阿那曲唑與格列本脲對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞凋亡的影響①

孟慶哲，薛 宇，韓靜嬡，張芮瑞，薛 琳，姜婷婷，趙雨晴

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

阿那曲唑與格列本脲對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞凋亡的影響①

孟慶哲1，薛 宇1，韓靜嬡1，張芮瑞2，薛 琳2，姜婷婷1，趙雨晴1

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：阿那曲唑與格列本脲對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠細(xì)胞凋亡的影響和作用。方法：采用人工誘導(dǎo)建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿那曲唑與格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠前后病灶部位體積變化及雌性激素合成相關(guān)蛋白表達(dá)，子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠隨機(jī)分為阿那曲唑組與格列本脲組，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞提取體外培養(yǎng)，阿那曲唑與格列本脲不同濃度處理體外培養(yǎng)細(xì)胞觀察對(duì)增殖能力和細(xì)胞凋亡影響。運(yùn)用ONN法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況。結(jié)果：阿那曲唑與格列本脲處理子宮內(nèi)膜異位癥大鼠后，病灶部位減小明顯，抑制雌激素相關(guān)蛋白表達(dá)，影響體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力與周期及凋亡。結(jié)論：阿那曲唑比格列本脲對(duì)雌激素相關(guān)蛋白表達(dá)影響大；格列本脲比阿那曲唑?qū)?xì)胞周期影響大。

阿那曲唑;格列本脲;子宮內(nèi)膜異位癥;細(xì)胞凋亡; 影響

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是有活性內(nèi)膜細(xì)胞種植在子宮內(nèi)膜以外位置形成常見(jiàn)婦科疾病。子宮內(nèi)膜異位癥治療因病情輕重，患者年齡和生育情況有所不同[1]。常用治療方法有：1.藥物治療：①假孕療法。②假絕經(jīng)療法。2. 手術(shù)療法：①半保守手術(shù)。②根治性手術(shù)。③腹腔鏡手術(shù)和GnRHa藥物結(jié)合。子宮內(nèi)膜異位癥是一種依賴雌性激素疾病，由于子宮內(nèi)膜異位癥患者需要長(zhǎng)期服用激素，對(duì)患者心理與生理造成較大影響，子宮內(nèi)膜異位癥近年來(lái)患病率呈上升趨勢(shì)[2]。子宮內(nèi)膜異位癥主要采用保守藥物治療，激素藥物降低患者雌性激素水平來(lái)進(jìn)行治療。以往臨床傳統(tǒng)治療具有顯著療效是降低雌性激素水平，臨床上有出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)病例，所以長(zhǎng)期控制和治療建議不采用激素藥物方法[3]。子宮內(nèi)膜異位癥手術(shù)療法臨床觀察術(shù)后復(fù)發(fā)率有 47.65%。子宮內(nèi)膜異位癥臨床治療中迫切尋找不良反應(yīng)少與復(fù)發(fā)率低且療效滿意治療手段。

阿那曲唑(AnastrozoleTablets)(瑞婷、瑞寧得)是非甾體類芳香化酶抑制劑。阿那曲唑主要是降低血漿雌激素水平，具有抑制乳腺腫瘤生長(zhǎng)作用。臨床主要應(yīng)用在絕經(jīng)后婦女輔助乳腺癌晚期治療[4]。

格列本脲主要應(yīng)用非胰島素依賴型糖尿病針對(duì)飲食控制療效不滿意患者，患者β胰島細(xì)胞能分泌一定胰島素沒(méi)有嚴(yán)重并發(fā)癥，患者應(yīng)用格列本脲可以降低空腹和餐后血糖。為了探索阿那曲唑和格列本脲對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥藥理學(xué)作用機(jī)理，本研究應(yīng)用EMS大鼠進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探索研究阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥理學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：阿那曲唑片(瑞婷)(規(guī)格：1mg，重慶華邦制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020194)；格列本脲片(規(guī)格：2.5mg，山西云鵬制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14020780)。主要儀器：LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀 ( 美國(guó)BDBiosciences)；PWT型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (合肥華德利科學(xué)器材有限公司)；CTK120自動(dòng)脫帽離心機(jī) (湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；RT-6000自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)雷杜Rayto)[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備及診斷 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)性成熟雌性未受孕大鼠 40 只，體質(zhì)量(200±20)g，佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。22～24℃、相對(duì)濕度50%～60%，飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物飼養(yǎng)室。

1.2.2 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠動(dòng)物模型制備與診斷

①子宮內(nèi)膜異位癥大鼠動(dòng)物模型制備:SPF級(jí)性成熟雌性未受孕大鼠40只，每日陰道涂片定時(shí)檢查，進(jìn)行大鼠動(dòng)情期規(guī)律統(tǒng)計(jì)，選擇有規(guī)則動(dòng)情周期，且連續(xù)正常兩個(gè)動(dòng)情周期大鼠，在第3個(gè)動(dòng)情期參照文獻(xiàn)[6]方法人工誘導(dǎo)EMS大鼠模型，建模過(guò)程進(jìn)行剖腹與移植及縫合。

②子宮內(nèi)膜異位癥大鼠動(dòng)物模型診斷標(biāo)準(zhǔn):人工建立大鼠模型后第4周在動(dòng)情期第2次剖腹。EMS診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)：人工建模子宮內(nèi)膜移植部分明顯增大體積，呈結(jié)節(jié)狀或囊狀透明或半透明其內(nèi)部有液體，表面有增生結(jié)締組織并且有血管分布。

1.3 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠分組及給藥

子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型大鼠40只，隨機(jī)分為格列本脲(1mg·kg-1) 組和阿那曲唑(1mg·kg-1)組，每組20只，均灌服阿那曲唑、格列本脲藥物，灌服3 周后頸動(dòng)脈穿刺大鼠全部處死。阿那曲唑、格列本脲藥物治療前后，檢測(cè)阿那曲唑組和格列本脲組病灶體積、體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡等情況。

1.4 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織細(xì)胞分離及藥物處理

①子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織細(xì)胞分離體外培養(yǎng):子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織位置選取，病灶組織提取細(xì)胞體外培養(yǎng)分離。選取子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織剪成若干小塊，應(yīng)用胰蛋白酶溶液消化30min然后加入胎牛血清終止。采用離心機(jī)離心細(xì)胞沉淀收集，細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基放在細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過(guò)夜，24h后換新培養(yǎng)基。

②子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織體外培養(yǎng)細(xì)胞藥物處理:阿那曲唑組和格列本脲組兩組藥物處理分離體外培養(yǎng)細(xì)胞，阿那曲唑組和格列本脲組細(xì)胞分別用0、10、100、1000μmol·L-1阿那曲唑或格列本脲處理72h。MTT法在處理過(guò)程中檢測(cè)細(xì)胞活力。其中48h后細(xì)胞周期分布、凋亡、Bax(促凋亡蛋白)和Bcl-2(抑凋亡蛋白)表達(dá)用LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.5 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織體外培養(yǎng)細(xì)胞周期檢測(cè)

阿那曲唑組和格列本脲組藥物處理72h后，收集阿那曲唑組和格列本脲組細(xì)胞。經(jīng)過(guò)PBS洗滌用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色，然后用LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞周期分布分析。

1.6 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織體外培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

阿那曲唑組和格列本脲組藥物處理72h后，收集兩處理組細(xì)胞。細(xì)胞染色應(yīng)用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，細(xì)胞凋亡分析用LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)量資料計(jì)算，采用t檢驗(yàn)，P<0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠前后病灶體積比較

子宮內(nèi)膜異位癥大鼠癥狀主要表現(xiàn)為異位病灶病理性增殖，病灶體積改變表現(xiàn)在治療效果。經(jīng)過(guò)阿那曲唑(1mg·kg-1)、格列本脲(1mg·kg-1)治療3周后，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶體積比治療前均有減小，治療3周后與比治療前對(duì)比差異顯著(P<0.05)。阿那曲唑組對(duì)比格列本脲組差異不顯著。見(jiàn)表1。

表1 阿那曲唑與格列本脲對(duì)EMS大鼠治療 前后病灶平均體積

注：與治療前比較，△P<0.05。

2.2 阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體外培養(yǎng)細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分布運(yùn)用LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀分析，DNA合成前期細(xì)胞比例隨格列本脲濃度升高而上升，DNA合成期細(xì)胞比例隨格列本脲濃度升高而下降(P<0.05)。阿那曲唑?qū)NA合成前期細(xì)胞和DNA合成期細(xì)胞影響差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 阿那曲唑與格列本脲對(duì)EMS大鼠體外 培養(yǎng)細(xì)胞周期影響

注：與DNA合成前期比較△P<0.05;同濃度組間比較☆P<0.05。2.3 阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體外培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡應(yīng)用LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀分析，體外培養(yǎng)細(xì)胞運(yùn)用阿那曲唑和格列本脲處理，細(xì)胞凋亡比例呈現(xiàn)增加顯著，隨阿那曲唑和格列本脲處理濃度增加呈上升趨勢(shì)(P<0.05)。Bax和Bcl-2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示：阿那曲唑和格列本脲處理體外培養(yǎng)細(xì)胞后，Bax表達(dá)水平升高、Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.05) 。說(shuō)明阿那曲唑和格列本脲促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體外培養(yǎng)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)表3。

表3 阿那曲唑與格列本脲對(duì)EMS大鼠體外 培養(yǎng)細(xì)胞凋亡影響

注：蛋白表達(dá)免疫印跡法測(cè)定。與 0μmol·L-1比較△P<0.05。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是婦產(chǎn)科臨床上常見(jiàn)病和多發(fā)病，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率近年來(lái)有逐漸升高趨勢(shì)。目前尚未完全明確子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制。世界衛(wèi)生組織目前普遍認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病可能與多種因素有關(guān)：①種植學(xué)說(shuō)：月經(jīng)血或脫落子宮內(nèi)膜碎片經(jīng)過(guò)輸卵管流入腹腔，種植盆腔臟器表層產(chǎn)生EMs病灶；②化生內(nèi)膜：人體漿膜上皮在性腺激素、炎癥、機(jī)械因素刺激下轉(zhuǎn)化形成EMs病灶；③良性轉(zhuǎn)移：罕見(jiàn)的發(fā)病原因，主要通過(guò)血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)把子宮內(nèi)膜碎屑轉(zhuǎn)移停留在肺部、腦膜、心包、四肢及其他遠(yuǎn)端的EMs病灶。④醫(yī)源性的內(nèi)膜移植：剖宮產(chǎn)、刮宮、會(huì)陰側(cè)切和人工流產(chǎn)術(shù)等人為造成使子宮內(nèi)膜移植到某些部位形成EMs病灶；⑤免疫防御功能缺陷：隨月經(jīng)血逆流至腹腔子宮內(nèi)膜激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，大量免疫細(xì)胞及體液圍殲進(jìn)行消除，如果此時(shí)體內(nèi)免疫功能缺陷會(huì)產(chǎn)生EMs病灶；⑥體質(zhì)及遺傳因素：肥胖、超重等體質(zhì)因素及家族遺傳等與EMs發(fā)生有密切關(guān)系[8]。

目前，對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)發(fā)病原因不明確，研究探討宮內(nèi)膜異位癥病因和機(jī)制成為婦科熱點(diǎn)。對(duì)于治療子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)過(guò)程減少不良反應(yīng)降低治療后復(fù)發(fā)率，也是子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)治療研究中重要內(nèi)容[9]。

本研究以人工誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?jīng)過(guò)阿那曲唑和格列本脲治療，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶體積變小。阿那曲唑和格列本脲對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥有療效，阿那曲唑和格列本脲藥物濃度對(duì)EMS大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力抑制及凋亡作用呈正比。阿那曲唑有效抑制雌性激素合成雌性激素含量減少。格列本脲對(duì)雌性激素合成無(wú)影響，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細(xì)胞DNA合成期細(xì)胞比例和周期格列本脲可抑制。子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細(xì)胞中凋亡促進(jìn)蛋白格列本脲可使其增加，導(dǎo)致抑制凋亡蛋白減少。子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細(xì)胞兩方面(增殖能力、凋亡作用)及抑制雌性激素合成阿那曲唑和格列本脲均有效。阿那曲唑可有效抑制雌性激素合成，格列本脲對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細(xì)胞周期DNA合成期有效[10]。

本研究表明格列本脲和阿那曲唑?qū)τ谥委煷笫笞訉m內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 有良好治療效果，大鼠子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程抑制作用均有效。阿那曲唑和格列本脲有望解決治療子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 過(guò)程中易發(fā)不良反應(yīng)，并為長(zhǎng)期預(yù)防子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 復(fù)發(fā)提供更多臨床解決方案。阿那曲唑和格列本脲在治療 子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 臨床應(yīng)用尚需進(jìn)一步探討。

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1.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃，編號(hào)：201610222084；2.佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：xsyd2016-12；3.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：12Z1201508；4.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院院級(jí)培育課題，編號(hào)：2014；5.黑龍江省教育廳項(xiàng)目，編號(hào)：12511570。

孟慶哲(1996～)男，黑龍江佳木斯人，在讀本科生。

薛宇(1988～)女，黑龍江佳木斯人，醫(yī)師。E-mail:xueyu@163.com。

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1008-0104(2017)02-0022-02

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