黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死實驗研究①

孫 慶，季慶輝，劉智勇，呂思銳，李 煜，高博一

(佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003)

黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死實驗研究①

孫 慶，季慶輝，劉智勇，呂思銳，李 煜，高博一

(佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死療效及促進成骨作用。方法：分成①對照組6只；②模型組6只；③髓芯減壓組6只；④髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC組6只。兔股骨頭壞死模型制備采用液氮冷凍法誘導。結(jié)果：在8周時，髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC組骨細胞形成致密飽滿、量大清晰、増生活躍，造血細胞豐富，有較密骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，骨密度出現(xiàn)最高現(xiàn)象。結(jié)論：黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死，黃芪甲苷誘導MSC轉(zhuǎn)化為成骨細胞, 髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死8周時有較密骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，骨密度最高。

黃芪甲苷；誘導；MSC；治療；兔股骨頭壞死

股骨頭壞死(股骨頭壞死癥狀、股骨頭無菌性壞死、股骨頭缺血性壞死)常發(fā)生部位股骨頭。病因主要有：①股骨頸骨折復位不良的愈合；②骨組織自身病變兩種。常見癥狀：①持續(xù)痛；②靜息痛；③關(guān)節(jié)活動與負重行走功能障礙[1]。股骨頭壞死(股骨頭壞死癥狀、股骨頭無菌性壞死、股骨頭缺血性壞死)是一個病理演變過程。初始發(fā)生于股骨頭負重區(qū)，然后在應力作用下壞死骨骨小梁結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷(顯微骨折及針對損傷骨組織修復)[2～4]。本實驗通過研究探索黃芪甲苷(黃芪皂苷Ⅳ)(AstragalosideIVbeta-D-Glucopyranoside)體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSC)移植修復股骨頭壞死實驗硏究。

1 材料和方法

1．1 實驗動物

新西蘭大白兔24只,體重(2200±200)g, 6月齡，雌雄各半，由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1．2 試劑與實驗儀器

①主要試劑。黃芪甲苷(CAS號：84687-43-4，成都瑞芬思生物科技有限公司)；75%醫(yī)用酒精(衡陽原野實業(yè)有限公司)；甲醇溶液(麗英化工公司)；愛特福84碘伏(江蘇愛特福84股份有限公司)；鹽酸標準溶液(實驗室標準溶液 0.01mol，天津市致遠化學試劑有限公司)；多聚甲酸(臨沂瑞銀化工有限公司)；二甲苯(上海昊化化工有限公司)；無水乙醇(山東光訊化工有限公司)；丙二醇(河南明利化工產(chǎn)品有限公司)；戊巴比妥(北京普博斯生物科技有限公司)；青霉素(合肥博美生物科技有限責任公司)；速眠新Ⅱ注射液合劑(吉林省敦化市圣達藥品有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(浙江揚帆新材料股份有限公司)。

②實驗儀器。常規(guī)手術(shù)器械(佳木斯大學臨床醫(yī)學院實驗室)；一次性無菌手術(shù)包(揭陽市善笙醫(yī)療器械有限公司)；一次性無菌注射器(南京童文醫(yī)療器械有限公司)；一次性無菌備皮刀(衡水濱湖新區(qū)永剛醫(yī)療器械廠)；動物備皮用電推剪(衡水濱湖新區(qū)永剛醫(yī)療器械廠)；飛利浦PHILIPS電推剪(飛利浦(中國)投資有限公司)；12號骨髓穿刺針(溫州市龍灣永興凱恩特金屬制品廠)；200W微量加樣器(長沙科怡儀器設(shè)備有限公司)；液氮(海南佳騰化工氣體有限公司)；8CA-V圖像生物顯微鏡(上海光學儀器五廠有限公司)；ZeissLSM800激光共聚焦顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)。

1．3 兔股骨頭壞死模型制備及診斷

①兔股骨頭壞死模型制備。液氮冷凍法[5]誘導兔股骨頭壞死：30mg/g戊巴比妥或50mg/kg腹腔麻醉→髖關(guān)節(jié)前位置4cm左右→生理鹽水濕潤→貼皮膚剪除毛發(fā)→愛特福84碘伏皮膚消毒→無菌備皮刀備皮→愛特福84碘伏消毒→切外斜形口→切開皮膚→皮下組織→深筋膜→暴露髖關(guān)節(jié)囊→T形切開髖關(guān)節(jié)囊→股骨頭暴露→紗布團浸透液氮→冷凍股骨頭上端→持續(xù)10min→濕鹽水紗布股骨頭上端復溫→復位→縫合切口各層。新西蘭大白兔股骨頭壞死模型制備術(shù)后2次/d肌肉注射青霉素20萬單位，連續(xù)3d預防傷口感染。

②兔股骨頭壞死模型診斷。造模是否成功觀察術(shù)后兔股骨頭壞死模型如下方面：a一般狀態(tài)；b術(shù)口；c稱重；dCT檢測。造模是否成功觀察術(shù)后兔股骨頭壞死模型具體情況,見表1。

表1 觀察術(shù)后兔股骨頭壞死造模情況

1．4 兔骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)

pittenger方法[6]骨髓間充質(zhì)干細胞取自新西蘭大白兔自體，肌肉注射速眠新Ⅱ注射液合劑麻醉新西蘭大白兔，無水乙醇消毒髂骨12號骨髓穿刺針穿刺抽取骨髓5mL，收集細胞用巴氏吸管吸入15mLBD管中，收集細胞加入PBS稀釋2倍混合均勻，采用密度梯度離心percoll(密度1.073g/mL)液面上，2000r/min離心20min取中層云霧狀細胞層， 10cm細胞培養(yǎng)皿加入100mL/L胎牛血清培養(yǎng)液2×105云霧狀細胞接種，37℃50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后第1次沖去紅細胞換液，纖維細胞克隆貼壁生長0.25%胰蛋白酶消化，1/2培養(yǎng)孔長滿細胞, 1×106/cm2密度移入細胞培養(yǎng)瓶。細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)第3代細胞長滿消化細胞，配置成2×106/cm2懸液細胞，每個股骨頭準備含細胞懸液50μL，共10萬個細胞, 孵育4h細胞培養(yǎng)箱中備用[7]。

1．5 黃芪甲苷母液制備。

黃芪甲苷7.84mg溶于10mLPBS液充分溶解,制成1×10-3mol/L母液,微孔過濾器(0.22μm)過濾除菌4℃保存。二甲基亞砜(DMSO)10～20μL加入過濾除菌母液充分溶解，再加入PBS液定容至l0mL。

1．6 兔股骨頭壞死模型注射成骨細胞

30mg/g戊巴比妥或50mg/kg腹腔麻醉→髖關(guān)節(jié)前位置4cm左右→生理鹽水濕潤→貼皮膚剪除毛發(fā)→愛特福84碘伏皮膚消毒→無菌備皮刀備皮→愛特福84碘伏消毒→大轉(zhuǎn)子下緣1cm處縱向切口→電轉(zhuǎn)安裝直徑1mm定位針→直徑1cm空心鉆擴髓→拔出定位針→插入5mL—次性無菌注射器針頭→注入黃芪甲苷體外誘導骨髓干細胞和基質(zhì)膠混合物(成骨細胞約200萬個)→拔除導管針→骨蠟諸塞骨髓道→骨蠟封口→股骨頭頸倒置l0min→基質(zhì)膠凝固定位→縫合術(shù)口。

1．7X線和螺旋CT檢測兔股骨頭壞死修復情況

選取24只健康新西蘭大白兔，①對照組6只；②模型組6只；③髓芯減壓組6只；④髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC組6只。

1．8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0分析處理,計算平均數(shù)和標準差，采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷體外誘導MSC生長觀察

黃芪甲苷體外誘導MSC培養(yǎng)生長第5d纖維細胞克隆貼培養(yǎng)瓶壁生長。0.25%胰蛋白酶消化傳代2～4h纖維細胞貼壁生長，傳代2～3d長滿細胞培養(yǎng)瓶底。傳代2～7d纖維細胞指數(shù)生長倍增時間48h。黃芪甲苷體外誘導原代MSC見圖1。

圖1 黃芪甲苷體外誘導原代MSC(20×40)

2.2 肉眼結(jié)合病理組織學觀察

通過肉眼觀察新西蘭大白兔股骨頭壞死結(jié)合病理組織學了解四組股骨頭壞死發(fā)展及修復過程，見表2。

表2 觀察術(shù)后兔股骨頭壞死造模情況

2.3Micro-CT檢測兔股骨頭壞死骨密度修復情況

通過檢測X線和螺旋CT檢測①對照組；②模型組；③髓芯減壓組；④髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC組兔股骨頭壞死檢測兔股骨頭壞死所得骨結(jié)構(gòu)參數(shù)指標BMD，見表3。BMD骨密度或骨礦物質(zhì)密度(BoneMineralDensity,BMD),3DBMD單位是mg/cc。治療組(髓芯減壓組和髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC組)與模型組比較，說明統(tǒng)計學上顯著性差異(P<0.05)。

表3 檢測兔股骨頭壞死指標±s，8周)

注：aP<0.01

2.4X線檢測兔股骨頭壞死情況

新西蘭大白兔手術(shù)后4、8周X線檢測股骨頭壞死情況，麻醉兔后采用仰臥X線檢測股骨頭壞死情況，見表4。

表4 X線檢測各處理兔股骨頭壞死情況(8周)

3 討論

股骨頭壞死(俗稱骨蝕、股骨頭無菌性壞死、股骨頭缺血性壞死)主要病理是股骨頭血運受阻，遭受破壞引起股骨頭骨質(zhì)缺血，故稱為股骨頭缺血性壞死或股骨頭無菌性壞死。常見類型：①激素性股骨頭壞死；②酒精性股骨頭壞死；③外傷性股骨頭壞死；④老年股骨頭壞死；⑤兒童股骨頭壞死。股骨頭壞死癥狀：①早期癥狀： 疼痛行走活動后加重，有時為休息痛。多為針刺樣疼痛、鈍痛或酸痛不適等，常向腹股溝區(qū)，大腿內(nèi)側(cè)，臀后側(cè)和膝內(nèi)側(cè)放射，并有麻木感。出現(xiàn)間歇性跛行，兒童患者更為明顯。②晚期癥狀：髖關(guān)節(jié)各方向活動受限，肢體短縮，屈曲內(nèi)收攣縮畸形，肌肉萎縮。易患股骨頭壞死5類人群：①長期酗酒人群；②患有某些基礎(chǔ)疾病人群；③某些特殊職業(yè)人群；④長期服用激素人群；⑤有過髖部外傷患者人群[8]。

股骨頭壞死發(fā)病機制目前尚不清楚，是由復雜多因素導致股骨頭壞死病理過程。國內(nèi)一般采取保守治療股骨頭壞死方式，口服中藥、外敷膏藥、配合功能鍛煉。晚期患者根據(jù)自己病情與經(jīng)濟條件來選擇治療方式，如手術(shù)。孫強[9]等激素性股骨頭壞死的發(fā)病主要與脂肪代謝紊亂有關(guān)。劉忠堂[10]等激素所致的股骨頭缺血壞死是多種因素引起股骨頭血液循環(huán)障礙, 導致骨壞死；而酗酒使血中游離脂肪酸升高, 前列腺素增多, 易發(fā)生血管炎而栓塞, 以致骨缺血壞死。黃可[11]等使用普伐他汀干預能有效降低乙醇引起的高脂血癥、血小板黏附及紅細胞聚集，防止骨細胞的損傷，從而預防AOFH的發(fā)生。劉沛霖[12]等葛根素能夠抑制酒精性股骨頭壞死的發(fā)生, 并能夠預防骨壞死。張文進[13]活骨注射液能夠増強兔壞死股骨頭局部VEGF、bFGF和IGF-1的表達使血管再生増強,有利于缺血性股骨頭壞死的修復。李磊[14]髓芯減壓過程中注入經(jīng)淫羊藿體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞明顯促進股骨頭壞死修復。

骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSC)是未分化細胞或原始祖細胞，具有慢周期性和自我更新能力。MSC來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，具有較強分化潛能和可自體移植等優(yōu)點，不久即將被引入臨床治療最優(yōu)干細胞。

實驗研究黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死發(fā)現(xiàn)髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC組骨細胞形成致密飽滿、量大清晰、増生活躍，造血細胞豐富，有較密骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，骨密度出現(xiàn)最高現(xiàn)象。

實驗結(jié)果證實黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死，黃芪甲苷誘導MSC轉(zhuǎn)化為成骨細胞, 髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死8周時有較密骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，骨密度最高。髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死實驗組與兔股骨頭壞死模型組相比表現(xiàn)顯著差異性，說明黃芪甲苷體外誘導MSC治療兔股骨頭壞死有效，髓芯減壓聯(lián)合黃芪甲苷體外誘導MSC治療效果更佳。

[1]張富運，楊建華，王蕾，等. 骨髓單個核細胞對大鼠脊髓損傷后行為功能影響的研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2013，36(6):44-46

[2]趙中男，楊建華，王瑩，等. 骨髓單個核細胞移植對脊髓半橫斷大鼠損傷組織中髓鞘堿性蛋白表達的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(1):43-45

[3]張立超，賀濤，帥逸，等. 正常大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞對去勢大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨成脂分化的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2016，39(2):93-95

[4]徐志剛，呂淑慧，劉遠光，等. 骨髓間充質(zhì)干細胞向光感受器樣細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞的分化及移植后的分布情況[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2013，36(1):58-60

[5]沈霖，林燕萍，王擁軍.骨傷科實驗研究[M].北京：科學技術(shù)出版社，2005

[6]PittengerMF,MackayAE,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadualthumanmesenchymalstem[J].CellsScience，1999，28(4):143-147

[7]季慶輝，申福國，孔維麗，等. 骨髓單個核細胞移植對大鼠脊髓全橫斷損傷后髓鞘堿性蛋白表達影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2015，38(1):66-68

[8]武廣海，田黎明，于廣晴，等.RT-PCR檢測SALL4基因骨髓增生異常綜合征的表達[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2016，39(2):96-98

[9]孫強，施裕新，張其恭，等.激素性股骨頭壞死發(fā)病機制的實驗研究[J].中國臨床醫(yī)學,2003,10(4):465

[10]劉忠堂，王坤正，池永龍. 酒精和激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機制的實驗研究[J]. 溫州醫(yī)學院學報，1999,29(3):184-187

[11]黃可，唐毓金.普伐他汀對酒精性股骨頭壞死干預作用的實驗研究[J] .重慶醫(yī)學，2013,42(9):974-976，979

[12]劉沛霖，李月白，王義生.葛根素預防酒精性股骨頭壞死的初步實驗研究[J] . 中原醫(yī)刊，2006，33(7):17-19

[13]張文進. 中藥活骨注射液對兔股骨頭缺血性壞死修復過程中的VEGF、bFGF、IGF-1、bcl-2、bax和caspase-3表法情況實驗研究[D]. 黑龍江中醫(yī)藥大學，2016

[14]李磊. 淫羊霍昔誘導骨髓間充質(zhì)干細胞修復股骨頭壞死的實驗硏究[D]. 廣州中醫(yī)藥大學,2016

1.佳木斯大學大學生科技創(chuàng)新項目，編號：xsym2016-01；2.黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃重點項目，編號：201510222013；3.佳木斯大學科學技術(shù)重點項目，編號：12Z1201508；4.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院院級培育課題，編號：2014年。

孫慶(1994～)男，黑龍江佳木斯人，在讀本科學生。

季慶輝(1983～)男，黑龍江黑河人，碩士，主治醫(yī)師，講師。E-mail:jqinghui1983@163.com。

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1008-0104(2017)02-0042-03

2017-01-05)