髓源抑制細(xì)胞對慢性丙型肝炎患者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療臨床預(yù)后的影響

孟雪飛，李紅兵

渭南市中心醫(yī)院感染科，陜西 渭南 714000

髓源抑制細(xì)胞對慢性丙型肝炎患者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療臨床預(yù)后的影響

孟雪飛，李紅兵

渭南市中心醫(yī)院感染科，陜西 渭南 714000

目的研究髓源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)對慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者使用干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的臨床預(yù)后影響。方法選取渭南市中心醫(yī)院2012年1月-2014年1月收治的CHC患者100例，均給予干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，同時(shí)選取100名健康體檢者作為對照組，根據(jù)MDSCs表型，將其分為粒系髓源抑制細(xì)胞(G-MDSCs)和單核系髓源抑制細(xì)胞(M-MDSCs)。分析CHC患者和對照組MDSCs、CD4+T和CD8+T水平，分析CHC患者經(jīng)治療后病毒HCV-RNA、MDSCs、CD4+T、CD8+T水平，治療后的CHC患者分為獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)和未獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答(non-SVR)，分析non-SVR患者中剔除MDSCs組和未剔除MDSCs組的CD4+T和CD8+T水平。結(jié)果治療前，CHC患者CD4+T、CD8+T水平均顯著低于對照組(P<0.05)。CHC患者HCV-RNA、G-MDSCs水平均高于對照組(P<0.05)；兩組M-MDSCs水平相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療前CHC組、治療后SVR組和non-SVR組HCV-RNA、G-MDSCs、CD4+T、CD8+T水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，M-MDSCs水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MDSCs剔除組和MDSCs未剔除組CD4+T和CD8+T水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療可以降低患者HCV-RNA水平，而HCV-RNA對G-MDSCs有促進(jìn)作用，G-MDSCs對CD4+T、CD8+T有抑制作用，對CHC患者使用干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療起到不良的臨床預(yù)后影響。

髓源抑制細(xì)胞；慢性丙型肝炎；干擾素；利巴韋林

丙型病毒性肝炎是一種呈世界性流行的傳染性疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)70%以上的丙肝患者發(fā)展為慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)，因CHC有明顯的致肝硬化甚至致肝癌傾向，因此若CHC治療不及時(shí)，患者多預(yù)后不良[2]。采用傳統(tǒng)的干擾素聯(lián)合利巴韋林等抗病毒藥物作為治療CHC的一線方案，近50%的患者不能獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)[3]。髓源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是近年發(fā)現(xiàn)的起源于骨髓的免疫抑制細(xì)胞，研究[4]證實(shí)MDSCs與多種免疫性疾病、感染性疾病及腫瘤性疾病的不良預(yù)后密切相關(guān)，其是否對干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的CHC患者臨床預(yù)后產(chǎn)生影響研究較少。本研究分析了CHC患者與正常人群之間的MDSCs、CD4+T和CD8+T水平及CHC患者治療后病毒HCV-RNA、MDSCs、CD4+T、CD8+T水平變化及MDSCs對CHC患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集渭南市中心醫(yī)院2012年1月-2014年1月確診為CHC患者100例，男58例，女42例，年齡(47.95±8.16)歲(30～65歲)，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.89±4.21)kg/m2，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(70.12±8.02)U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)(60.15±7.34)U/L，其中代償期肝硬化Child-Pugh A級患者39例。同時(shí)納入健康體檢者100名作為對照組，男63名，女37名，年齡(48.61±8.71)歲(30～65歲)，BMI(23.75±4.11)kg/m2，ALT(17.96±4.35)U/L，AST(16.24±3.76)U/L。兩組性別、年齡和BMI相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次納入的患者均簽署知情同意書，本次研究已報(bào)我院倫理委員會通過。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《丙型肝炎防治指南》[5]：(1)HCV抗體檢測呈陽性且檢測出HCV-RNA；(2)影像學(xué)檢查肝纖維化；(3)ALT或AST持續(xù)升高。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：(1)符合以上CHC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)患者為初期感染HCV-RNA和代償期肝硬化Child-Pugh分級為A級的患者；(3)年齡30～65歲；(4)配合治療；(5)均為初次接受該治療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他任何類型的肝炎、結(jié)核及HIV的患者；(2)孕婦、妊娠期和哺乳期的患者；(3)有精神疾病者；(4)對該藥物存在嚴(yán)重并發(fā)癥患者；(5)身體患有任何類型腫瘤的患者。

1.4 儀器及藥品干擾素(凱因益生重組人干擾素α2b注射液，北京凱因生物技術(shù)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20030030，批號11100002)；利巴韋林(山東圣魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20003099，批號11090003)。HCV RNA定量采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀購自賽飛(中國)有限公司，型號Biosafer 9701)。

1.5 研究方法第一階段：將CHC患者和健康志愿者的G-MDSCs、M-MDSCs、CD4+T和CD8+T水平進(jìn)行對比分析了解以上指標(biāo)在兩組之間的差異。第二階段：對CHC患者進(jìn)行抗病毒治療，藥物使用干擾素聯(lián)合利巴韋林。干擾素用量及用法：肌肉注射，3 000 000 IU/次，1次/d，連用4周后改為3次/周，共連用48周。治療結(jié)束后根據(jù)病毒學(xué)應(yīng)答情況，將患者分為持久病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)組和未獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答(non-SVR)組，對比分析治療前和治療后SVR組及non-SVR組G-MDSCs、M-MDSCs、CD4+T和CD8+T水平，了解以上指標(biāo)在三組之間的差異。第三階段：提取non-SVR組患者的外周血單核細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀將部分患者單核細(xì)胞剔除MDSCs，另一部分為未剔除MDSCs，使用CD3/CD28抗體對CD4+T和CD8+T進(jìn)行刺激增殖，觀察MDSCs對CD4+T和CD8+T增殖的影響。

1.6 指標(biāo)觀察觀察各組G-MDSCs、M-MDSCs、CD4+T和CD8+T水平和治療前后CHC患者HCV-RNA水平。

1.6.1 G-MDSCs、M-MDSCs的檢測：取外周靜脈血進(jìn)行離心，首先以1 500 r/min離心5 min，提取真空采血管下層的血細(xì)胞，加入適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行稀釋，置于離心管中，再加入適量淋巴細(xì)胞分離液，以2 500 r/min進(jìn)行離心操作30 min，提取單核細(xì)胞分離層，再經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌2次，1 500 r/min離心10 min。使用貝克曼庫爾特CytoFLEX流式細(xì)胞儀(型號CytoFLEX)進(jìn)行G-MDSCs和M-MDSCs比例的測定。

1.6.2 CD4+T和CD8+T水平檢測：取外周靜脈血進(jìn)行離心提取單核細(xì)胞，離心棄上清，分別加入anti-CD4+T和anti-CD8+T抗體，使用貝克曼庫爾特CytoFLEX流式細(xì)胞儀分離檢測其比例。

2 結(jié)果

2.1 治療前CHC患者和對照組體內(nèi)CD4+T、CD8+T水平分析治療前，CHC組CD4+T、CD8+T水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 治療前CHC組和對照組HCV-RNA、G-MDSCs、M-MDSCs水平治療前，CHC患者體內(nèi)有HCV-RNA，對照組均無HCV-RNA；CHC患者體內(nèi)G-MDSCs水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CHC患者M(jìn)-MDSCs水平與對照組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

組別例數(shù)CD4+TCD8+T對照組10027.98±2.4622.03±3.28CHC組10015.19±1.3111.35±1.79t值45.89128.582P值<0.05<0.05

2.3 CHC患者治療前后SVR組、non-SVR組HCV-RNA、G-MDSCs、M-MDSCs水平治療后CHC患者體內(nèi)HCV-RNA水平均下降，且SVR組0.05，見表3)。

組別例數(shù)HCV-RNA(log10IU/ml)G-MDSCs(%)M-MDSCs(%)對照組10001.03±0.162.49±0.43CHC組1005.86±0.383.71±0.582.53±0.46t值154.21144.5430.635P值<0.05<0.05>0.05

組別例數(shù)HCV-RNA(log10IU/ml)G-MDSCs(%)M-MDSCs(%)治療前CHC組1005.86±0.383.71±0.582.53±0.46治療后non-SVR組285.01±0.313.16±0.472.51±0.45治療后SVR組724.51±0.252.50±0.312.50±0.42F值305.928111.7780.079P值<0.05<0.05>0.05

2.4 治療前CHC患者和治療后SVR組、non-SVR組CD4+T、CD8+T水平分析治療后CHC患者體內(nèi)CD4+T、CD8+T水平顯著升高，且SVR組>non-SVR組>治療前CHC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

2.5 non-SVR患者中剔除MDSCs組和未剔除MDSCs組的CD4+T、CD8+T水平分析將28例non-SVR患者抽取外周血，將其中14例患者的外周血剔除MDSCs，并設(shè)為MDSCs剔除組，另14例患者設(shè)為MDSCs未剔除組，經(jīng)抗體刺激增殖后顯示剔除MDSCs組的CD4+T、CD8+T水平顯著高于未剔除MDSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表5)。

組別例數(shù)CD4+TCD8+T治療前CHC組10015.19±1.3111.35±1.79治療后non-SVR組2817.96±1.3813.58±1.83治療后SVR組7219.87±1.4316.01±1.92F值194.488105.569P值<0.05<0.05

組別例數(shù)CD4+T增殖前增殖后CD8+T增殖前增殖后未剔除MDSCs組1417.94±1.4148.05±5.2413.62±1.8441.02±5.09剔除MDSCs組1417.98±1.4375.61±7.0513.55±1.7969.53±6.48t值0.10516.6020.14418.308P值>0.05<0.05>0.05<0.05

3 討論

MDSCs主要由成熟及非成熟的髓樣細(xì)胞組成，如未成熟狀態(tài)的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，具有顯著的免疫抑制作用，尤其能顯著抑制T細(xì)胞功能[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)丙肝病毒作為刺激源可持續(xù)誘導(dǎo)機(jī)體MDSCs生成，表現(xiàn)為外周血MDSCs含量升高，但關(guān)于其具體誘導(dǎo)機(jī)制尚不明確。Ning等[9]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)丙肝病毒的核心蛋白成分可能在MDSCs的生成中起重要作用，核心蛋白通過抑制髓系細(xì)胞的活化來達(dá)到抑制T細(xì)胞免疫能力的目的。另有研究[10]指出MDSCs為被病毒感染的細(xì)胞提供免疫耐受的條件，使其免于被免疫細(xì)胞滅殺，最終促成病毒感染性疾病的慢性化。CD4+T和CD8+T細(xì)胞機(jī)體主要發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，但在CHC患者中CD4+T和CD8+T細(xì)胞并未對感染的肝細(xì)胞進(jìn)行攻擊，推測可能與感染的肝細(xì)胞在MDSCs作用下出現(xiàn)的免疫逃避有關(guān)[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)CHC患者CD4+T、CD8+T水平均顯著低于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明慢性丙肝病毒感染患者未出現(xiàn)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，提示CHC患者存在免疫耐受情況，這與國外的相關(guān)研究結(jié)果相符[12]。MDSCs按細(xì)胞類型可分為G-MDSCs及M-MDSCs[13]。本研究發(fā)現(xiàn)CHC患者組體內(nèi)G-MDSCs水平顯著高于對照組，但M-MDSCs水平與對照組相當(dāng)，說明G-MDSCs與丙肝慢性化密切相關(guān)而M-MDSCs水平與丙肝并無明顯關(guān)系。本觀察組患者采用干擾素聯(lián)合利巴韋林治療后共有72例患者獲得SVR，有28例未獲得SVR，患者SVR比例為72%，該結(jié)果與國內(nèi)的相關(guān)報(bào)道[14]一致。治療后CHC患者體內(nèi)G-MDSCs水平均下降，且SVR組

綜上所述，HCV-RNA對CHC患者G-MDSCs有促進(jìn)作用，G-MDSCs對患者體內(nèi)CD4+T、CD8+T水平有抑制作用，對CHC患者使用干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療起到不良的臨床預(yù)后影響。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Effect of myeloid-derived suppressor cells on the clinical prognosis of interferon and Ribavirin in treatment of chronic hepatitis C patients

MENG Xuefei, LI Hongbing

Department of Infectious Disease, Weinan Central Hospital, Weinan 714000, China

Objective To investigate the effect of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) on the clinical prognosis of interferon and Ribavirin in treatment of chronic hepatitis C (CHC).Methods One hundred patients with CHC in Weinan Central Hospital from Jan. 2012 to Jan. 2014 were treated with interferon and Ribavirin for antiviral therapy, and 100 healthy persons were selected as control group. According to the phenotype of MDSCs, which can be divided into granulocyte MDSCs (G-MDSCs) and monocytic MDSCs (M-MDSCs). The MDSCs, CD4+T and CD8+T levels in patients with CHC and control group were compared, and the levels of HCV-RNA, MDSCs, CD4+T, and the levels of CHC after treatment were compared. After treatment, CHC patients were divided into achieving sustained virologic response (SVR) and non-getting SVR (non-SVR), the levels of CD4+T and CD8+T in patients with non-SVR were compared between MDSCs rejection group and MDSCs non-rejection group.Results Before treatment, the CD4+T and CD8+T in the patients with CHC were significantly lower than those in the control group (P<0.05). The levels of HCV-RNA and G-MDSCs in patients with CHC were higher than those in control group (P<0.05). There was no significant difference in M-MDSCs level between two groups (P>0.05). There was statistical significance in HCV-RNA, G-MDSCs, CD4+T, CD8+T among CHC group before treatment and SVR group and non-SVR group after treatment (P<0.05); but there was no statistically significant difference in the level of M-MDSCs (P>0.05). There was significant difference in CD4+T, CD8+T between the MDSCs rejection group and the MDSCs non-rejection group (P<0.05).Conclusion Interferon and Ribavirin antiviral therapy can reduce the level of HCV-RNA in patients with CHC, and promote the role of G-MSCs, G-MDSCs can inhibit CD4+T and CD8+T levels, and it plays adverse clinical prognosis for CHC patients with interferon and Ribavirin antiviral therapy.

Myeloid-derived suppressor cells; Chronic hepatitis C; Interferon; Ribavirin

孟雪飛，主治醫(yī)師，E-mail：mengxuefeimxf@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.03.017

R512.6+3

A 文章編號：1006-5709(2017)03-0307-04

2016-08-06