中華鱉tyrp-1基因的生物信息學(xué)分析

王亞光，邵巧巧，孫冰冰，張耀紅，管越強

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.保定水產(chǎn)技術(shù)推廣站,河北 保定 071051)

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中華鱉tyrp-1基因的生物信息學(xué)分析

王亞光1，邵巧巧1，孫冰冰1，張耀紅2，管越強1

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.保定水產(chǎn)技術(shù)推廣站,河北 保定 071051)

為闡明中華鱉酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP-1)基因tyrp-1 及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，利用相關(guān)軟件、數(shù)據(jù)庫和方法對其進行了生物信息學(xué)分析.結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)錄本全長為2 829 bp，編碼535個aa. 預(yù)測TYRP-1蛋白分子質(zhì)量為60.16 ku，理論等電點為5.35，為不穩(wěn)定蛋白；N端含有信號肽，與信號識別蛋白結(jié)合后，促進其穿越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔；C端含有跨膜結(jié)構(gòu)域，錨定于細胞膜上，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能；TYRP-1蛋白含有2個銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與DCT蛋白有明顯的相互作用.

中華鱉；tyrp-1基因；生物信息學(xué)

酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP-1)基因tyrp-1是第1個被成功克隆的色素基因，是酪氨酸酶基因家族中的重要組成部分.酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(EC:1.14.18.-)是黑色素合成途徑中重要的酶，具有二羥基吲哚酸氧化酶的活性，可以催化5,6-二羥基吲哚羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)氧化生成5,6-吲哚醌羧酸(indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid)[1]. Zhao等[2]利用含有tyrp-1基因的逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)染人體TYRP-1蛋白缺陷的黑色素細胞，證明了外源的tyrp-1基因可以提高酪氨酸酶的活性. 因此，在維持酪氨酸酶的穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)催化活性中發(fā)揮了重要作用[3]. TYRP-1還在黑色素合成的下游途徑中影響黑色素小體的成熟、黑色素瘤細胞的增殖和凋亡[4]. TYRP-1蛋白活性高低可影響真黑色素與偽黑色素合成轉(zhuǎn)換，活性高時將生成真黑色素，活性降低時則生成偽黑色素[5].

中華鱉(Pelodiscussinensis)，隸屬于爬行綱(Reptilia)龜鱉目(Testudoformes)鱉科(Trionychidae)鱉屬(Pelodiscus)[6]，是中國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在南北方均有分布. 中華鱉體型橢圓，背部灰黑色帶有花紋，腹部為白玉色. 近年來河北省保定市水產(chǎn)技術(shù)推廣站、河北大學(xué)和保定市阜平縣中華鱉養(yǎng)殖場等多家單位合作，通過人工選擇育種技術(shù)繁育出體色金黃色的中華鱉，俗稱“黃金鱉”. 通過對其裙邊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)黃金鱉tyrp-1基因出現(xiàn)顯著下調(diào)現(xiàn)象，該基因含有8個SNP位點，其中2個SNP位點分別位于第6和第8外顯子上(數(shù)據(jù)未發(fā)表).

生物信息學(xué)是一門涵蓋了計算機、數(shù)學(xué)、信息科學(xué)、生物學(xué)及統(tǒng)計學(xué)等多門學(xué)科的新型交叉學(xué)科[7]，通過對基因水平和蛋白水平的研究，來揭示基因、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、發(fā)育與疾病的關(guān)系[8]. 本文通過對中華鱉tyrp-1基因和TYRP-1蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析，探索黃金鱉體色的成因，為今后開展tyrp-1基因研究提供理論依據(jù)，同時也為中華鱉的遺傳育種提供參考.

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

中華鱉基因組序列來源于Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫，不同物種蛋白氨基酸序列來源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫.

1.2 方法

中華鱉tyrp-1基因的生物信息學(xué)分析包括基因序列分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析、親/疏水性質(zhì)分析、信號肽分析、跨膜結(jié)構(gòu)域分析、銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)測、相互作用蛋白分析等，所用數(shù)據(jù)庫及軟件見表1.

利用DNAMAN軟件將中華鱉TYRP-1氨基酸序列與爬行綱(Reptilia)以及兩棲綱(Amphibian)的其他物種進行比對，再利用Mega軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，通過重抽樣檢驗拓撲樹的各分節(jié)點，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000，并用bootstrap值估計各節(jié)點的支持率[9-10].

2 結(jié)果

2.1 中華鱉tyrp-1基因的特征分析

中華鱉tyrp-1基因(轉(zhuǎn)錄本ID為ENSPSIG00000012375)，位于JH207295.1負鏈的2 690 705～2 707 180 bp，基因組全長為16.5 kb，含有8個外顯子，轉(zhuǎn)錄本全長為2 829 bp，編碼535個aa(來源于Ensembl數(shù)據(jù)庫).

2.2 中華鱉TYRP-1蛋白二級結(jié)構(gòu)與銅離子結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得了中華鱉TYRP-1的氨基酸序列，利用Scratch protein predictor軟件進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果顯示，中華鱉tyrp-1基因共編碼了535個aa，其中α-螺旋構(gòu)象占29.1%，無規(guī)卷曲構(gòu)象占64.9%，β-折疊構(gòu)象占6.0%，無規(guī)卷曲構(gòu)象所占比重較大，β-折疊構(gòu)象所占比重最小. 利用Prosite軟件對中華鱉TYRP-1蛋白進行銅離子結(jié)構(gòu)域的預(yù)測. 可以看出：TYRP-1結(jié)構(gòu)域與酪氨酸家族蛋白相似，包含有2個銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別位于213～230位(氨基酸序列為HEGPAFLTWHRYHLLQLE)、395～406位(氨基酸序列為DPIFVFLHTFTD).

2.3 中華鱉TYRP-1蛋白三級結(jié)構(gòu)和磷酸位點預(yù)測

Phyre2軟件是通過折疊識別建模的方式進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，為此本文利用該軟件對中華鱉TYRP-1的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測(圖1). 依據(jù)NetPhos 3.1軟件分析可以得出：TYRP-1蛋白可能包含有49個磷酸化位點，位于絲氨酸殘基上的有22個，位于蘇氨酸殘基上的有19個，位于酪氨酸殘基上的有8個.

圖1 中華鱉TYRP-1三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Tertiary structure prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.4 中華鱉TYRP-1蛋白的基本性質(zhì)分析

對中華鱉TYRP-1蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)等基本特征進行預(yù)測，該分子質(zhì)量約為60.16 ku，理論等電點為5.35，正電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為58，負電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為39，共含有8 280個原子，分子式為 C2668H4042N744O801S25.不穩(wěn)定指數(shù)為49.75(>40表示該蛋白為不穩(wěn)定蛋白)，說明該蛋白是不穩(wěn)定蛋白.

根據(jù)Protscale軟件預(yù)測中華鱉TYRP-1蛋白疏水性：位于第485位親/疏水性分值最高，表明C端含有1個強的疏水區(qū)域；位于第81位的分值最低，表明N端含有1個強的親水區(qū)域(圖2). 結(jié)合ProtParam軟件預(yù)測可知：中華鱉TYRP-1蛋白總平均親水性為 -0.331，為疏水性蛋白.

圖2 中華鱉TYRP-1蛋白親水性預(yù)測Fig.2 Hydrophobicity profile prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.5 中華鱉TYRP-1蛋白信號肽、亞細胞定位預(yù)測

利用SignalP-3.0軟件的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對中華鱉TYRP-1進行分析，第23位數(shù)值最大為0.911，該位點可能是信號肽的剪切位點，推測該蛋白存在信號肽，是分泌蛋白，信號肽剪切位點位于第22個和第23個aa位點之間. 利用隱馬爾可夫模型同樣預(yù)測出TYRP-1存在信號肽，預(yù)測的剪切位點位置與上述模型相同，存在可能性高達0.993，與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測結(jié)果相吻合. 上述2種信號肽預(yù)測模型結(jié)果相同，證實中華鱉TYRP-1存在信號肽，是一種分泌蛋白.

2.6 中華鱉TYRP-1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

中華鱉TYRP-1蛋白第1～476位氨基酸位于細胞膜外，第477～499位氨基酸為跨膜結(jié)構(gòu)域，第500～535位氨基酸位于細胞膜內(nèi)，表明該蛋白定位于細胞膜(圖3).

1.表示該段氨基酸序列位于細胞膜外；2.表示該段氨基酸序列為跨膜結(jié)構(gòu)；3.表示該段氨基酸序列位于細胞膜內(nèi).圖3 中華鱉TYRP-1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Transmembrane region prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.7 中華鱉TYRP-1蛋白相互作用

利用String軟件預(yù)測了與中華鱉TYRP-1相互作用的蛋白質(zhì)，搜索條件限制在10個蛋白質(zhì)，其中與酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(DCT)的關(guān)系最密切(圖4).

圖4 中華鱉TYRP-1蛋白相互作用預(yù)測Fig.4 Protein-protein interactions prediction of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

2.8 中華鱉TYRP-1蛋白系統(tǒng)進化樹分析

根據(jù)中華鱉及相關(guān)兩棲、爬行動物TYRP-1序列，利用Mega軟件的鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹. 結(jié)果顯示，兩棲綱(Amphibian)的物種聚為一大支，爬行綱(Reptilia)的物種聚為一大支. 具體而言，中華鱉(P.sinensis)、綠海龜(Cheloniamydas)與錦龜(Chrysemyspicta)親緣關(guān)系近，均為龜鱉目(Testudines)，在系統(tǒng)進化樹中聚為一支；美洲短吻鱷(Alligatormississippiensis)和揚子鱷(Alligatorsinensis)均屬于鱷形目(Crocodylia)鱷科(Crocodylidae)短吻鱷屬(Alligator)，在進化樹中聚為一支；北美綠蜥蜴(Anoliscarolinensis)和多疣壁虎(Gekkojaponicus)均屬于蜥蜴目(Lacertiformes)，在進化樹中聚為一支；普通束帶蛇(Thamnophissirtalis)、原矛頭蝮(Protobothropsmucrosquamatus)和緬甸蟒(Pythonbivittatus)均屬于有鱗目(Squamata)，在進化樹中聚為一支；大鈍口螈(Ambystomamexicanum)和熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)屬于兩棲綱(Amphibian)有尾目(Caudata)，在系統(tǒng)進化樹中聚為一支(圖5).

圖5 中華鱉TYRP-1蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of TYRP-1 of Pelodiscus sinensis

3 討論

中華鱉tyrp-1基因是酪氨酸酶基因家族中的重要組成部分.本文利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件，對中華鱉tyrp-1基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能進行預(yù)測：中華鱉tyrp-1基因含有8個外顯子，轉(zhuǎn)錄本全長為2 829 bp，編碼535個aa，該蛋白的分子質(zhì)量為60.16 ku，理論等電點為5.35，不穩(wěn)定指數(shù)為49.75，是不穩(wěn)定蛋白.

中華鱉TYRP-1蛋白是黑色素合成途徑中重要的酶. 在N端含有1個信號肽，剪切位點位于第22和第23個氨基酸之間；C端的第477～499位的氨基酸是跨膜結(jié)構(gòu)域. 這與張靜等[11]研究鵝TYRP-1蛋白含有1個信號肽序列和1個跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)果相似. TYRP-1是一種分泌蛋白和膜糖蛋白，首先在細胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成，經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的異位子改變其內(nèi)腔結(jié)構(gòu)，利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白以及相關(guān)酶進行折疊和裝配，而后到達高爾基體，經(jīng)過內(nèi)體，最后轉(zhuǎn)運到黑色素體膜上，并在黑色素體中發(fā)揮酶學(xué)催化作用[12-13].

中華鱉酪氨酸酶家族含有共同的結(jié)構(gòu)域——銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在TYRP-1蛋白中共有2段，銅離子A結(jié)合位點位于213～230位(氨基酸序列為HEGPAFLTWHRYHLLQLE)，符合H-x(4,5)-F-[LIVMFTP]-x-[FW]-H-R-x(2)-[LVMT]-x(3)-E銅離子A結(jié)合位點通用公式，銅離子B結(jié)合位點位于395～406位(氨基酸序列為DPIFVFLHTFTD)，符合銅離子B結(jié)合位點通用公式：D-P-x-F-[LIVMFYW]-x(2)-H-x(3)-D. 酪氨酸酶家族銅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，每一個銅離子都會受到3個保守的組氨酸殘基的調(diào)控[14]. 銅離子與組氨酸配基結(jié)合，氧分子以過氧化物的形式與銅離子結(jié)合，行使二羥基吲哚酸氧化酶的功能，完成催化氧化反應(yīng).

在黑色素合成過程中，一些蛋白質(zhì)與TYRP-1相互作用. String軟件預(yù)測出與中華鱉TYRP-1相互作用的10個蛋白.其中，最重要的蛋白是DCT，它與TYRP-1相互作用，共同參與了黑色素生成調(diào)控過程，調(diào)節(jié)黑色素細胞發(fā)育生長和功能[15-17]. 與TYRP-1蛋白相互作用的CANX(鈣連蛋白)是Ca2+連磷蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在特定條件下起到識別及與新蛋白特異性結(jié)合的作用[18]. CANX在TYRP-1蛋白折疊過程中可能起到分子伴侶作用[19].EDN3(內(nèi)皮素3)對于毛色的作用越來越受到大家的關(guān)注. 王海東等[20]檢測了不同體色的小鼠皮膚EDN3表達量，證明EDN3基因?qū)е聇yrp-1基因下調(diào). 因此，tyrp-1基因在黑色素合成的過程中，與DCT 等上述蛋白質(zhì)存在著相互作用.

通過對中華鱉TYRP-1蛋白的系統(tǒng)進化樹分析，中華鱉(Pelodiscussinensis)、綠海龜(Cheloniamydas)和錦龜(Chrysemyspicta)親緣關(guān)系近，均為龜鱉目(Testudines)，在系統(tǒng)進化樹中聚為一支.

本文采用生物信息學(xué)方法分析了中華鱉酪氨酸酶相關(guān)蛋白1基因及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，可為研究TYRP-1在中華鱉黑色素合成途徑中的重要作用提供重要的理論依據(jù)，有助于闡明黃金鱉體色發(fā)生機制，同時也可為中華鱉選擇育種提供參考.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Bioinformatics analysis oftyrp-1 gene inPelodiscussinensis

WANG Yaguang1,SHAO Qiaoqiao1,SUN Bingbing1,ZHANG Yaohong2,GUAN Yueqiang1
(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;2.Baoding Fishery Technology Extension Station,Baoding 071051,China)

In order to clarify the structure and characteristics of tyrosinase related protein 1(TYRP-1) in Chinese softshell turtlePelodiscussinensis, bioinformatics analysis was carried out using related softwares, databases and methods. The results showed that the transcript length oftyrp-1 gene was 2 829 bp, encoding a putative 535 aa. The deduced molecular weight of TYRP-1 protein was 60.16 ku and theoretical isoelectric point was 5.35, which indicated it was an unstable protein. A signal peptide domain was located in N-terminus, and it could bind to the signal recognition protein, leading the polypeptide chain through the endoplasmic reticulum membrane to the endoplasmic reticulum cavity. A transmembrane domain in the C-terminus, which anchored on the cell membrane, played an important biological function. The TYRP-1 protein contained two copper-binding domains, and interacted with DCT protein.

Pelodiscussinensis;tyrp-1 gene;bioinformatics

2016-06-15

河北省自然科學(xué)基金資助項目(C2016201207)；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系淡水養(yǎng)殖創(chuàng)新團隊項目

王亞光 (1990—)，男，山西平定人，河北大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail:1542120049@qq.com

管越強(1973—)，男，河北深澤人，河北大學(xué)教授，主要從事水生動物營養(yǎng)與免疫研究. E-mail：guanyueqiang@hbu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.03.009

S917.4

A

1000-1565(2017)03-0274-07