核酸檢測與酶免檢測在寧夏地區(qū)無償獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用

閆玉剛楊立輝丁 靜陜 姍王 琦

1寧夏醫(yī)科大學(xué) 寧夏回族自治區(qū)銀川市 750001 2寧夏血液中心 寧夏回族自治區(qū)銀川市 750001

核酸檢測與酶免檢測在寧夏地區(qū)無償獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用

閆玉剛1,2楊立輝2丁 靜2陜 姍2王 琦1

1寧夏醫(yī)科大學(xué) 寧夏回族自治區(qū)銀川市 750001 2寧夏血液中心 寧夏回族自治區(qū)銀川市 750001

目的:對(duì)ELISA和NAT檢測結(jié)果進(jìn)行分析，找出兩種檢測方法在血液篩查中的優(yōu)勢、劣勢。方法:收集寧夏地區(qū)2016年1月到2016年12月無償獻(xiàn)血者標(biāo)本，進(jìn)行ELISA和NAT檢測，并對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果:兩種檢測方法比對(duì)中共檢測標(biāo)本60958份，酶免檢測總陽性數(shù)為477份，陽性率為0.78%，NAT檢測陽性數(shù)154份，陽性率為0.25%。ELISA雙試劑陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果的符合率為65.14%，單試劑陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果的符合率為2.17%，灰區(qū)陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果符合率為0。ELISA檢測陰性標(biāo)本NAT檢測陽性數(shù)為57例，全為HBV DNA陽性，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光檢測乙肝兩對(duì)半結(jié)果為50例是隱匿性乙肝感染，7例檢測結(jié)果為陰性。結(jié)論:NAT檢測假陽性率較ELISA低，ELISA方法漏檢主要為隱匿性乙肝感染的漏檢。NAT檢測方法在獻(xiàn)血者血液篩查中優(yōu)于ELISA檢測方法。

核酸檢測；酶免檢測；無償獻(xiàn)血者；血液篩查

獻(xiàn)血者標(biāo)本檢測質(zhì)量優(yōu)劣很大程度取決于檢測方法、檢測試劑、檢測設(shè)備的先進(jìn)程度，酶聯(lián)免疫檢測方法主要檢測的是血漿中的傳染性標(biāo)志物抗原、抗體，當(dāng)抗原進(jìn)入體內(nèi)到產(chǎn)生抗體，再到抗體達(dá)到一定濃度被檢測出來之前的這段時(shí)間稱作“窗口期”。酶聯(lián)免疫檢測方法最主要的風(fēng)險(xiǎn)就是血清轉(zhuǎn)換窗口期的漏檢[1]，病毒變異致使檢測試劑不識(shí)別以及低病毒載量的慢性攜帶狀態(tài)是漏檢的另一原因[2]。核酸檢測的是病毒的DNA和RNA，可有效縮短病毒感染的窗口期，是目前國際上最先進(jìn)的血液安全檢測方法，通過檢測可將乙肝、丙肝和艾滋病病毒的檢測“窗口期”由原來的50天、72天和22天，分別縮短到25天、59天和11天，血液安全將得到更好保障。因此，核酸檢測已經(jīng)被視為降低酶免檢測窗口期漏檢風(fēng)險(xiǎn)，以及低病毒載量檢出的最佳檢測方法[3]?；谝陨系难芯拷Y(jié)果，現(xiàn)在越來越多的國家和地區(qū)將核酸檢測納入到無償獻(xiàn)血者血液的篩查中，以期降低輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)。本文通過對(duì)2016年1月到2016年12月酶免和核酸檢測結(jié)果的比較、分析中得出兩種檢測方法在血液篩查中的優(yōu)勢、劣勢。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來源于寧夏地區(qū)2016年1月到2016年12月無償獻(xiàn)血者標(biāo)本60958份，經(jīng)核酸和酶免檢測后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑

血液篩查用酶聯(lián)免疫試劑：乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（法國伯樂，北京萬泰）；丙型肝炎抗體診斷試劑盒（上海科華，北京萬泰）；人類免疫缺陷病毒抗原/抗體診斷試劑盒（法國伯樂，北京萬泰）；HbsAg，抗-HCV，HIV 抗原/抗體，抗-TP質(zhì)控物均為康徹斯坦。所有試劑均經(jīng)批批檢定合格，并在有效期內(nèi)使用。血液篩查用核酸檢測試劑：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1+2型）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）（美國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司），所有試劑均經(jīng)批批檢定合格，并在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 儀器

血液篩查用酶聯(lián)免疫儀器：全自動(dòng)酶免加樣儀（瑞士漢密爾頓STAR8CH）；全自動(dòng)酶免分析儀（瑞士漢密爾頓FAME24/20）。血液篩查用核酸儀器：全自動(dòng)核酸提取儀（COBAS AmpliPrep）全自動(dòng)核酸擴(kuò)增儀（COBAS TaqMan）（瑞士羅氏公司）。

1.2 研究方法

（1）60958份標(biāo)本先進(jìn)行酶免檢測，檢測陰性的進(jìn)行核酸檢測，核酸檢測結(jié)果中HBV DNA陽性的再進(jìn)行乙肝五項(xiàng)化學(xué)發(fā)光檢測。（2）酶免檢測灰區(qū)陽性、單試劑陽性、雙試劑陽性的標(biāo)本分別進(jìn)行核酸檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

（1）60958份獻(xiàn)血者標(biāo)本ELISA檢測情況：HbsAg、抗-HCV、 HIV 抗原/抗體總陽性數(shù)為477份，陽性率為0.78%，HbsAg陽性率最高為0.43%，HIV 抗原/抗體陽性率最低為0.11%。單試劑陽性數(shù)368份，陽性率為0.60%，雙試劑陽性數(shù)為109份，陽性率為0.18%。單試劑陽性數(shù)是雙試劑的3.33倍。結(jié)果見表1。

表1：60958份獻(xiàn)血者標(biāo)本ELISA檢測情況

（2）酶免檢測陰性標(biāo)本核酸檢測情況：NAT檢測的總陽性數(shù)為57例，全為HBV DNA陽性，陽性率為0.09%。結(jié)果見表2。

表2：酶免檢測陰性標(biāo)本核酸檢測情況

（3）57例HBV DNA陽性結(jié)果乙肝五項(xiàng)檢測結(jié)果（化學(xué)發(fā)光法）：57例HBV DNA陽性中有34例抗-HBs 和抗-HBc 陽性，16例抗-HBs、抗-Hbe和抗-HBc陽性，共 50例屬于隱匿性感染。5例檢測結(jié)果為抗-HBs陽性其他陰性，2例檢測結(jié)果為五項(xiàng)全陰性。結(jié)果見表3。

表3：57例HBV DNA陽性結(jié)果乙肝五項(xiàng)檢測結(jié)果

（4）ELISA檢測陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果符合率比較：

將ELISA檢測陽性標(biāo)本分為雙試劑陽性組、單試劑陽性組、灰區(qū)陽性組，分別與核酸檢測結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，各項(xiàng)目灰區(qū)陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果的符合率均為0。HbsAg雙試劑陽性標(biāo)本（S/CO≥1）與核酸的符合率為80.36%，；單試劑陽性標(biāo)本（S/CO≥1）與核酸的符合率為12.31%。抗-HCV雙試劑陽性標(biāo)本（S/CO≥1）與核酸的符合率為62.07%，單試劑陽性標(biāo)本（S/CO≥1）與核酸的符合率為0。HIV 抗原/抗體雙試劑陽性標(biāo)本（S/CO≥1）與核酸的符合率為80.00%，單試劑陽性標(biāo)本（S/ CO≥1）與核酸的符合率為0。雙試劑陽性標(biāo)本（S/CO≥1）與核酸檢測結(jié)果的符合率較高，單試劑陽性標(biāo)本（S/CO≥1）與核酸檢測結(jié)果的符合率較低。NAT總陽性標(biāo)本為154份，陽性率為0.25%，酶免陽性率是核酸的3.12倍。結(jié)果見表4。

表4：ELISA檢測陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果符合率比較

3 討論

從表1的數(shù)據(jù)可以看出酶免檢測主要不合格為單試劑檢測不合格，單試劑陽性數(shù)是雙試劑的3.33倍，高于溫州地區(qū)[4]。此現(xiàn)象主要是由于：

（1）實(shí)驗(yàn)室灰區(qū)的設(shè)置：血液檢測結(jié)果至關(guān)重要，關(guān)系到受血者的健康狀況，為了預(yù)防酶免疫檢測的漏檢，很多實(shí)驗(yàn)室都設(shè)置了“灰區(qū)”（既正常檢測陽性臨界值乘以灰區(qū)系數(shù)，如灰區(qū)系數(shù)為0.75正常S/CO≥1為陽性，設(shè)置灰區(qū)后0.75以上的結(jié)果為陽性），本實(shí)驗(yàn)室灰區(qū)陽性比例為52.20%，占陽性數(shù)的一大半。

（2）試劑敏感性太高：據(jù)試劑廠家介紹，用于血液篩查的試劑要比醫(yī)院的敏感性高，目的也是為了防止漏檢。主要不合格項(xiàng)目為HbsAg，這與我國乙肝的高流行情況相吻合。

表2顯示，在酶免檢測陰性的標(biāo)本中核酸檢測出57例陽性標(biāo)本，陽性率為0.09%，低于廣州地區(qū)的0.22%[5]，高于鄭州地區(qū)的0.06%[6]，且陽性結(jié)果全部為HBV DNA，與大連地區(qū)一致[7]。在對(duì)57例HBV DNA陽性標(biāo)本進(jìn)行乙肝五項(xiàng)的檢測，檢測結(jié)果見表3。57例HBV DNA陽性中有34例抗-HBs 和抗-HBc 陽性，16例抗-HBs、抗-Hbe和抗-HBc陽性，共 50例屬于隱匿性感染。5例檢測結(jié)果為抗-HBs陽性其他陰性，2例檢測結(jié)果為五項(xiàng)全陰性，檢測結(jié)果與鄭州地區(qū)基本相符[6]。由此可見，隱匿性乙肝感染是酶免檢測主要的漏檢原因之一，7例乙肝五項(xiàng)陰性標(biāo)本未做進(jìn)一步確認(rèn)，有可能是酶免窗口期漏檢[8]，也有可能是核酸檢測假陽性,50例抗-HBc陽性與HBV DNA結(jié)果一致，增加抗-HBc檢測可以降低乙肝病毒漏檢的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

表4得出酶免檢測灰區(qū)陽性數(shù)是249份，占酶免陽性的52.20%,與NAT的符合率為0；單試劑陽性數(shù)為368份，占酶免陽性的77.15%，與NAT的符合率為2.17%。雙試劑陽性數(shù)為109份，占酶免陽性的22.85%，與NAT的符合率為65.14%。ELISA(+)NAT(+)79份， 其 中HbsAg(+) NAT(+)53份,符合率為20.38%,低于溫州、深圳地區(qū)[4,10]；抗-HCV(+)NAT(+)18份，符合率為12.16%，高于溫州地區(qū)的11.2%[4]；HIV-Ab/Ag(+)NAT(+)8份，符合率為11.59%，符合率低于深圳地區(qū)[10]。ELISA檢測陽性率是NAT的3.12倍，酶免檢測陽性數(shù)明顯高于核酸檢測陽性數(shù)，灰區(qū)與單試劑陽性標(biāo)本與核酸檢測符合率較低，說明這些標(biāo)本的假陽性率較高[11]。這主要是由于酶免檢測抗原、抗體蛋白結(jié)構(gòu)易變，檢測結(jié)果受自身抗體、交叉反應(yīng)、標(biāo)本內(nèi)物質(zhì)干擾、溶血、脂血、試劑盒抗原不純、溫度、洗液比例、洗版效果、試劑質(zhì)量等的影響，易產(chǎn)生假陽性。核酸檢測的是DNA或RNA，能夠縮短病毒窗口期，對(duì)免疫靜默、病毒變異有很好的檢出[12],所以核酸檢測方法優(yōu)于酶免檢測方法。

綜上所述，酶免檢測假陽性率較高主要為灰區(qū)（56.4%）和單試劑陽性（23.7%）所占比重較大，且各項(xiàng)目灰區(qū)陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果的符合率均為0，單試劑陽性標(biāo)本與核酸檢測結(jié)果符合率較低，故建議：

（1）取消酶免檢測灰區(qū)值的設(shè)定。

（2）對(duì)單試劑檢測陽性標(biāo)本因再進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。

核酸檢測57例陽性標(biāo)本中50例為隱匿性乙肝感染，建議增加抗-HBc檢測以降低乙肝病毒漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。

（通訊作者：王琦）

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Analyze NAT and ELlSA detect donors blood in ningxia

Yan Yugang1,2, Yang Lihui2, Ding Jing2, Shan Shan2, Wang Qi1
1.Ningxia yinchuan, ningxia medical university 750001; 2.Blood center in ningxia Ningxia yinchuan 750001

Objective: ompared the results of ELISA with NAT detection methods, identifies the advantage and disadvantage of each other and find the complementary in reducing the infectious disease about blood transfusion. Methods: We compared the detection data of ELISA with the detection data of NAT collected at Ningxia region inJanuary to December 2016. ResultsA: total of 60,958 samples were tested for the comparison of the two test methods.The total number of samples with positive results in HbsAg, anti-HCV and HIV antigen/ antibody tests was 477, and the positive rate was 0.78%.154 results of the NAT test were positive, and the positive rate was 0.25%.The results of 57 samples were ELISA-NAT+, and they were all HBV DNA positive.The results of the electrogeneratedchemiluminescence (ECL) examination of HBsAg / anti-HBs / HBeAg / anti-HBe / anti-HBc were：50 cases of occult hepatitis B infection (OBI), and 7 negative cases. Conclusion: NAT detection of false positive rate was lower than that of ELISA, ELISA is the main method of detection of occult hepatitis B infection.

NAT(nucleic acid testing); ELISA(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays); Voluntary donation; Results of blood detection