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    廣西人群EPCR基因3′-非編碼區(qū)rs9574 C/G位點(diǎn)的多態(tài)性

    2017-06-05 15:06:03梁燕冰彭丁偉黃雨晴韋葉生羅維貴廖品琥
    關(guān)鍵詞:等位基因多態(tài)性基因型

    梁燕冰,彭丁偉,黃雨晴,韋葉生,羅維貴,李 軍,廖品琥

    廣西人群EPCR基因3′-非編碼區(qū)rs9574 C/G位點(diǎn)的多態(tài)性

    梁燕冰1,彭丁偉2,黃雨晴1,韋葉生1,羅維貴1,李 軍1,廖品琥1

    目的 探討廣西地區(qū)健康人群與不同地區(qū)、種族人群的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial cell protein C receptor, EPCR)基因rs9574 C/G(4678 C/G)位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率的差異。方法 通過單堿基延伸的PCR技術(shù)及DNA測序法檢測130例廣西正常體檢人群EPCR基因3′-非編碼區(qū)rs9574 C/G基因型及等位基因型頻率,并對比分析其與中國北京人、非洲人、日本人和歐洲人的基因型及等位基因型頻率分布差異。結(jié)果 廣西地區(qū)健康人群EPCR基因rs9574 C/G位點(diǎn)存在三種基因型,分布頻率分別為CC(39.2%)、CG(46.2%)、GG(14.6%),等位基因頻率分別為C(62.3%)、G(37.7%)。rs9574 C/G位點(diǎn)基因型及等位基因型分布頻率在男女組間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。廣西人群rs9574 C/G位點(diǎn)基因型分布頻率與歐洲人和非洲人相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05),而與日本人、中國北京人相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);等位基因分布頻率與非洲人、歐洲人和日本人相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與中國北京人相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 廣西地區(qū)人群EPCR基因3′-非編碼區(qū)rs9574 C/G位點(diǎn)多態(tài)性在不同地區(qū)、種族人群間的分布頻率存在差異。

    內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體;多態(tài)性;廣西

    EPCR作為蛋白C(protein C, PC)、活化蛋白C(activated protein C, APC)的高親和力受體,并通過與APC結(jié)合促進(jìn)凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物形成,加速纖溶抑制物活化進(jìn)而抑制補(bǔ)體系統(tǒng),主要表達(dá)于大血管的內(nèi)皮細(xì)胞表面,參與PC的活化,在炎癥疾病中發(fā)揮相應(yīng)的作用[1]。近年來隨著分子技術(shù)和人類基因組研究的不斷深入,內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial cell protein C receptor, EPCR)的基因多態(tài)性對人類疾病的影響越來越受到學(xué)者們的重視。多項(xiàng)研究表明EPCR的基因多態(tài)性與白血病[2]、靜脈血栓栓塞癥[3]等疾病的發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過對比EPCR基因rs9574 C/G位點(diǎn)的等位基因與基因型頻率在廣西健康人群與不同地區(qū)、種族人群之間的分布差異,分析基因遺傳的差異性表達(dá),為探討同一疾病在不同地域、人群中的遺傳學(xué)規(guī)律提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 根據(jù)知情同意并自愿參與原則,標(biāo)本選取廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診體檢人群,所有受試對象均為長期居住本地的人群,臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)、無血緣關(guān)系的體檢者130例,其中男性96例,女性34例,年齡20~79歲。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本制備 采用乙二胺四乙酸三鉀(EDTA-K3)抗凝采血管收集全部受試對象外周靜脈血2 mL,使用離心柱法提取DNA,-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 EPCR基因rs9574 C/G序列來自NCBI Genebank,使用在線Primer 3 軟件設(shè)計(jì)(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)引物,并由上海天昊遺傳分析中心合成。rs9574上游引物:5′-ATGGACTCCTTGGGGGCCTATT-3′;下游引物:5′-GTGGGCAGATGTGGGAGAAGAA-3′;擴(kuò)增片段長度是310 bp;延伸引物:5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAATCCAGCCCCTTC TGA-3′。

    1.2.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系(20 μL)包含1× GC-I Buffer(Takara公司)、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq Polymerase (Qiagen Inc.)、1 μL樣本DNA、1 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)程序:95 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性20 s,65 ℃退火 40 s,72 ℃延伸1.5 min,重復(fù)11個(gè)循環(huán);然后94 ℃變性20 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,重復(fù)24個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸2 min,產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL PCR產(chǎn)物,加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶純化后進(jìn)行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng),取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測序儀,測序儀收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co., Ltd., USA)進(jìn)行分析(上海天昊公司協(xié)助完成)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析,組間基因型及基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 EPCR基因分型 rs9574C/G位點(diǎn)存在基因多態(tài)性,其基因測序驗(yàn)證結(jié)果詳見圖1。

    2.2 廣西地區(qū)EPCR基因型及等位基因分布 將廣西地區(qū)130例正常體檢人群EPCR基因rs9574 C/G位點(diǎn)的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(表1),結(jié)果顯示符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,具有群體代表性。比較rs9574 C/G位點(diǎn)男女組間多態(tài)性分布頻率,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其中基因型以CG最多見,占46.2%;等位基因以C頻率最高,占62.3%(表2)。

    圖1 EPCR基因 rs9574 C/G位點(diǎn)測序圖1、2、3分別表示CC、GG、CG基因型

    位點(diǎn)實(shí)際例數(shù)基因型Hardy-Weinberg理論例數(shù)基因型χ2值P值rs9574CCCGGGCCCGGG0.0390.84351601950.46961.06218.469

    表2 廣西人群EPCR基因rs9574 C/G位點(diǎn)基因型及等位基因頻率男女間的分布[n(%)]

    表3 不同地區(qū)人群EPCR基因rs9574 C/G位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的比較[n(%)]

    2.3 各地區(qū)人群間基因型及等位基因的比較 對比分析中國廣西健康人群與人類基因組計(jì)劃(Hapmap)公布的中國北京人、非洲人、日本人和歐洲人的基因多態(tài)性數(shù)據(jù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/),結(jié)果顯示廣西人群EPCR基因rs9574 C/G位點(diǎn)基因型分布頻率與歐洲和非洲人群相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與北京、日本人群相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);廣西人群rs9574 C/G位點(diǎn)等位基因分布頻率與非洲、歐洲、日本人群相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與中國北京人群相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3)。

    3 討論

    EPCR蛋白是I型跨膜糖蛋白,可將PC遞呈給凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物,提高PC的活化。EPCR主要通過介導(dǎo)APC間接發(fā)揮抗炎、抗凝及細(xì)胞保護(hù)作用[4],影響著相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展。

    EPCR基因(PROCR)位于20號染色體,全長約8 kb,含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。EPCR 基因存在多種變異,與相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。研究表明,EPCR基因多態(tài)性(rs867186 A/G、rs2069940 C/G)與危重患者發(fā)生嚴(yán)重膿毒癥、膿毒癥休克的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[5]。但也有研究認(rèn)為相同的EPCR基因變異與疾病發(fā)生無關(guān)[6-7],甚至作用相反[8]。

    廣西地處中國南方沿海,為多民族聚居的自治區(qū),由于其獨(dú)特的地貌、人群及生活環(huán)境相對穩(wěn)定。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rs9574 C/G位點(diǎn)則以CG基因型(46.2%)及等位基因C(62.3%)頻率最高,該位點(diǎn)基因型及等位基因分布的主要形式,與來自不同種族的報(bào)道(人類基因組計(jì)劃)基本相似,但其相對頻率的分布有種族差異。rs9574 C/G位點(diǎn)基因型及等位基因型分布頻率與歐洲人和非洲人相比,差異有顯著性,其中等位基因型分布頻率還與日本人不同。作者前期針對不同基因位點(diǎn)與其他地區(qū)人群比較的研究,發(fā)現(xiàn)廣西人群不同基因位點(diǎn)的多態(tài)性與人類基因組計(jì)劃公布的不同地區(qū)人群的基因多態(tài)性之間存在明顯差異[9-10]?;蚨鄳B(tài)性的差異影響某些疾病,如膿毒癥[11]、腫瘤[12]等疾病的易感性與臨床表現(xiàn)。有研究顯示EPCR基因rs9574可以降低早發(fā)性心肌梗死患者和靜脈血栓形成的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。但對非洲地區(qū)加納重癥瘧疾患者的一項(xiàng)研究結(jié)果表明,rs9574與重癥瘧疾的易感性無關(guān)[15]。

    單核苷酸基因多態(tài)性作為人群、地域的一種標(biāo)志,與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。不同地區(qū)、種族的人群“遺傳背景”不盡相同,研究分析不同地域、人群EPCR基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系有一定的意義。本組實(shí)驗(yàn)提示中國廣西健康人群EPCR基因rs9574 C/G位點(diǎn)多態(tài)性與不同地區(qū)和種族人群之間的分布存在差異,體現(xiàn)了“基因-蛋白-疾病”的研究思路,不僅為相關(guān)疾病易感人群的識別提供重要理論依據(jù),同時(shí)在分子生物學(xué)層面研究疾病打下了基礎(chǔ)。由于本組實(shí)驗(yàn)對象集中于特定的地理區(qū)域(廣西),實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的地域代表性。基因多態(tài)性的研究將更有助于人們對疾病的預(yù)防、認(rèn)識與治療。由于本實(shí)驗(yàn)樣本量較少,并受到環(huán)境因素及實(shí)驗(yàn)因素等影響,這種分布差異仍需大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),以便更好地為中國廣西人群EPCR基因多態(tài)性對疾病的影響提供更可靠的結(jié)果,保持科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)性。

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    Genetic polymorphism of rs9574 C/G of endothelial cell protein C receptor gene in Guangxi population

    LIANG Yan-bing1, PENG Ding-wei2, HUANG Yu-qing1, WEI Ye-sheng1, LUO Wei-gui1, LI Jun1, LIAO Pin-hu1

    (1CriticalCareMedicine,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China;2DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

    Purpose To compare the difference of the genotype and allele of endothelial cell protein C receptor (EPCR)gene rs9574 C/G between Guangxi population and other ethnic groups. Methods The rs9574 C/G polymorphisms of EPCR in 130 cases of Guangxi population were detected by PCR and DNA sequencing. The distribution frequency of allele and genotype was compared with the other four ethnic groups (HapMap-CEU, HapMap-HCB, HapMap-JPT, HapMap-YRI), which was published by the human genome project. Results Three genotypes of CC, CT and TT were found in rs9574 C/G with the frequencies of 39.2%, 46.2%, 14.6% respectively. the allele frequencies of C, T were 62.3% and 37.7%. No significant difference was observed in the frequency of genotype and allele between male and female (P>0.05). There were significant differences in the genotype distribution among Guangxi population, HapMap-CEU and HapMap-YRI (P<0.05). Significant differences of allelic frequency were found among Guangxi population, HapMap-CEU, HapMap-JPT and HapMap-YRI. Conclusion The polymorphisms of rs9574C/G in 3′-noncoding region of EPCR gene in Guangxi population were different in different regions and ethnic groups.

    endothelial cell protein C receptor; polymorphism; Guangxi

    時(shí)間:2017-3-16 14:23

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.004.html

    國家自然科學(xué)基金(81560321)、2014年廣西醫(yī)學(xué)高層次骨干人才“139”計(jì)劃培養(yǎng)人選項(xiàng)目、廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃(YCSZ2015222)、廣西高校急重癥分子免疫研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(yy2015ky002)

    1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,百色 5330002廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科,南寧 530021

    梁燕冰,女,碩士研究生。E-mail: liangyanbing520@163.com 廖品琥,男,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,通訊作者。 E-mail: liaopinhu@163.com

    R 466.1

    A

    1001-7399(2017)03-0249-04

    10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.004

    接受日期:2017-01-18

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