莖端分生組織向花序分生組織的過渡，調(diào)控植物的開花時間[6-7]。

為克隆調(diào)控開花時間的基因，用來進(jìn)行分子育種，選取和水稻 MADS14同源的 BdFUL1進(jìn)行研究。表達(dá)分析結(jié)果表明該基因特別是可變拼接 BdFUL1-1的表達(dá)受高溫、低溫和干旱等非生物脅迫的強烈誘導(dǎo)，暗示該基因可能還參與植物的逆境響應(yīng)。

3.2 非生物脅迫誘導(dǎo) BdFUL1可變剪接的產(chǎn)生

可變剪接，即1個mRNA前體經(jīng)過不同的剪切和拼接產(chǎn)生2個或者多個成熟mRNA的過程。可變剪接是造成生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組多樣性和復(fù)雜性的重要機制[12]。二穗短柄草的基因組較小，重復(fù)序列較少，可變剪接普遍發(fā)生[13]。研究發(fā)現(xiàn)，某些基因在特異的細(xì)胞或者組織中，或者在特定發(fā)育階段，或者在外界環(huán)境改變、受到生物或者非生物脅迫時，發(fā)生可變拼接的機率會更高[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽分、溫度、干旱等環(huán)境脅迫下，小麥Wdreb2、水稻OsDREB2B和玉米ZmDREB2A等DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生可變剪接，從而幫助植物適應(yīng)上述逆境帶來的組織脫水。這表明，可變拼接是禾本科植物響應(yīng)逆境脅迫的一種機制，具有重要作用[15-17]。低溫、高溫、干旱脅迫以及激素處理條件下， BdFUL1基因的兩個可變剪接 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達(dá)量發(fā)生變化，特別是 BdFUL1-1的表達(dá)水平顯著升高，暗示 BdFUL1基因功能可能與應(yīng)答環(huán)境脅迫有關(guān)。但是，非生物脅迫通過什么機制誘導(dǎo) BdFUL1-1水平的升高，還有待深入研究。

3.3 RNA干擾基因功能常用的方法

在研究雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻基因功能時，研究者一般采用正向或者反向遺傳學(xué)策略，去分離鑒定目的基因的突變體，根據(jù)突變體的表型去分析基因的生物學(xué)功能。

短柄草是新型的禾本科模式植物，短柄草基因功能的研究剛剛開始，突變體庫比較少。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是基于雙鏈RNA能夠降解序列特異的目標(biāo)基因mRNA的技術(shù)[18-19]。該技術(shù)問世后在動物植物方面得到廣泛應(yīng)用。運用RNA干擾一次可以沉默一個基因的表達(dá)，也可以同時沉默幾個序列同源基因的表達(dá)。Cui等[20]一次就沉默水稻4個E類基因的表達(dá)，Kobayashi等[21]同時沉默3個水稻A類基因的表達(dá)。在克隆 BdFUL1的cDNA序列，分析其可變拼接和表達(dá)模式的基礎(chǔ)上，為了研究解析其生物學(xué)功能，構(gòu)建3個 BdFUL1的RNAi載體，以期通過轉(zhuǎn)基因的方法去研究 BdFUL1-1和 BdFUL1-2功能上的差別。

致謝：感謝西北農(nóng)林科技大學(xué)陳明訓(xùn)博士對論文修改所提的建議。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Expression Analysis and Construction of RNA Interference and Over-expression Vectors ofBrachypodiumdistachyonFRUITFULL1

LI Haifeng1,2,HAN Ying2and WANG Binghua2

(1.College of Xinjiang Agricultural Vocational & Technical,Changji Xinjiang 831100，China; 2.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

To explore the biological function of transcription factor FRUITFULL1( BdFUL1) fromBrachypodiumdistachyon,we analyzed the structure and the sequence feature of BdFUL1-2,and then constructed phylogenetic tree with methods of bioinformatics and molecular biology to show its genetic relationship with AP1/FUL family genes from other plant species. Moreover,the expression level of BdFUL1-1 and BdFUL1-2 which were under different abiotic stresses and treated with different exogenous plant hormones was analyzed by quantitative RT-PCR. The results indicated that BdFUL1 as a typical MADS-box transcription factor had a close genetic relationship with WFUL1 from wheat. Besides, BdFUL1-1 was significantly induced by different abiotic stresses including heat,coldness,and drought,and different plant hormones such as ABA,6-BA,and SA,it suggested that BdFUL1 should be involved in the response to abiotic stresses through the hormone signaling pathway. In addition,RNA interference and overexpression constructing BdFUL1-1 and BdFUL1-2 were successfully created.

Brachypodiumdistachyon; FRUITFULL; Abiotic stress; RNA interference; Over-expression

LI Haifeng,male,Ph D,professor.Research area:plant molecular biology.E-mail:lhf@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-05-22

2016-05-05

2016-06-10

國家自然科學(xué)基金(31571657);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(2014ZZ009);新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項目(XJNZYKJ201501和XJNZYKJ201512)。

李海峰，男，博士，教授，研究方向為作物分子生物學(xué)。E-mail:lhfxn@sina.cn

Q94; Q7

A

1004-1389(2017)05-0767-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.032.html

Received 2016-05-05 Returned 2016-06-10

Foundation item The National Natural Science Foundation of China(No.31571657);the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.2014ZZ009)；Funds of Xinjiang Agricultural Vocational and Technical College(No.XJNZYKJ201501，No.XJNZYKJ201512).