NET-1活化NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)子宮頸鱗癌微血管生成

張雨婷，張文輝，熊秀娟，況曉東，宋恩霖

NET-1活化NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)子宮頸鱗癌微血管生成

張雨婷1，張文輝2，熊秀娟1，況曉東1，宋恩霖1

目的 探討NET-1表達(dá)與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其分子機(jī)制。方法 采用免疫組化MaxVision法檢測(cè)80例子宮頸鱗癌、10例慢性子宮頸炎組織中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白表達(dá)。采用CD34內(nèi)皮標(biāo)記，結(jié)合Weinner計(jì)數(shù)法檢測(cè)子宮頸鱗癌組織的微血管密度(microvascular density, MVD)。通過陽離子脂質(zhì)體將真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-NET-1轉(zhuǎn)染子宮頸鱗癌細(xì)胞以獲得NET-1基因過表達(dá)；利用NF-κB特異抑制劑PDTC處理子宮頸鱗癌細(xì)胞以抑制NF-κB的激活；應(yīng)用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白的表達(dá)。結(jié)果 子宮頸鱗癌組織中NET-1呈高表達(dá)，NET-1表達(dá)與子宮頸鱗癌MVD、NF-κB p65和VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。NET-1基因轉(zhuǎn)染引起子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞胞核NF-κB p65和胞質(zhì)VEGF水平上高，應(yīng)用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理SiHa細(xì)胞能顯著抑制NET-1引起的VEGF表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 NET-1促進(jìn)子宮頸鱗癌微血管生成，其機(jī)制與NET-1激活子宮頸鱗癌NF-κB信號(hào)途徑上調(diào)VEGF表達(dá)有關(guān)。

子宮頸腫瘤；鱗癌；NET-1；NF-κB；VEGF；微血管生成

實(shí)體腫瘤血管形成與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，微血管增生在子宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，與子宮頸癌不良預(yù)后顯著相關(guān)[1]。故研究腫瘤血管生成相關(guān)調(diào)節(jié)因子及其作用機(jī)制，對(duì)腫瘤生物的治療具有重要意義。NET-1是小G蛋白R(shí)hoA特異的鳥苷酸交換因子，通過激活RhoA信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架重排，具有類似原癌基因的功能。目前已發(fā)現(xiàn)，NET-1的表達(dá)與子宮頸癌、肺癌、肝癌和膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但NET-1與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系尚未見報(bào)道。Vessichelli等[2]報(bào)道，NET-1與CARMA蛋白相互作用激活NF-κB信號(hào)途徑。NF-κB信號(hào)途徑參與缺氧情況下HIF-1的轉(zhuǎn)錄活化，最終上調(diào)與血管生成相關(guān)的下游靶基因如VEGF等的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的微血管生成。本文通過檢測(cè)子宮頸鱗癌組織中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白的表達(dá)，結(jié)合CD34內(nèi)皮標(biāo)記檢測(cè)腫瘤微血管密度(microvascular density, MVD)，并在細(xì)胞學(xué)水平觀察NET-1對(duì)子宮頸癌細(xì)胞NF-κB的激活作用及其對(duì)下游VEGF表達(dá)的影響，分析NET-1與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的浸潤(rùn)性子宮頸鱗癌石蠟包埋標(biāo)本80例，患者平均年齡44歲，其中低分化27例，中+高分化53例。按FIGO(2014)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期48例，Ⅱ期32例。腫瘤直徑≥4 cm者22例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，脈管浸潤(rùn)陽性者28例。所有患者術(shù)前均未行放、化療，另取10例慢性子宮頸炎標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 免疫組化 免疫組化采用MaxVision法染色，3～5 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟，檸檬酸抗原熱修復(fù)，3%H2O2處理，PBS漂洗。一抗兔抗人多克隆NET-1抗體，購(gòu)自ProteinTech公司；兔抗人NF-κB p65 抗體，購(gòu)自Abnova公司；兔抗人VEGF抗體，購(gòu)自Abgent公司；工作液50 μL，4 ℃過夜，PBS洗滌后50 μL MaxVision二抗工作液(KIT-5010，福州邁新公司)，室溫下孵育30 min，洗滌后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

測(cè)量平均光密度(mean optic density, MOD)進(jìn)行蛋白表達(dá)半定量結(jié)果判定。在光鏡下(×400)選取腫瘤組織中陽性最強(qiáng)的5個(gè)高倍視野，數(shù)碼拍照，圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0準(zhǔn)確分割陽性區(qū)域，測(cè)量MOD值。相同條件下，每張圖片測(cè)量3次，以3次測(cè)量的均值作為該視野中蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。最后再以同一切片5個(gè)不同視野的MOD均數(shù)，作為該切片所代表的樣本組織中蛋白的平均表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 MVD檢測(cè) 采用Weidner法檢測(cè)子宮頸癌組織中MVD。CD34免疫組化染色后(鼠抗人CD34單克隆抗體，福州邁新公司)以黃色顆粒狀標(biāo)記的血管內(nèi)皮為標(biāo)準(zhǔn)，切片在光鏡下(×100)挑選MVD分布最高區(qū)域，在光鏡下(×200)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野中被CD34染成陽性的微血管數(shù)量，取其平均值作為MVD值。每個(gè)與鄰近微血管分離明顯的陽性染色單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇均視為1個(gè)獨(dú)立的微血管，結(jié)構(gòu)不相連的分支血管結(jié)構(gòu)也計(jì)作1個(gè)微血管。直徑>8個(gè)紅細(xì)胞的血管，帶有厚的平滑肌血管或者硬化壞死區(qū)血管不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。

1.4 子宮頸癌細(xì)胞NET-1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 SiHa細(xì)胞(TCHu113，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫)用含10%胎牛血清、10%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2×105/mL接種于24孔板，待生長(zhǎng)達(dá)90%～95%融合度時(shí)，更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。分別用無血清培養(yǎng)基50 μL稀釋0.8 μg的pCMV6-NET-1表達(dá)質(zhì)粒(SC321265，OriGene公司)和2 μL脂質(zhì)體Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)，室溫靜止5 min，兩者混合制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫靜止25 min，加入對(duì)應(yīng)孔板中。利用空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照，利用未轉(zhuǎn)染組為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基為不含雙抗含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，通過Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.5 Western blot法 利用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用以檢測(cè)NET-1和VEGF蛋白表達(dá)；利用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(Cwbiotech公司)提取細(xì)胞核蛋白，用于檢測(cè)細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)。蛋白濃度測(cè)定后，按每孔20 μL上樣量用Loading Buffer配平，沸水加熱后上樣，行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。經(jīng)洗滌后，加入一抗(工作濃度1 ∶1 000，內(nèi)參β-actin為1 ∶5 000，β-actin鼠單克隆抗體，購(gòu)自ProteinTech公司)，37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜；PBST洗滌后加入二抗(工作濃度1 ∶5 000)。洗滌膜后，利用Easy See化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光，顯影。利用Image Tool測(cè)量目的蛋白條帶和內(nèi)存條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)存灰度值的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸鱗癌組織中NET-1表達(dá)及其與NF-κB p65和VEGF表達(dá)的關(guān)系 腫瘤組織HE染色顯示，瘤細(xì)胞呈巢、團(tuán)狀分布，與纖維性間質(zhì)分界清楚，部分瘤組織中可見角化現(xiàn)象，為浸潤(rùn)性子宮頸鱗癌。子宮頸炎組織中，NET-1弱表達(dá)于鱗狀上皮顆粒細(xì)胞層和棘細(xì)胞層細(xì)胞胞核，且呈散在分布。NET-1表達(dá)于癌巢中腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞核，呈棕褐色顆粒，癌巢周圍纖維性間質(zhì)偶見少量表達(dá)(圖1)。NF-κB p65主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞核，呈棕黃色顆粒，部分瘤細(xì)胞呈胞質(zhì)和胞核陽性(圖2)。VEGF表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，癌巢周血管組織和少量纖維間質(zhì)可見表達(dá)(圖3)。光密度檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，子宮頸鱗癌組織中NET-1的平均表達(dá)強(qiáng)度顯著高于慢性子宮頸炎組織(表1)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NET-1表達(dá)分別與NF-κB和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.272，P=0.015；rs=0.325，P=0.003)。

表1 慢性子宮頸炎和子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達(dá)(±s)

2.2 子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達(dá)與MVD的關(guān)系 CD34內(nèi)皮標(biāo)記顯示，子宮頸鱗癌微血管分布于癌巢之間和癌巢內(nèi)瘤細(xì)胞之間(圖4)，平均MVD為21.1。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，NET-1表達(dá)水平較高組(以NET-1的總體平均表達(dá)強(qiáng)度0.182±0.036為分組臨界值)的子宮頸鱗癌組織中MVD顯著高于NET-1表達(dá)水平較低組(t=-2.113，P=0.038)。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示，NET-1的表達(dá)與子宮頸鱗癌MVD呈正相關(guān)(rs=0.291，P=0.009)。

2.3 NET-1通過活化NF-κB信號(hào)途徑上調(diào)VEGF表達(dá) NET-1基因轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組SiHa細(xì)胞NET-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別為0.986±0.021、0.523±0.015和0.508±0.018(圖5)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NET-1的表達(dá)顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組(t=1.08，P<0.001)和空白未轉(zhuǎn)染組(t=29.45，P<0.001)，而陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組之間差異無顯著性，提示NET-1基因轉(zhuǎn)染顯著提高SiHa細(xì)胞NET-1蛋白的表達(dá)水平。與此同時(shí)，在陽性轉(zhuǎn)染組胞核NF-κB p65和細(xì)胞VEGF的表達(dá)水平(1.27±0.085、0.87±0.032)均分別顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組(0.55±0.010，t=14.50，P<0.001；0.37±0.011，t=25.89，P<0.001)和空白未轉(zhuǎn)染組(0.52±0.035，t=13.99，P<0.001；0.035±0.029，t=21.1，P<0.001)。利用NF-κB激活的特異抑制劑PDTC(本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存)預(yù)處理SiHa細(xì)胞，再對(duì)該組細(xì)胞和另一組未處理的正常SiHa細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行NET-1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在預(yù)處理組細(xì)胞NF-κB信號(hào)激活受抑制的情況下，該組VEGF的表達(dá)水平(0.39±0.036)顯著低于未處理組(0.86 ± 0.032，t=16.9，P<0.001，圖6)。

①②③④

圖1 子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達(dá)，呈胞質(zhì)和胞核陽性，MaxVision法 圖2 子宮頸鱗癌組織中NF-κB p65的表達(dá)，呈胞核陽性，部分呈胞核和胞質(zhì)陽性，MaxVision 法 圖3 子宮頸鱗癌組織中VEGF的表達(dá)，呈胞質(zhì)陽性，MaxVision 法 圖4 子宮頸鱗癌組織中CD34內(nèi)皮標(biāo)記的微血管，MaxVision法

圖5 NET-1基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組SiHa細(xì)胞中NET-1、胞核NF-κB p65和細(xì)胞VEGF的表達(dá)

3

圖6 PDTC對(duì)NET-1基因轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞中胞核NF-κB p65和細(xì)胞VEGF表達(dá)水平的影響

3 討論

NET-1最初通過基因克隆技術(shù)在神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)研究證實(shí)其為小G蛋白家族RhoA特異的鳥苷酸交換因子，能激活RhoA信號(hào)途徑，因而認(rèn)為NET-1能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和骨架重排等一系列重要生物學(xué)過程。相繼有較多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，NET-1與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如NET-1的表達(dá)能促進(jìn)胃癌[3]、皮膚癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]和肝癌[7]的增殖和浸潤(rùn)能力，且NET-1的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌[8]預(yù)后不良有關(guān)。NET-1促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制主要與其激活RhoA有關(guān)，如NET-1通過激活RhoA調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞骨架重排從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移浸潤(rùn)能力[3]，而NET-1活化的RhoA對(duì)于TGFβ介導(dǎo)的乳癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是必須的[9]。NET-1分子結(jié)構(gòu)上隸屬于含4個(gè)跨膜區(qū)域蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)，其功能是作為分子的服務(wù)性蛋白，通過結(jié)合特異的細(xì)胞表面蛋白，增強(qiáng)功能性信號(hào)復(fù)合物的形成和穩(wěn)定，從而參與細(xì)胞的活化與增殖、黏附與遷移等。Carr等[10]研究證實(shí)，NET-1與FAK相互作用并激活FAK參與調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力。最近文獻(xiàn)報(bào)道[2]，NET-1能與CARMA家族蛋白結(jié)合，從而介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活。Panahi等[11]實(shí)驗(yàn)表明，NF-κB信號(hào)途徑的激活是實(shí)體腫瘤微血管生成重要機(jī)制之一，故NET-1可能通過激活NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)腫瘤微血管生成。然而，目前關(guān)于NET-1與腫瘤血管生成的關(guān)系報(bào)道較少。評(píng)價(jià)腫瘤血管形成程度的最客觀標(biāo)準(zhǔn)是MVD，而CD34是目前較敏感的血管標(biāo)志物，對(duì)腫瘤組織內(nèi)微小血管及新生的不完整血管較為敏感[12]。本課題通過CD34標(biāo)記微血管內(nèi)皮檢測(cè)子宮頸癌MVD，免疫組化檢測(cè)子宮頸癌組織中NET-1、NF-κB p65和VEGF的表達(dá)，并進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，分析NET-1與子宮頸癌細(xì)胞血管誘生能力的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與慢性子宮頸炎組織相比，NET-1在子宮頸鱗癌組織中高表達(dá)，提示NET-1可能參與子宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NET-1的表達(dá)與子宮頸癌MVD、NF-κB p65和VEGF分別呈正相關(guān)，提示NET-1促進(jìn)子宮頸癌微血管增生可能與激活NF-κB信號(hào)途徑進(jìn)而上調(diào)子宮頸癌VEGF表達(dá)有關(guān)。NF-κB受上游信號(hào)因子激活后，p65亞單位易位至細(xì)胞核，通過其DNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)利用NET-1表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，并檢測(cè)胞核p65和胞質(zhì)VEGF的表達(dá)，分析NET-1的表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)的活化及其對(duì)VEGF表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中NET-1表達(dá)水平顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組，說明基因轉(zhuǎn)染成功；且細(xì)胞中NF-κB p65和VEGF的表達(dá)水平也分別顯著提高，提示NET-1激活子宮頸癌細(xì)胞NF-κB信號(hào)且上調(diào)VEGF的表達(dá)。為進(jìn)一步闡明NF-κB的激活與VEGF上調(diào)的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)利用NF-κB特異的激活抑制劑PDTC預(yù)處理SiHa細(xì)胞，觀察在NF-κB信號(hào)受抑的情況NET-1對(duì)VEGF表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在NET-1轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞中，PDTC顯著抑制NF-κB p65的細(xì)胞核水平，同時(shí)VEGF的表達(dá)水平也顯著下降，提示NET-1能通過活化NF-κB信號(hào)上調(diào)子宮頸癌VEGF的表達(dá)。H?lters等[13]證實(shí)NET-1能促進(jìn)子宮頸癌SiHa細(xì)胞體外浸潤(rùn)能力，且排除NET-1對(duì)子宮頸癌FAK和PI3K信號(hào)的激活作用，但并未分析NET-1對(duì)NF-κB的激活作用。NET-1促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞浸潤(rùn)能力是否也與NF-κB的活化有關(guān)，尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為NET-1表達(dá)能促進(jìn)子宮頸癌微血管生成，且其分子機(jī)制與NET-1活化NF-κB信號(hào)途徑，進(jìn)而上調(diào)VEGF表達(dá)以增強(qiáng)子宮頸癌血管誘生能力有關(guān)。

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NET-1 promote the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma by activating NF-kappa B signaling pathway

ZHANG Yu-ting1, ZHANG Wen-hui2, XIONG Xiu-juan1, KUANG Xiao-dong1, SONG En-lin1

(1DepartmentofPathology,MedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Purpose To explore the association of NET-1 expression with the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma and the related molecular mechanism. Methods Immunohistochemistry MaxVision was used to detect the expression of NET-1, NF-κB p65 and VEGF in 80 cases of cervical squamous cancer tissue and 10 cases of chronic cervicitis tissue. The microvascular density (MVD) was assessed by labeling endothelia with CD34- antibody and counted according to Weinner’s standard. The eukaryotic expression plasmid pCMV6-NET-1 was transfected into cervical squamous cancer cells by cationic liposome in order to obtain over expression of NET-1 gene.In order to inhibit the activation of NF-kappa B, cervical squamous carcinoma cells were treated with NF-kappa B specific inhibitor PDTC. The protein expression in SiHa cells was assessed by Western blotting. Results The expression level of NET-1 in the cervical squamous carcinoma tissue was significantly higher than that in the tissue of control group. NET-1 expression was positively correlated to the MVD, NF-κB p65 and VEGF expression, respectively. Transient transfection of NET-1 gene significantly increased the nuclear expression of NF-κB p65 and cytoplasm expression of VEGF in the SiHa cells. However, pretreatment of SiHa cells with NF- inhibitor PDTC significantly inhibited NET-1 induced upregulation of VEGF expression. Conclusion NET-1 promotes the angiogenesis of cervical squamous carcinoma through the activation of the NF-κB signaling which upregulate the expression of VEGF in the cancer cells.

cervical neoplasm； squamous carcinoma； NET-1； NF-κB； VEGF； angiogenesis

時(shí)間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.008.html

江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ14087)、江西省科技廳科技支撐計(jì)劃(2014BBG70066)

1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，南昌 3300062中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510080

張雨婷，女，碩士研究生。E-mail: 1977363165@qq.com 宋恩霖，男，博士，副教授，通訊作者。E-mail: songenling@126.com

R 737.33

A

1001-7399(2017)03-0268-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.008

接受日期：2017-01-07