AEG-1與MMP-9在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義①

宋 瑒,王彩霞

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，黑龍江 佳木斯 154003)

AEG-1與MMP-9在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義①

宋 瑒,王彩霞

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討星形膠質(zhì)細(xì)胞升高基因1(Astrocyteelecatedgene-1,AEG-1)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)在甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)中的表達(dá)及意義。方法：采用免疫組化EnVision法檢測(cè)63例PTC及30例癌旁正常組織中AEG-1和MMP-9的表達(dá)，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果：AEG-1和MMP-9在PTC組中的陽(yáng)性率分別為68.3%(43/63)、60.3%(38/63)，在癌旁正常對(duì)照組陽(yáng)性率分別為23.6%(8/30)和16.7%(5/30)，AEG-1和MMP-9在PTC中陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織(χ2=14.192，P<0.05；χ2=15.577，P<0.05)。PTC中AEG-1和MMP-9表達(dá)具有一致性。AEG-1和MMP-9的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者性別、年齡無(wú)相關(guān)性，且AEG-1和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.142,P<0.05)。結(jié)論：AEG-1和MMP-9的表達(dá)與PTC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)二者可能對(duì)PTC的診斷及轉(zhuǎn)移潛能提供新的理論依據(jù)。

AEG-1；MMP-9；甲狀腺乳頭狀癌；免疫組織化學(xué)

甲狀腺癌是甲狀腺腫瘤最常見的類型，占甲狀腺惡性腫瘤的70%～80%。女性比男性常見?？砂l(fā)生于任何年齡，最初診斷時(shí)的平均年齡大約為40歲。兒童的甲狀腺惡性腫瘤90%為甲狀腺乳頭狀癌。甲狀腺乳頭狀癌在臨床表現(xiàn)為甲狀腺的腫塊，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生受環(huán)境、遺傳及激素因素的影響或這些因素的相互作用。部分患者有頸部放射線接觸史。多數(shù)患者較早出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，部分轉(zhuǎn)移還可至肺、骨、腦、肝等部位[1]。甲狀腺癌的診斷貴在早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。經(jīng)典型PTC與伴隨乳頭狀增生的甲狀腺結(jié)節(jié)在病理診斷中有時(shí)難以區(qū)別。本研究通過免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)TPC及甲狀腺組織中AEG-1、MMP-9的表達(dá)情況。探討AEG-1、MMP-9與PTC發(fā)生、發(fā)展中的作用，為進(jìn)一步揭示AEG-1、MMP-9在腫瘤中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。星形膠質(zhì)細(xì)胞升高基因1(AEG-1)是近年多項(xiàng)研究表明AEG-1與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因，AEG-1是可促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的致癌基因，以及與化療藥物抵抗等特征有關(guān)[2,3]。基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)具有很強(qiáng)的水解Ⅳ型膠原的能力，是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中最直接、最重要的金屬蛋白酶之一。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選取2010-06～2015-12佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科保存的經(jīng)手術(shù)切除的甲狀腺乳頭狀癌的石蠟標(biāo)本63例作為研究對(duì)象(63例均已證實(shí)為原發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌)隨機(jī)選取同期切除的癌旁正常甲狀腺組織30例。所有病例標(biāo)本采用上述甲狀腺乳頭狀癌的蠟塊標(biāo)本作3μm厚的連續(xù)切片，用免疫組化EnVision法染色后觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)患者性別、年齡(其中女28例、男35例，年齡15～78歲)、癌腫大小(腫瘤大體d≤2.0cm者30 例，d>2.0cm者33例)、及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例(其中10例為微小乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例。

1.2 試劑

兔抗人AEG-1多克隆抗體購(gòu)自CellSignalingTechnology公司；鼠抗人MMP-9單克隆抗體工作液、即用型快捷免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)

采用免疫組化EnVision法，分別對(duì)TPC和正常甲狀腺組織用AEG-1和MMP-9抗體染色，統(tǒng)計(jì)表達(dá)情況。用胃癌組織做陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液替代一抗做陰性對(duì)照。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn)

鏡下觀察組織切片的染色強(qiáng)度，AEG-1和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)胞質(zhì)黃色、棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。根據(jù)Beesley和Mclaren[4]分級(jí)方法，每張切片觀察5個(gè)高倍視野(×400)，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占的比例兩者乘積作為判讀標(biāo)準(zhǔn)。按陽(yáng)性的細(xì)所占比例計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞占<5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占5%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞占6%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞占>50%記3分, 陽(yáng)性細(xì)胞占>75%記4分；染色強(qiáng)度標(biāo)判定計(jì)分，無(wú)色為0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分，兩種評(píng)分相乘，將結(jié)果分為：0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性()，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)系統(tǒng)軟件處理，AEG-1和MMP-9臨床病理因素采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。AEG-1 與MMP-9相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1AEG-1在PTC及癌旁正常甲狀腺組織中的表達(dá)

AEG-1在大部分PTC中表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)為68.3%，在癌旁正常組織陽(yáng)性率僅為26.7%，AEG-1在PTC的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而AEG-1在PTC中的表達(dá)與腫瘤直徑大小(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)有關(guān),但與患者性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。

2.2MMP-9在PTC及癌旁正常甲狀腺組織中的表達(dá)

MMP-9在PTC中陽(yáng)性表達(dá)率為60.3%，在癌旁正常甲狀腺組織陽(yáng)性表達(dá)率僅為16.7%，MMP-9在PTC中陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MMP-9在PTC中的表達(dá)與腫瘤直徑大小(P<0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)有關(guān)，但與患者性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。

2.3AEG-1與MMP-9表達(dá)與PTC參數(shù)相關(guān)關(guān)系

AEG-1高表達(dá)組中，MMP-9的陽(yáng)性率為72.1%。該值顯著高于MMP-9在陰性組中的表達(dá)(AEG-1陰性組中，MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)率為35.0%)，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.847，P<0.05)。Spearman相關(guān)分析檢測(cè)得出(r=0.142,P<0.05)。AEG-1與MMP-9在PTC中的表達(dá)呈正相關(guān)。見表1。

表1 AEG-1和MMP-9在PTC中表達(dá)的相互關(guān)系

3 討論

腫瘤大小不一，從<1cm(微小癌)到幾個(gè)厘米，并常見多中心生長(zhǎng)。表現(xiàn)為不同的大體形態(tài)，大多數(shù)腫物切面為灰白色、實(shí)性、邊界不清。鏡下，腫瘤形成真正的乳頭(有纖維血管軸心)，乳頭通常復(fù)雜，具有分支，排列方向無(wú)序。毛玻璃樣細(xì)胞核，核較大并有重疊?？梢姾藴霞昂藘?nèi)假包涵體。砂粒體的出現(xiàn)高度提示微乳頭狀癌的診斷。免疫組化染色：細(xì)胞角蛋白(CK)陽(yáng)性，CK7+/CK20-，角蛋白19和高分子角蛋白染色陽(yáng)性對(duì)診斷有一定的幫助，甲狀腺球蛋白(Tg)和甲狀腺轉(zhuǎn)化因子-1(TTF-1)陽(yáng)性，其他抗體包括galectin-3和HBME-1，雖然他們?cè)谌轭^狀癌中高比例表達(dá)，但并無(wú)特異性。多數(shù)患者較早發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，還可轉(zhuǎn)移至肺、骨、腦、肝等部位。PTC原發(fā)灶常較小，但發(fā)現(xiàn)是已轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，本實(shí)驗(yàn)分組中有25%為微小乳頭狀癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成為預(yù)后的重要影響因素，因此了解PTC的轉(zhuǎn)移和侵襲潛能有助于輔助診斷和評(píng)價(jià)甲狀腺癌臨床生物學(xué)行為。甲狀腺癌的診斷貴在早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。

AEG-1是今年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展來(lái)說是一個(gè)關(guān)鍵性的調(diào)控因子。今年研究表明AEG-1高表達(dá)與癌腫細(xì)胞，正常細(xì)胞則為陰性或低表達(dá)。AEG-1能夠抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Hu等[5]研究表明，食管鱗癌中AEG-1陽(yáng)性表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)正常組織。Yu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移AEG-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高，而抑制AEG-1的表達(dá)則可降低乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率。另有研究表明，AEG-1強(qiáng)陽(yáng)性能促使宮頸癌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]。用RNAi技術(shù)抑制AEG-1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌中的表達(dá)率，能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌轉(zhuǎn)移[8]。但目前AEG-1在PTC中的表達(dá)研究較少。本研究表明，AEG-1在PTC中高表達(dá)而在良性甲狀腺病變中僅少數(shù)呈散在弱陽(yáng)性表達(dá)，其余為陰性。因此，AEG-1可為診斷PTC診斷工作提供依據(jù)，AEG-1低表達(dá)有助于良性腫瘤的判斷和初步排除腫瘤存在惡性侵襲能力。

MMP-9基因位于染色體20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族。主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatris)的動(dòng)態(tài)平衡。MMP-9包含一個(gè)V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域,這個(gè)結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用,它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用[9]。MMP-9有許多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白等，細(xì)胞因子及其受體也是MMP-9作用的底物。MMP能分解呼吸道和肺內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)合物如ECM和基底膜,因此能參與呼吸道和肺的重建[10]，它能降解α1抗胰蛋白酶，保護(hù)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性,能加強(qiáng)膠原質(zhì)膠體中膠原細(xì)胞和MMP-13的溶膠原活動(dòng)，它也抑制其他中性粒細(xì)胞的趨化因子。此外，MMP-9結(jié)合CD44可釋放儲(chǔ)存的TGF-β1，另外，MMP-9可通過釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)以參與血管生成。MMP-9分解Ⅳ型膠原分解基底膜，促進(jìn)腫瘤向外和其它器官組織浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本例實(shí)驗(yàn)，MMP-9在PTC高表達(dá)與癌旁甲狀腺組織，因此MMP-9與PTC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PTC常發(fā)生于孤立的小結(jié)節(jié)，病灶常常較小，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，本實(shí)驗(yàn)中25%微小乳頭狀癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。多數(shù)據(jù)報(bào)到認(rèn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素，因此了解PTC的轉(zhuǎn)移和侵襲潛能有助于輔助診斷和評(píng)價(jià)甲狀腺癌臨床生物學(xué)行為。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9高表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)關(guān)，而腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示MMP-9陽(yáng)性率越高，形成Ⅳ型膠原酶能力越強(qiáng)，破壞基底膜能力越大，越容易發(fā)生腫瘤浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步表明檢測(cè)MMP-9對(duì)腫瘤良惡性鑒別及評(píng)估PTC的生物學(xué)行為，提示MMP-9在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，AEG-1與MMP-9協(xié)調(diào)參與了PTC的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測(cè)，可能對(duì)PTC的病理診斷及轉(zhuǎn)移潛能提供新的理論依據(jù)。但是AEG-1和MMP-9之間的相互調(diào)控機(jī)制，及抑癌基因的關(guān)系仍需更進(jìn)一步增加實(shí)驗(yàn)臨床研究。

[1]AHMADA.TheFrequencyofCervicalLymphNodeMetastasisinMultifocalPapillaryThyroid[J].FatimaJinnahMedicalCollegeJournal, 2014, 8(3):90-94

[2]LeeSG,SuZZ,EmdadL,etal.Astrocyteelevatedgene-1 (AEG-1)isatargetgeneofoncogenicHa-rasrequiringphosphatidylinositol3-kinaseandc-Myc[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences, 2006, 103(46):17390-17395

[3]EmdadL,SarkarD,SuZZ,etal.Recentinsightsintoanovelgeneinvolvedintumorprogression,metastasisandneurodegeneration[J].Pharmacology&therapeutics, 2007, 114(2):155-170

[4]BeesleyMF,MclarenKM.Cytokeratin19andgalectin-3immunohistochemistryinthedifferenialdiagnosisofsolitarythyroidnodules[J].Histopathology,2002,41(3):236-243

[5]YuC,ChenK,ZhengH,etal.Overexpressionofastrocyteelevatedgene-1(AEG-1)isassociatedwithesophagealsquamouscellcarcinoma(ESCC)progressionandpathogenesis[J].Carcinogenesis,2009, 30(5):894-901

[6]HuG,ChongRA,YangQ,etal.MTDHactivationby8q22genomicgainpromoteschemoresistanceandmetastasisofpoorprognosisbreastcancer[J].CancerCell,2009,15(1):9-20

[7]LeeSG,JeonHY,SuZZ,etal.AstrocyteElevatedGene-1contributestothepathogenesisofneuroblastoma[J].Onecogene,2009,28(26):2476-2484

[8]EmdadL,SarkarD,SuZZ,etal.Astrocyteelevatedgene- 1:recentinsightsintoanovelgeneinvolvedintumorprogression,metastasisandneurodegeneration[J].PharmacolPharmacolTher,2007,114(2):155-170

[9]胡明,劉振平,黃世杰,等.MMP-9在胃癌中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2013,36(5):18-19

[10]王彩霞,王曉,吳慶田,等.MMP-26和Ki67在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2012,35(4):83-84

宋瑒(1989～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

王彩霞(1964～)女, 黑龍江佳木斯人,學(xué)士，主任醫(yī)師，教授,碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:wcx19641027@163.com。

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1008-0104(2017)02-0128-02

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