蘋果植株應(yīng)答連作障礙差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

倪偉 倪蔚茹 趙靜 王增輝 毛志泉+陳學(xué)森+沈向

摘要： 為明確不同蘋果品種應(yīng)對(duì)連作障礙時(shí)差異表達(dá)的蛋白，在蛋白表達(dá)水平上揭示蘋果應(yīng)答連作障礙的機(jī)制，本研究選擇在重茬地中表現(xiàn)不同的兩個(gè)蘋果品種（抗重茬能力強(qiáng)的富士2001和抗重茬能力弱的首富1號(hào)）作為試材，利用重茬土進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，運(yùn)用蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（label-free）鑒定兩個(gè)蘋果品種葉片中差異表達(dá)的蛋白，將差異蛋白與 GO、COG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，分析不同蘋果品種差異蛋白的功能和分類。結(jié)果表明，兩個(gè)蘋果品種在重茬土栽植條件下主要鑒定得到43種差異或特異表達(dá)的蛋白，主要分為4類，包括光合作用相關(guān)蛋白（1種）、植物能量及物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白（17種）、植物防御和抗逆性相關(guān)蛋白（8種）、其他功能蛋白（17種），其中，植物能量及物質(zhì)代謝、植物防御和抗逆性相關(guān)蛋白表達(dá)量具有較大差異。不同蘋果品種在連作障礙反應(yīng)相關(guān)蛋白的表達(dá)量方面存在差異，抗重茬能力強(qiáng)的品種蛋白表達(dá)量明顯高于抗重茬能力弱的品種，推測參與防御反應(yīng)的蘋果過敏原蛋白和病程相關(guān)蛋白是蘋果植株應(yīng)對(duì)連作障礙的關(guān)鍵蛋白。抗重茬能力強(qiáng)的品種通過加強(qiáng)多種不同途徑的代謝，增強(qiáng)植株對(duì)于連作障礙的抗逆性，減少連作障礙對(duì)植物的傷害。

關(guān)鍵詞：蘋果；連作障礙；蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)；蛋白質(zhì)組學(xué)

中圖分類號(hào)：S661.1：Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）05-0001-09

Differential Proteomics Analysis on Apple in Response to

Continuous Cropping Obstacle

Ni Wei1， Ni Weiru1， Zhao Jing2， Wang Zenghui1， Mao Zhiquan1， Chen Xuesen1， Shen Xiang1

（1.College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of

Crop Biology， Taian 271018，China；2.College of Horticulture， Anhui Agricultural University， Hefei 230000， China）

AbstractThis research aims to explore the mechanism of apple in response to continuous cropping obstacle at the protein expression level by confirming the differential expression proteins of different apple cultivars answering continuous cropping. Stronger replanting-tolerant cultivar Fuji 2001 and weaker replanting-tolerant cultivar Shoufu 1 were grown in pots with replanted soils. Under the same cultivation and management conditions， label-free technology was used to identify the differential expression proteins in the leaves of apple which had different resistance abilities to continuous cropping. The differential expression proteins were compared with GO， COG and other databases to analyze their function and classification. The results showed that 43 kinds of differential or particular expression proteins were identified from two apple cultivars， and were mainly divided into four categories， including one protein related to photosynthesis， seventeen proteins referring to energy and carbohydrate metabolism， eight proteins related to plant defense and resistance， and seventeen proteins with other functions. There were great differences among the proteins of energy and carbohydrate metabolism and plant defense and resistance. Different apple cultivars had different protein expression levels related to continuous cropping. Furthermore， the stronger replanting-tolerant apple cultivar had higher protein expression level than the weaker one. It was inferred that the allergen proteins and pathogenesis related proteins， which joined in defensive reaction， were the key proteins of apple in response to continuous cropping. The stronger replanting-tolerant apple cultivar enhanced various different metabolic pathways to strengthen the resistance to continuous cropping obstacle and reduce the harm to plants.

KeywordsApple； Continuous cropping obstacle； Label-free technology； Proteomics

果園連作障礙又稱再植病、重茬病，主要表現(xiàn)為樹體生活力降低，枝條生長量小，樹冠小，產(chǎn)量低，嚴(yán)重影響果園的更新和可持續(xù)發(fā)展。研究表明不同蘋果品種對(duì)于連作障礙的表現(xiàn)不同，但作用機(jī)理尚不明確。因此研究不同蘋果品種在重茬土中的差異蛋白，從蛋白質(zhì)水平上研究減輕連作障礙的機(jī)理，對(duì)于降低連作障礙對(duì)蘋果植株的影響、實(shí)現(xiàn)果園的持續(xù)發(fā)展有重要意義。目前普遍認(rèn)為連作障礙產(chǎn)生的原因是綜合性的，主要由土壤理化性質(zhì)的破壞、土壤養(yǎng)分的失衡或缺失、微生物種群改變或根系分泌物的毒害等因素引起[1]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在不同蘋果砧木資源中存在抗重茬障礙的遺傳基因，希望能夠利用Malus sieversii等不同的蘋果種質(zhì)獲得抗重茬障礙基因，并篩選得到抗重茬砧木[2]。有研究表明，太子參在連作、輪作不同種植方式下，葉片中的蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)差異，連作條件下植物衰老或病害發(fā)生相關(guān)的五種蛋白在葉片中的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，并認(rèn)為這是太子參連作病害發(fā)生和提前黃化的主要原因[2]。而蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（label-free）檢測差異蛋白時(shí)在肽段的數(shù)量、蛋白質(zhì)的覆蓋率和分析通量方面具有較大優(yōu)勢(shì)，且不受樣品來源和數(shù)量的限制。有研究采用蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量等技術(shù)研究煙草青枯菌致病性，比較分析了非致病和致病青枯菌侵染后煙草的差異蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步得到顯著性量變差異蛋白質(zhì)163個(gè)，富集分析結(jié)果表明它們與糖代謝相關(guān)或主要定位于細(xì)胞外，這對(duì)于進(jìn)一步研究青枯菌侵染煙草的生物學(xué)機(jī)制有重要作用[3]。目前對(duì)于蘋果連作障礙的研究大多為植物生理生化方面的研究，蛋白質(zhì)層面的研究極少。本試驗(yàn)以在重茬地中生長表現(xiàn)不同的兩個(gè)蘋果品種為材料，運(yùn)用蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)研究蘋果中與抗重茬相關(guān)的差異蛋白，獲得兩個(gè)蘋果品種的差異蛋白圖譜，分析差異蛋白的類別和功能，以便能進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平上找到解決蘋果連作障礙的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材及取樣

試驗(yàn)材料為在重茬地中生長表現(xiàn)較好的富士2001（Fuji 2001）和表現(xiàn)較差的首富1號(hào)（Shoufu 1）兩個(gè)蘋果品種[3]。供試植株為以平邑甜茶（M. hupehensis）為基砧、分別以富士2001和首富1號(hào)為接穗的兩年生植株。選擇生長整齊一致的幼苗栽植，重茬土取自泰安市岱岳區(qū)灘清灣村20年生蘋果園，收集距果樹樹干1 m之內(nèi)、深 5～40 cm范圍內(nèi)的土壤，采取多點(diǎn)隨機(jī)取樣的方式以保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，混勻過篩后裝在外徑35 cm、內(nèi)徑30 cm的透氣塑料花盆中，每盆裝土10 kg。試驗(yàn)于2015年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞果樹試驗(yàn)站進(jìn)行。3月26日將富士2001和首富1號(hào)的幼苗栽在裝有重茬土的盆中，每個(gè)處理10盆，每盆種植3株，進(jìn)行統(tǒng)一管理。于10月21日采集樣品，選取同一生長部位正常生長的蘋果葉片，液氮保存帶回，-80℃存放，以干冰包裝運(yùn)輸?shù)奖本┌罘粕锟萍加邢薰具M(jìn)行蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2蛋白提取

取適量樣品用液氮研磨成粉末狀，加入1 mL預(yù)冷BPP提取緩沖液，室溫渦旋振蕩10 min，加入1 mL Tris飽和酚，室溫渦旋振蕩10 min，4℃、15 000×g離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液，并加入等體積BPP提取緩沖液，室溫渦旋振蕩5 min，4℃、15 000×g離心15 min，重復(fù)抽提一次。取1 mL上清液，加入5 mL過飽和硫酸銨甲醇溶液（即AM沉淀劑），于-20℃沉淀過夜，過夜的溶液于4℃、15 000×g離心15 min。加入1 mL冰冷甲醇，用剪過的槍頭充分打碎蛋白，于4℃、15 000×g離心5 min，棄上清液；加入1 mL冰冷丙酮，用槍頭充分?jǐn)囁榈鞍讐K，于4℃、12 000×g離心5 min，棄上清液重復(fù)上述操作；蛋白沉淀室溫下自然風(fēng)干約5～8 min，加入適量脲裂解液；將溶解完全的蛋白液于20℃、20 000×g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液至離心管中，4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3酶解

取50 μL提取的蛋白質(zhì)樣品，加入 DTT至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μL UA buffer（8 mol/L Urea，150 mmol/L Tris-HCl pH值8.0）混勻，轉(zhuǎn)入10 kD超濾離心管，14 000×g離心15 min，棄濾液。加入200 μL UA buffer，14 000×g離心15 min，棄濾液。加入100 μL IAA（50 mmol/L IAA in UA），600 r/min振蕩1 min，室溫避光30 min，14 000×g離心10 min，棄濾液。加入100 μL UA buffer，14 000×g離心10 min，棄濾液，重復(fù)2次。加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，14 000×g離心10 min，棄濾液，重復(fù)2次。加入40 μL Trypsin buffer（4 μL Trypsin in 40 μL NH4HCO3），600 r/min振蕩1 min，37℃放置16～18 h。換新收集管，14 000×g離心10 min，取濾液，測定在280 nm處的吸光度值，對(duì)蛋白質(zhì)的肽段進(jìn)行定量分析。

1.4酶解產(chǎn)物的LC-MS/MS分析

蛋白質(zhì)FASP酶解后，按照定量結(jié)果取2 μg酶解后產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS/MS分析。采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)EASY-nLC1000進(jìn)行分離。液相A液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為2%），B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm （RP-C18）以100%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Thermo EASY column SC001 traps 150 μm×20 mm （RP-C18）（Thermo），再經(jīng)色譜柱分離，流速為300 nL/min。相關(guān)液相梯度如下：0～105 min，B液線性梯度從0～45%；105～110 min，B液線性梯度從45%～100%；110～120 min，B液維持在100%。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長：120 min；檢測方式：正離子；母離子掃描范圍：300～1 800 m/z；多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：MS1在M/Z 200時(shí)分辨率為70 000；AGC target：3e6；一級(jí)Maximum IT：10 ms；Number of scan ranges：1；Dynamic exclusion：40.0 s。每次全掃描（full scan）后采集10個(gè)碎片圖譜，二級(jí)在M/Z 200時(shí)分辨率為17 500，MS/MS Activation Type：HCD；Isolation window：2 m/z；Microscans：1；二級(jí)Maximum IT：60 ms；Normalized collision energy：30 eV；Underfill ratio：0.1%。

1.5Maxquant的非標(biāo)記分析

每個(gè)樣品重復(fù)3次質(zhì)譜分析，原始文件導(dǎo)入Maxquant軟件（版本號(hào)1.3.0.5）進(jìn)行查庫，進(jìn)行LFQ非標(biāo)記定量分析。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為Malus mill。主要參數(shù)如下，Main search ppm：6；Missed cleavage：2；MS/MS tolerance ppm：20；De-Isotopic： TRUE；enzyme：Trypsin；database：uniprot_rat_35702_20151029.fasta；Fixed modification：Carbamidomethyl（C）；Variable modification： Oxidation（M），Acetyl （Protein N-term）；Decoy database pattern： reverse；Lable free quantification（LFQ）：TRUE；LFQ min ratio count：1；Match between runs：2 min；Peptide FDR：0.01；Protein FDR：0.01。

1.6Perseus的統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)分析

Maxquant所得的查庫文件使用Perseus軟件進(jìn)行分析，Perseus軟件版本號(hào)為1.3.0.5。

2結(jié)果與分析

2.1肽段和蛋白質(zhì)分析

富士2001和首富1號(hào)肽段和蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果見表1?？梢钥闯?，富士2001和首富1號(hào)中鑒定得到的肽段數(shù)分別為847和829，而蛋白質(zhì)總數(shù)分別為364和355，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)同類組數(shù)為349和338。本試驗(yàn)共鑒定得到了184個(gè)差異蛋白（差異倍數(shù)≥1.5或差異倍數(shù)≤0.667），其中與首富1號(hào)相比，富士2001中144個(gè)為上調(diào)蛋白，40個(gè)為下調(diào)蛋白。富士2001和首富1號(hào)鑒定到的共有蛋白為314個(gè)，富士2001中存在而首富1號(hào)中未檢測到的特異蛋白為50個(gè)，首富1號(hào)中的特異蛋白數(shù)量為41個(gè)。這些結(jié)果表明抗重茬表現(xiàn)不同的兩個(gè)蘋果品種在蛋白質(zhì)表達(dá)方面也具有較大的差異。

2.2蛋白質(zhì)組GO功能分類

基因本體論（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫通過建立一套具有動(dòng)態(tài)形式的控制字集，來解釋真核基因及蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)所扮演的角色，從而全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性[4]。結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫對(duì)兩個(gè)蘋果品種的差異蛋白進(jìn)行功能分類，從宏觀上認(rèn)識(shí)抗重茬表現(xiàn)不同的蘋果品種蛋白質(zhì)功能分布特征。富士2001和首富1號(hào)表達(dá)量差異蛋白的GO分類統(tǒng)計(jì)如圖1所示，差異表達(dá)蛋白在細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程三大類中分別包含了13、15個(gè)和23個(gè)功能小類。在生物學(xué)過程這一類中，生物學(xué)調(diào)控和代謝過程占的比例較高；在細(xì)胞組分中，胞內(nèi)區(qū)域成分和細(xì)胞骨架占的比例較大；在分子功能中，催化活性和結(jié)合活性占的比例較高。富士2001特異蛋白GO分類統(tǒng)計(jì)如圖2所示，特異蛋白在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三類分別包含14、6個(gè)和7個(gè)功能小類。在生物學(xué)過程這一類中，刺激應(yīng)答、生物學(xué)調(diào)控、代謝過程、應(yīng)答生物性刺激占的比例較高；在細(xì)胞組分中，膜、細(xì)胞成分、胞外區(qū)域成分占的比例較大；在分子功能中，催化活性和結(jié)合活性占的比例較大。首富1號(hào)特異蛋白GO分類統(tǒng)計(jì)如圖3所示，特異蛋白在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三類分別包含12、6個(gè)和10個(gè)功能小類。在生物學(xué)過程這一類中，細(xì)胞代謝過程、生物學(xué)調(diào)控和代謝過程的比例較高；在細(xì)胞組分中，類核占的比例較大；在分子功能中，基因結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、催化活性和轉(zhuǎn)移酶活性占的比例較大。

2.3蛋白質(zhì)組COG功能分類

在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)不能獨(dú)立地行使功能，而是不同蛋白質(zhì)相互協(xié)調(diào)完成一系列生化反應(yīng)以行使其生物學(xué)功能[5]。COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins 蛋白相鄰類的聚簇）是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。將兩個(gè)蘋果品種差異蛋白與COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測蛋白質(zhì)的功能并進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。如圖4所示，兩個(gè)品種表達(dá)量差異蛋白根據(jù)功能可分為19個(gè)大類，其中一般功能預(yù)測包含的差異蛋白數(shù)量最多，為30個(gè)，其次是次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解（19）、細(xì)胞骨架（18）、能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化（17），其他類別的差異蛋白數(shù)量各不相同。如圖5所示，富士2001特異蛋白根據(jù)功能可分為8個(gè)大類，主要為次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解（13），其他種類的特異蛋白數(shù)量均較低。如圖6所示，

2.4差異蛋白的表達(dá)變化及功能分類

對(duì)質(zhì)譜分析得到的兩個(gè)蘋果品種的表達(dá)量差異蛋白和特異蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、序列比對(duì)、結(jié)果注釋和文獻(xiàn)檢索鑒定，主要得到43種差異或特異表達(dá)蛋白，在表達(dá)量差異蛋白中共鑒定得到25種蛋白存在顯著性差異，富士2001中特異蛋白為13種，首富1號(hào)中特異蛋白為9種（過敏原蛋白類和病程相關(guān)蛋白類在表達(dá)量差異蛋白和特異蛋白中都鑒定得到）。這些蛋白按照功能主要分為4類，具體的差異蛋白表達(dá)量見。

第1類：包括1種與光合作用相關(guān)的蛋白，為葉綠素a/b結(jié)合蛋白Ⅰ型，在富士2001中表達(dá)量顯著上調(diào)。

第2類：與植物能量及代謝相關(guān)的蛋白為17種。包括糖酸組分代謝有關(guān)的蛋白，除山梨醇6-磷酸脫氫酶和部分蘋果酸酶在富士2001中顯著下調(diào)外，其余蘋果酸脫氫酶、果糖激酶、葡萄糖激酶均在富士2001中顯著上調(diào)，而山梨醇脫氫酶在富士2001中特異表達(dá)。類黃酮代謝相關(guān)的黃酮醇合酶、二氫黃酮醇-4-還原酶、花青素合成酶、花青素還原酶均在富士2001中顯著上調(diào)，而二磷酸尿核苷葡萄糖-類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、查爾酮合成酶僅在首富1號(hào)中特異表達(dá)?？箟难岽x相關(guān)的除L-半乳糖酶在富士2001中顯著下降外，其余L-半乳糖-1-磷酸酶、GDP-D-甘露糖焦磷酸酶、單脫氫抗壞血酸還原酶均在富士2001中顯著上升，與能量代謝有關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶只在首富1號(hào)中特異表達(dá)。

第3類：與植物防御、抗逆性相關(guān)的蛋白有8種。其中病程相關(guān)類（pathogenesis-related，PR）蛋白分別為病程相關(guān)蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、類甜蛋白和蘋果過敏原蛋白和其他防御相關(guān)蛋白如防御素、多酚氧化酶、脫水蛋白和自噬相關(guān)蛋白。除少量過敏原蛋白和病程相關(guān)蛋白在富士2001中顯著下調(diào)和在首富1號(hào)中特異表達(dá)外，其余的多酚氧化酶、防御素均在富士2001中顯著上調(diào)，而脫水蛋白、自噬相關(guān)蛋白、類甜蛋白、β-1，3-葡聚糖酶僅在富士2001中特異表達(dá)。

第4類：其他功能蛋白包含17種，分別在植物的生物合成與調(diào)控、細(xì)胞定位與識(shí)別、細(xì)胞信號(hào)傳遞等功能發(fā)揮不同的作用，通過多種代謝途徑提高植物的抗逆能力。

3討論與結(jié)論

3.1光合作用相關(guān)蛋白對(duì)蘋果抗重茬的影響

葉片通過光合作用進(jìn)行物質(zhì)積累和能量代謝，通過光信號(hào)傳導(dǎo)過程調(diào)節(jié)植物各種生理生化代謝途徑，而蛋白質(zhì)正是這些生理生化反應(yīng)的最直接參與者[6]。有研究表明植物在受到逆境脅迫時(shí)，類囊體的結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，引起膜脂過氧化和葉綠素含量的減低，導(dǎo)致光合速率下降，同樣蘋果植株在受到連作障礙脅迫時(shí)，光合速率也會(huì)下降[7]。劉淑芹等[8]在番茄重茬土中套作分蘗洋蔥后，相比于對(duì)照，番茄植株中10種與光合作用相關(guān)的蛋白顯著上升，明顯減低了連作障礙對(duì)番茄生長的影響。在本試驗(yàn)中僅檢測到一種與光合作用相關(guān)的蛋白，即葉綠素a/b結(jié)合蛋白Ⅰ型，在富士2001中的表達(dá)量顯著高于首富1號(hào)，綠色植物通過捕光葉綠素結(jié)合蛋白接收太陽能來同化CO2獲得能量。分析原因是因?yàn)楦皇?001在重茬土中的光合作用能力較強(qiáng)，預(yù)示生成更多的總糖、還原糖等碳水化合物，營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存更加豐富，有利于增強(qiáng)對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力，這與我們先前在重茬土中測量蘋果植株凈光合速率的結(jié)果基本一致。但由于本試驗(yàn)中未鑒定出其他關(guān)于光合作用的差異蛋白，其他有關(guān)蛋白是否在蘋果抗連作障礙中發(fā)揮重要作用，還有待于進(jìn)一步研究。

3.2防御、抗逆相關(guān)蛋白對(duì)蘋果抗重茬的影響

在本試驗(yàn)中蘋果抗重茬能力主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面是植株體內(nèi)與自身代謝活動(dòng)或者能量轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)量存在顯著差異，另一方面是能提高植株抗逆性、防御外界環(huán)境生物或非生物脅迫相關(guān)蛋白的表達(dá)量存在顯著差異。

在植株自身的代謝活動(dòng)中，糖酸代謝具有重要的作用。林茂茲[2]對(duì)太子參連作與輪作的多糖和人參皂苷Rb1含量的比較結(jié)果說明太子參連作導(dǎo)致其品質(zhì)急劇下降。有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的草酸和蘋果酸能夠促進(jìn)平邑甜茶幼苗的生物量增長、光合作用等，減輕連作障礙對(duì)幼苗生長的影響[9，10]。在本試驗(yàn)中共鑒定得到5種糖酸代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，分別參與植物三羧酸、糖酵解等不同的代謝途徑，蛋白分別為蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶、果糖激酶、葡萄糖激酶、山梨醇脫氫酶、山梨醇6-磷酸脫氫酶，還有1種能量代謝相關(guān)的蛋白為糖基轉(zhuǎn)移酶。除山梨醇6-磷酸脫氫酶和部分蘋果酸酶在富士2001中顯著下調(diào)外，其余蘋果酸脫氫酶、果糖激酶、葡萄糖激酶均在富士2001中顯著上調(diào)，山梨醇脫氫酶在富士2001中特異表達(dá)，而糖基轉(zhuǎn)移酶在首富1號(hào)中特異表達(dá)。糖基轉(zhuǎn)移酶具有多種形式，大量分布在生物體內(nèi)，是合成糖甙鍵的關(guān)鍵酶，對(duì)于合成糖蛋白、糖脂及其他次生代謝產(chǎn)物有重要作用，糖基化作用還可以抑制和排除生物體內(nèi)大量內(nèi)生和外生有毒物質(zhì)的合成與代謝[11]。這些結(jié)果表明在應(yīng)答重茬脅迫的過程中，蘋果植株可能通過糖酸類化合物及能量的代謝反應(yīng)為植株抗重茬障礙實(shí)現(xiàn)物質(zhì)基礎(chǔ)。

抗壞血酸在植物體內(nèi)具有重要的抗氧化作用，能夠清除自身的活性氧和自由基，減少逆境脅迫對(duì)于植株的傷害，保證正常的代謝功能，植物體能自主合成抗壞血酸，若植物體內(nèi)抗壞血酸代謝不足或受阻，植物的抗逆性和生長發(fā)育都會(huì)受到限制[12]。潘德灼等[13]研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸代謝相關(guān)酶在龍眼果皮采后褐變過程中表達(dá)量不斷下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞中積累較多的活性氧，從而加速了果皮的衰老。本試驗(yàn)中共鑒定得到4種抗壞血酸代謝相關(guān)蛋白，分別為L-半乳糖酶、L-半乳糖-1-磷酸酶、GDP-D-甘露糖焦磷酸酶、單脫氫抗壞血酸還原酶，除L-半乳糖酶在富士2001中顯著下調(diào)外，其余L-半乳糖-1-磷酸酶、GDP-D-甘露糖焦磷酸酶、單脫氫抗壞血酸還原酶均在富士2001中顯著上調(diào)。表明在重茬土逆境脅迫中，蘋果植株可能通過抗壞血酸代謝途徑減低活性氧的濃度，從而減輕自由基對(duì)植株的傷害，所以抗壞血酸參與的抗氧化過程也是蘋果應(yīng)對(duì)連作障礙的重要防御反應(yīng)。

類黃酮生物合成途徑在植物體內(nèi)普遍存在，能夠產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，清除體內(nèi)自由基，減少膜脂過氧化程度，在植物著色物質(zhì)、防御素方面有重要的作用[14]。有研究證明在楊梅中花色苷合成與糖代謝途徑中關(guān)鍵蛋白表達(dá)上調(diào)是果肉花色苷合成和顏色形成的重要生理機(jī)制[15，16]。在本研究中，共鑒定得到6類與類黃酮代謝相關(guān)的蛋白，黃酮醇合酶、二氫黃酮醇-4-還原酶、花青素合成酶、花青素還原酶均在富士2001中顯著上調(diào)，而二磷酸尿核苷葡萄糖-類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、查爾酮合成酶僅在首富1號(hào)中特異表達(dá)。這都表明了蘋果植株在重茬土中能夠通過增加體內(nèi)類黃酮代謝相關(guān)酶的表達(dá)，代謝生成不同的次生代謝產(chǎn)物，提高植物的抗氧化作用，從而抵御外界不利環(huán)境對(duì)于植株生長的脅迫，減少連作障礙對(duì)植株生長的不良影響。

病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）蛋白是一類在植物中具有廣泛抗性的可溶性蛋白[17]，根據(jù)PR蛋白的植物來源、氨基酸序列同源性以及生化功能等，可將PR蛋白分為17類，其中包括富含甘氨酸的病程相關(guān)蛋白（PR-1）、β-1，3-葡聚糖酶（PR-2）、幾丁質(zhì)酶（PR-3）、類甜蛋白（PR-5）、過氧化物酶類（PR-9）、過敏反應(yīng)相關(guān)的PR蛋白（PR-10）等[18，19]。本試驗(yàn)中共鑒定到四類PR蛋白，分別為病程相關(guān)蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、類甜蛋白和蘋果過敏原蛋白。除少量過敏原蛋白和病程相關(guān)蛋白在富士2001顯著下調(diào)和在首富1號(hào)中特異表達(dá)外，其余的多酚氧化酶、防御素均在富士2001中顯著上調(diào)，這些PR蛋白對(duì)于蘋果植株應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫具有重要作用。張彩霞等[20]用輪紋病菌侵染蘋果枝條，發(fā)現(xiàn)枝條中的病程相關(guān)類蛋白表達(dá)顯著上升，表明其在蘋果枝條應(yīng)答輪紋病菌的脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，參與了枝條表皮細(xì)胞的抗病反應(yīng)。

如上所述，蘋果植株在應(yīng)對(duì)連作障礙的脅迫過程中，多個(gè)代謝途徑的蛋白差異表達(dá)或特異表達(dá)，包括光合作用、糖類及能量代謝、抗壞血酸代謝、類黃酮代謝及防御、抗逆性反應(yīng)等相關(guān)蛋白。推測參與防御反應(yīng)的蘋果過敏原蛋白和病程相關(guān)蛋白是蘋果植株應(yīng)對(duì)連作障礙的關(guān)鍵蛋白，提高了蘋果對(duì)外界環(huán)境的抵御能力，能夠應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫，這與劉淑芹等[8]的研究結(jié)果相近。本試驗(yàn)從蛋白質(zhì)水平上初步了解了蘋果植株應(yīng)對(duì)連作障礙脅迫時(shí)不同抗性相關(guān)蛋白的差異表達(dá)情況，可為進(jìn)一步提高蘋果連作障礙抗性的種質(zhì)改良提供理論基礎(chǔ)。

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