細胞凋亡蛋白抑制因子2在乙型肝炎相關(guān)性肝癌患者中的表達意義

李林豐，崔麗娟，劉 智，夏 勤，秦海銀，何 嬌

(遂寧市中心醫(yī)院病理科,四川遂寧 629000)

論著·臨床研究

細胞凋亡蛋白抑制因子2在乙型肝炎相關(guān)性肝癌患者中的表達意義

李林豐，崔麗娟△，劉 智，夏 勤，秦海銀，何 嬌

(遂寧市中心醫(yī)院病理科,四川遂寧 629000)

目的 研究細胞凋亡蛋白抑制因子2(cIAP2)在乙型肝炎(簡稱乙肝)和非乙肝相關(guān)性肝癌患者中表達的意義。方法 收集該院肝癌切除術(shù)患者的病例資料和組織標本，分別利用免疫組織化學和Western blot方法檢測患者肝癌癌灶、癌旁和遠癌旁肝組織的cIAP2蛋白表達情況。結(jié)果 在兩組患者中肝癌癌灶、癌旁和遠癌旁肝組織中，cIAP2的表達量依次下降。但是，在非乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠癌旁肝組織的cIAP2表達顯著低于肝癌癌灶和癌旁，而在乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠癌旁肝組織的cIAP2表達量與癌旁的cIAP2表達量無明顯差異，卻低于癌灶的cIAP2表達量。結(jié)論 cIAP2是引起乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生的重要機制之一，可作為乙肝相關(guān)性肝癌患者抑制肝癌發(fā)展和清除乙肝病毒潛在的治療靶點。

癌,肝細胞；肝炎病毒，乙型；細胞凋亡蛋白抑制因子2

乙型肝炎(簡稱乙肝)病毒(hepatitis B virus，HBV)是肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生的主要危險因素[1]。經(jīng)手術(shù)治療后的乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者體內(nèi)HBV仍持續(xù)復制，是肝癌治療耐受的主要因素[2]。細胞凋亡蛋白抑制因子2(cellular inhibitor of apoptosis proteins 2，cIAP2)具有內(nèi)源性抗細胞凋亡作用[3-4]。同時，cIAP2抑制劑能明顯降低乙肝模型小鼠血清中的HBV DNA水平[5-6]。這表明，促進肝細胞的凋亡可以減少HBV的復制。而目前少見文獻報道乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者和非乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者cIAP2的表達區(qū)別。因此，本研究通過比較乙肝和非乙肝相關(guān)性肝細胞癌患者癌灶組織內(nèi)cIAP2的差異表達，為肝癌患者差異性治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年5月到2015年5月內(nèi)在本院進行肝癌切除的組織標本[包括肝癌癌灶、癌旁(癌灶邊緣2 cm)和遠癌旁肝組織中(癌灶邊緣2～5 cm)]，乙肝和非乙肝相關(guān)性肝癌共23例。全部患者術(shù)前均是首次進行肝癌切除術(shù)，未進行放療和化療治療?；颊咝g(shù)前均進行完善的影像學和血清學檢測，術(shù)后均進行病理學檢查確認病灶為原發(fā)性肝細胞癌。肝癌病理診斷標準參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015版)》。本研究通過本院倫理委員會審批。最終，本研究總共納入23例原發(fā)性肝癌患者，其中15例為乙肝相關(guān)性肝癌組，8例為非乙肝相關(guān)性肝癌組。

1.2 試劑 抗兔cIAP2抗體(ab32059)購自美國Abcam公司。抗兔β-actin抗體(BA2305)、山羊抗兔結(jié)合辣根過氧化物酶二抗(BA1055)、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(AR0146)和哺乳動物組織總蛋白提取試劑盒(AR0101)均購自武漢博士德生物公司。超敏型ECL檢測試劑盒(KGP1126)購自南京凱基公司。免疫組化檢測試劑盒(PV-9001/PV-9002)和DAB顯色試劑盒(PV-9000)均購自北京中衫金橋公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測 肝癌癌灶、癌旁和遠癌旁肝組織中用多聚甲醛常規(guī)固定48 h后，進行石蠟包埋，制作成3～5 μm石蠟切片。常規(guī)進行脫蠟至水后進行HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色嚴格按照試劑盒說明書操作，即進行枸鹽酸煮沸法抗原修復和3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性后，

表1 患者一般情況的比較

5%牛血清蛋白封閉30 min，滴加抗兔cIAP2抗體(稀釋比例1∶200)并4 ℃過夜，然后滴加二抗(1∶2 000)，最后再用DAB顯色劑顯色之后進行蘇木素復染，透明、干燥、封片后顯微鏡下觀察。染色結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0(USA，Media Cybernetics)進行分析，每張片子取5個點，最終取平均值表示目的蛋白相對表達的水平。

1.3.2 Western blot檢測 每100 mg的肝癌癌灶、癌旁和遠癌旁肝組織中用哺乳動物組織總蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白后，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白濃度。按每個樣本50 μg的蛋白質(zhì)上樣，每孔均等質(zhì)量等體積加入上樣孔進行SDS-PAGE電泳：100 V恒壓電泳90 min；濕轉(zhuǎn)至PVDF膜中，5% 牛血清蛋白室溫封閉90 min；加抗兔cIAP2抗體(1∶1 000)或抗兔β-actin抗體(1∶500)，4 ℃孵育過夜；洗滌后，加山羊抗兔結(jié)合辣根過氧化物酶二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h。洗滌后，ECL試劑盒在化學發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光檢測。半定量分析：用Image Lab軟件掃描已扣除背景的目的條帶和相應組別的β-actin條帶的灰度值，然后進行比較，所得的比值為目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況及術(shù)后并發(fā)癥 乙肝相關(guān)性肝細胞癌組中，12例最終病理診斷為高分化HCC，3例診斷為中低分化HCC；6例術(shù)后病理切片提示微血管侵犯。非乙肝相關(guān)性肝細胞癌組中，5例最終病理診斷為高分化HCC，3例診斷為中低分化HCC；2例病理切片提示微血管侵犯。兩組患者除HBV DNA水平存在差異之外，其余一般情況差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。兩組患者均無手術(shù)相關(guān)死亡病例，其中6例患者出現(xiàn)手術(shù)相關(guān)嚴重并發(fā)癥(26.09%)，肺炎3例(13.04%)，調(diào)整抗生素后痊愈；斷面積液伴感染2例(8.70%)，行穿刺引流術(shù)后痊愈；膽漏1例(4.25%)，保守治療后好轉(zhuǎn)出院。

2.2 免疫組織化學和Western blot檢測結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，在兩組患者中肝癌癌灶、癌旁和遠癌旁肝組織中，cIAP2的表達量依次下降。但是，在非乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠癌旁肝組織的cIAP2表達顯著低于肝癌癌灶和癌旁(P<0.05)，而在乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠癌旁肝組織的cIAP2表達量與癌旁的cIAP2表達量無明顯差異(P>0.05)，卻低于癌灶的cIAP2表達量(P<0.05)，見圖1。并且，在非乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠癌旁肝組織的cIAP2蛋白表達量顯著低于乙肝相關(guān)性肝癌組遠癌旁肝組織的cIAP2蛋白表達量(P<0.05)，而兩組癌灶的cIAP2蛋白表達量無明顯差異(P<0.05)，見圖1。Western blot檢測結(jié)果與免疫組織化學結(jié)果相似，見圖2。

A：遠癌旁肝組織;B：癌旁組織;C：肝癌癌灶;D：兩組患者免疫組化的結(jié)果后得到的積分光密度累計值；1～3：非乙肝相關(guān)性肝癌組中遠癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織的cIAP2免疫組化染色的積分光密度累計值；4～6：乙肝相關(guān)性肝癌組中遠癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織的cIAP2免疫組化染色的積分光密度累計值。

圖1 免疫組織化學檢測組織內(nèi)cIAP2的蛋白表達

A:Western blotting法檢測分別檢查非乙肝相關(guān)性肝癌組中遠癌旁肝組織；癌旁組織和癌組織(1～3)和乙肝相關(guān)性肝癌組中遠癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織(4～6)的cIAP2蛋白表達；B：Image Lab軟件分別檢測非乙肝相關(guān)性肝癌組中遠癌旁肝組織，癌旁組織和癌組織(1～3)和乙肝相關(guān)性肝癌組中遠癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織(4～6)的cIAP2蛋白印記的灰度值。

圖2 Western blot檢測組織內(nèi)cIAP2的蛋白表達

2.3 相關(guān)性分析 對cIAP2在乙肝相關(guān)性和非乙肝性相關(guān)性肝癌癌灶、癌旁和遠癌旁肝組織的表達量與術(shù)前臨床指標進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：乙肝相關(guān)性肝癌組中Western blot檢測癌旁cIAP2水平與術(shù)前ALT水平呈負相關(guān)(r=-0.586，P=0.022)；非乙肝相關(guān)性肝癌組中免疫組化檢測癌灶cIAP2水平與術(shù)前IGG15呈正相關(guān)(r=0.632，P=0.007)。其余指標與cIAP2水平無相關(guān)性，說明cIAP2與HBV載量可能是肝細胞向癌細胞惡變的主要因素之一。

3 討 論

cIAPs家族包括cIAP1和cIAP2等，具有抑制細胞凋亡的作用[7]。目前已經(jīng)在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)cIAPs的高表達，cIAP1和cIAP2通過抵抗腫瘤壞死因子相關(guān)誘導凋亡配體(TRAIL)的作用來抑制癌細胞的凋亡[8-9]。cIAP1和cIAP2還可以通過抑制caspase家族的活化抑制腫瘤細胞的凋亡[10]。Wu等[11]的研究認為，用cIAPs的拮抗劑作用于結(jié)腸癌細胞后可以觀察到caspase-8激活并誘導腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生，繼而促進腫瘤細胞的凋亡。Weber等[12]研究證實，用cIAPs的拮抗劑作用于黑色素瘤細胞后，可以觀察到caspase-8和NF-κB的激活并促進細胞的凋亡。因此，cIAPs通過抑制caspase-8和NF-κB的表達促進腫瘤細胞的增殖。本次研究中，兩組患者肝癌癌灶和癌旁都發(fā)現(xiàn)高水平的cIAP2的表達，這與先前報道的結(jié)果相類似。肝癌細胞由于基因組和遺傳的不穩(wěn)定性造成的無性增值的惡性組織，程序性凋亡被抑制，故而肝癌病灶中抑制腫瘤細胞凋亡蛋白cIAP2呈高表達。

本研究在癌灶組織中，乙肝相關(guān)性肝癌組的cIAP2蛋白表達量于非乙肝相關(guān)性肝癌組相比無明顯差異，但是在遠癌旁肝組織中，乙肝相關(guān)性肝癌組的cIAP2的表達量較非乙肝相關(guān)性肝癌組的遠癌旁肝組織明顯增高。這說明感染HBV和不曾感染HBV患者發(fā)病因素的不同也會影響肝癌的發(fā)展和進展，也說明cIAP2可能是HBV誘導肝癌發(fā)生的機制之一。Ebert等[5]研究表明cIAP2在HBV感染模型小鼠中下調(diào)TNF-α的表達，并抑制肝細胞的凋亡以及是導致抗病毒耐藥的原因之一。在敲除cIAP1和cIAP2的小鼠中，HBV復制均被抑制，但是只有完全敲除cIAP2的小鼠中HBV復制才可能被明顯抑制[5]。同時，有研究還發(fā)現(xiàn)用特異性cIAP2抑制劑作用于HBV感染小鼠時，肝內(nèi)及血清中HBV表面抗原迅速下降，并且HBV核心抗原明顯被抑制[6]，這說明抑制cIAP2的表達能清除體內(nèi)HBV。因此，cIAP2是HBV感染促進正常肝組織向肝癌發(fā)展的重要機制之一，本研究中在遠癌旁肝組織中，乙肝相關(guān)性肝癌組的cIAP2的表達量較非乙肝相關(guān)性肝癌組的遠癌旁肝組織明顯增高的結(jié)果也進一步證明了這一點。

綜上所述，cIAP2誘導乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一。因此，cIAP2可作為乙肝相關(guān)性肝癌患者抑制肝癌發(fā)展和清除HBV的治療潛在靶點。

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Expression significance of cellular inhibitor of apoptosis proteins 2 in patients with hepatitis B related HCC

LiLinfeng,CuiLijuan△,LiuZhi,XiaQin,QinHaiyin,HeJiao

(DepartmentofPathology,SuiningMunicipalCentralHospital,Suining,Sichuan629000,China)

Objective To investigate the significance of cellular inhibitor of apoptosis proteins 2 (cIAP2) expression in the patients with hepatitis B and non- hepatitis B related hepatocellular carcinoma (HCC).Methods The medical record data and tissue samples in the patients with HCC resection operation were collected.Expression of cIAP2 in HCC cancer lesion,adjacent tissues and cancer-distant tissues was detected by immunohistochemical staining and Western blotting.Results In the cancer lesion,paracancerous tissues and cancer-distant tissues of the two groups,the cIAP2 expression amount was decreased in turn.But in the non-hepatitis B related HCC group,the cIAP2 expression in the cancer- distant tissues was significantly lower than that in the HCC cancer lesion and paracancerous tissues,while in the hepatitis B related HCC group,the cIAP2 expression amounts had no significant difference between the caner-distant tissues and paracancerous tissues,while lower than that in the cancer lesion.Conclusion cIAP2 is one of important mechanisms causing hepatic B related HCC and can serve as a therapeutic target point for inhibiting HCC development and eliminating hepatitis B virus.

carcinoma,hepatocellular;hepatitis virus,type B;cellular inhibitor of apoptosis proteins 2

李林豐(1982-)，主管技師，主要從事器官疾病病理診斷及肝臟疾病病理機制研究?！?/p>

，E-mail:llf0166@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.016

R735.7

A

1671-8348(2017)10-1349-03

2016-11-20

2017-01-31)