表面連接與核-殼型鍵合FITC熒光納米硅球的制備及性能比較

蔡少凡，金秋，魏海英，呂運(yùn)開

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

?

表面連接與核-殼型鍵合FITC熒光納米硅球的制備及性能比較

蔡少凡，金秋，魏海英，呂運(yùn)開

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

以異硫氰酸熒光素(FITC)為熒光分子，二氧化硅為生物相容性載體制備熒光納米硅球.為增強(qiáng)硅球的穩(wěn)定性，引入γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)做橋梁分子，由于FITC、SiO2與APTES連接順序的非單一性，分別制備了表面連接型和核-殼型鍵合FITC的熒光硅球，并對其形貌和光漂白性進(jìn)行了比較.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核-殼型和表面連接型熒光硅球形貌相似粒徑接近，但表面連接型光漂白性嚴(yán)重.進(jìn)而，對核-殼型中典型的包硅方法——St?ber法和反相微乳液法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，反相微乳液法制備的核-殼型鍵合FITC的熒光硅球熒光信號更強(qiáng)、粒徑更小且分散性良好，同時在7 h內(nèi)熒光染料泄漏程度小于8%，30 min內(nèi)熒光強(qiáng)度僅降低2.2%，具備低染料泄露、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn).

異硫氰酸熒光素(FITC)；熒光納米硅球；光漂白；染料泄漏；光穩(wěn)定

功能性微球通常是指具有一定功能的微納米球，具有獨(dú)特的比表面積大、擴(kuò)散性和運(yùn)動性好、凝集作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且便于根據(jù)不同的用途而賦予各種性狀，從而得到廣泛應(yīng)用[1].其中，熒光微球作為一種特殊的功能微球，因其穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定而高效的發(fā)光效率等特點(diǎn)，越來越受到廣大科研工作者的青睞[2-4].

異硫氰酸熒光素(FITC)是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素，主要用于熒光抗體技術(shù)中，能和各種抗體蛋白結(jié)合，且結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性[5]，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的綠色熒光，而人眼對黃綠色較為敏感，便于識別；在其表面包覆具有良好的生物相容性且表面羥基易修飾的硅膠載體，可大大增強(qiáng)其實(shí)用性[6-7].

倘若對FITC直接進(jìn)行硅膠包覆，結(jié)構(gòu)將不太穩(wěn)定，易造成染料泄漏進(jìn)而光漂白[8]，解決問題可以從合成方法入手.本文引入γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，利用其既含活性基團(tuán)-NH2，又含Si—O—Si的特點(diǎn)，可將FITC和硅膠牢牢固定.由于FITC、SiO2與APTES連接順序的非單一性，將會出現(xiàn)表面連接型(SiO2-APTES-FITC)和核-殼型(FITC-APTES-SiO2)2種結(jié)合可能，而這2種鍵合FITC的熒光硅球的性能如何尚不得而知；此外，制備核-殼型硅球時，經(jīng)典的包硅方法有St?ber法[9-11]和反相微乳液法[8,12]，然而目前尚未有對這2種包硅方法所合成的熒光硅球性能進(jìn)行詳細(xì)比較的報道.基于鍵合FITC的熒光硅球在生物成像和靶向載藥等方面的潛在應(yīng)用，本工作分別制備了表面連接型和核-殼型鍵合FITC的熒光硅球，并通過FT-IR、SEM、EDS、紫外、熒光光譜等手段對所合成的熒光硅球的性能進(jìn)行了較為詳細(xì)的表征和比較，旨在通過以上的研究為制備性能優(yōu)良的熒光納米硅球提供有價值的信息.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純：異硫氰酸熒光素(FITC)，γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，正硅酸乙酯(TEOS)，環(huán)己烷，正己醇，曲拉通114(Triton X-114)，無水乙醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%氨水，丙酮，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水.

TG328光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠)，KH-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，電熱真空干燥箱(湖北省黃岡市醫(yī)療器械廠)，F(xiàn)-380熒光分光光度計(jì)(天津港東科技發(fā)展有限公司)，傅里葉紅外光譜儀(德國Bruker)，ZF-20D暗箱式紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，PhenomTM臺式掃描電子顯微鏡(復(fù)納科學(xué)儀器有限公司).

1.2 表面連接型鍵合FITC熒光納米硅球的制備

1.2.1 氨基雜化硅球的制備

將無水乙醇、蒸餾水和氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)分別量取22.25，2.25和0.46 mL于100 mL圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，逐滴滴?.2 mL TEOS-APTES的混合溶液(體積比為5∶1)，磁力攪拌2.5 h.用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇超聲洗滌數(shù)次，40 ℃真空干燥備用.

1.2.2 雜化硅球表面連接FITC

稱取氨基雜化硅球0.15 g分散于500 μL的無水乙醇中，加入8 μL 40 mmol/L的FITC溶液，室溫避光磁力攪拌2 h，攪拌速度約為200 r/min.用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和蒸餾水交替洗滌數(shù)次，40 ℃真空干燥.

1.3 核-殼型鍵合FITC熒光納米硅球的制備

1.3.1 FITC-APTES前驅(qū)體的制備

稱取1 mg FITC，溶于1 mL 的無水乙醇，超聲分散.然后加入5 μL APTES.在干燥密閉的氮環(huán)境中避光攪拌反應(yīng)24 h，制得前驅(qū)體FITC-APTES.

1.3.2 FITC-APTES@SiO2核-殼納米硅球的制備

1.3.2.1 反相微乳液法包覆硅殼 將環(huán)己烷、X-114和正己醇分別取7.5，1.77和1.8 mL混和，磁力攪拌30 min，緩慢滴加250 μL水，攪拌30 min使之混勻，形成清澈透明的微乳液.將150 μL 1 g/L FITC-APTES加入上述微乳液，充分?jǐn)嚢杌靹?，依次加?00 μL的TEOS和60 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 25% 氨水，室溫避光磁力攪拌反應(yīng)36 h后，加入少量丙酮破乳.分別用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和蒸餾水洗滌，真空干燥，得到純的FITC-APTES@SiO2核-殼型熒光納米硅球.

1.3.2.2 St?ber法包覆硅殼 量取2.4 mL氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)和30 mL無水乙醇混合均勻后加入1.2 mL TEOS，攪拌5 min，然后加100 μL前驅(qū)體，室溫避光磁力攪拌24 h.用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和蒸餾水交替洗滌，真空干燥，制得純的FITC-APTES@SiO2核-殼型熒光納米硅球.

1.4 染料泄漏實(shí)驗(yàn)

將一定量熒光納米硅球溶于去離子水中，超聲，每隔1 h取出1 mL溶液，離心后棄去上清液，加入1 mL水；超聲分散后用熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度，共測試7 h.通過熒光強(qiáng)度的變化確定有機(jī)熒光染料泄露的程度.

1.5 光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將1 mg熒光納米硅球溶于2 mL乙醇溶液中，以150 W氙燈為激發(fā)光源，對溶液進(jìn)行照射.每隔5 min測量1次最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度，共測試30 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 傅里葉紅外光譜分析

對FITC、前驅(qū)體及3種不同方法制備的熒光硅球進(jìn)行傅里葉紅外光譜表征，結(jié)果如圖1所示.

圖1 (a) FITC、(b) FITC-APTES前驅(qū)體、(c)反相微乳液法、(e) St?ber法制備的核-殼型及(d)表面連接型熒光硅球FITC-APTES@SiO2的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of FITC (a), FITC-APTES Precursors (b) and FITC-APTES@SiO2of surface connection type (d) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (c) and St?ber(e)

3 423.78 cm-1處既有FITC表面R—COOH的—OH伸縮振動振動峰，又有樣品中殘余水分的變形振動，在圖1a-e中均出現(xiàn)，初步推測整個反應(yīng)未破壞R—COOH結(jié)構(gòu)，圖1e的該處峰與其他4種物質(zhì)相比明顯得多，由于硅羥基具有親水性，因此推測此現(xiàn)象可能由較厚硅層導(dǎo)致殘余水分較多引起.在圖1a中，2 031.72 cm-1為異硫氰根的C≡N伸縮振動峰，在圖1b-e中消失，可推測前驅(qū)體制備過程中加成反應(yīng)順利進(jìn)行，同時圖1b中，在2 975.88 cm-1處出現(xiàn)-CH2-的伸縮振動峰，說明FITC與APTES成功連接.同時，在1 630.40 cm-1處的芳環(huán)羧酸的羰基(C=O)峰自始至終都沒有消失，再次證明FITC和APTES是通過異硫氰鍵的加成共價結(jié)合在一起.在圖1d中，3 198.12 cm-1為苯環(huán)的-CH=伸縮振動峰，而在圖1c、e中均不明顯，推測此峰為氨基雜化硅球表面接枝的FITC引入，可初步證明表面接枝FITC成功.由圖1c-e可見，在1 092.72 cm-1和467.28 cm-1左右的強(qiáng)吸收峰是Si—O—Si特征峰，可證明反相微乳液法和St?ber法包硅成功，此外，圖1e處的1 092.72 cm-1和467.28 cm-1峰均比圖1c-d的明顯，可再次證明用St?ber法包硅，硅層較厚.

2.2 能譜分析

為了探究表面連接型熒光硅球的合成情況，對氨基雜化硅球和表面連接型熒光硅球進(jìn)行了能譜表征，如圖2所示.氨基雜化硅球(a)的能譜表征中N元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%，可見，在合成過程中，APTES與TEOS進(jìn)行了完美融合，將氨基接枝入硅球中形成雜化硅球.表面連接型熒光硅球(b)的N元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)是8.5%，較(a)有所增加，可推測熒光染料在雜化硅球外面接枝成功.

圖2 (a)氨基雜化硅球、(b)表面連接型熒光硅球的能譜分析Fig.2 EDS spectrum of amino hybrid silicon microspheres (a) and fluorescent silicon microspheres of surface connection type (b)

2.3 熒光納米硅球的紫外分析

使用ZF-20D暗箱式紫外分析儀對表面連接型及反相微乳液法、St?ber法制備的核-殼型熒光硅球進(jìn)行紫外照射，結(jié)果如圖3所示.

異硫氰酸熒光素在紫外燈照射下呈現(xiàn)出明顯的黃綠色熒光，由圖3可知，反相微乳液法(a)和st?ber法(b)制備的核-殼型熒光硅球在254 nm紫外燈下發(fā)出黃綠色特征熒光，而表面連接型(c)熒光硅球則無明顯變化.推測反相微乳液法和St?ber法制備的核-殼型熒光硅球中，熒光染料外面包覆的硅殼可很好地阻止熒光染料的泄漏和漂白，而表面連接型熒光硅球的熒光染料暴露在硅殼表面，易受外界影響從而削弱其熒光信號.

2.4 熒光光譜分析

分別將表面連接型、反相微乳液法及St?ber法制備的核-殼型熒光硅球均勻分散在無水乙醇中，進(jìn)行熒光光譜性質(zhì)的測定，結(jié)果如圖4所示.在492 nm的150 W氙燈激發(fā)下，反相微乳液法(a)、St?ber法(b)制備的核-殼型和表面連接型(c)鍵合FITC的熒光硅球在527 nm處均有較明顯的峰型顯示，而表面連接型熒光硅球(c)在527 nm處的峰強(qiáng)最弱，進(jìn)而說明表面連接型熒光納米硅球熒光信號最弱，被漂白嚴(yán)重，此結(jié)果與2.3中紫外分析結(jié)果一致，從而再次證明熒光染料外面包覆硅殼的優(yōu)越性.

2.5 掃描電子顯微鏡分析

為了探究不同方法制備的鍵合FITC熒光納米硅球尺寸大小及形貌，用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖5.由圖5可知，反相微乳液法(a)、St?ber法(b)制備的核-殼型和表面連接型(c)熒光硅球尺寸分布較均勻，分散性良好，平均粒徑分別為177、445、159 nm.

圖3 (a)反相微乳液法、(b) St?ber法制備的核-殼型及(c)表面連接型熒光硅球在254 nm紫外照射(左)前(右)后對比Fig.3 Comparison of fluorescent silicon microspheres of the surface connection type (c) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (a) and St?ber (b) between before (left) and after (right) UV irradiation

圖4 (a)反相微乳液法、(b) St?ber法制備的核-殼型及(c)表面連接型熒光硅球的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of fluorescent silicon microspheres of the surface connection type (c) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (a) and St?ber (b)

圖5 (a)反相微乳液法、(b)St?ber法制備的核-殼型及(c)表面連接型熒光硅球的掃描電子顯微鏡圖像Fig.5 SEM images of fluorescent silicon microspheres of the surface connection type (c) and core-shell type prepared with the methods of Reverse microemulsion (a) and St?ber (b)

2.6 反相微乳液法制得的熒光硅球的基本性能表征

2.6.1 熒光光譜表征

分別將FITC和反相微乳液法制得的熒光硅球均勻分散在無水乙醇中，進(jìn)行熒光光譜性質(zhì)的測定，結(jié)果如圖6所示.游離的FITC (a)在無水乙醇溶液中的熒光激發(fā)波長為492 nm，熒光發(fā)射峰在525 nm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光納米硅球的熒光激發(fā)峰的位置與形狀，與FITC相比基本保持不變，但是發(fā)射峰的位置略有紅移(527 nm)，SiO2基質(zhì)與染料相互作用，會引起能量的損失，導(dǎo)致熒光發(fā)射峰紅移.

2.6.2 染料泄漏值及光穩(wěn)定性測定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC在以APTES為橋梁下能穩(wěn)定存在于SiO2網(wǎng)絡(luò)中.將經(jīng)過乙醇和水洗滌后的納米硅球分散到二次蒸餾水中，7 h內(nèi)熒光染料泄漏程度小于8%，如圖7(左)所示.同時還考察了熒光納米硅球的光漂白行為，以150 W的氙燈為激發(fā)光源，經(jīng)過30 min的連續(xù)照射后發(fā)現(xiàn)，熒光納米硅球的熒光強(qiáng)度降低2.2%，如圖7(右)，熒光信號基本保持不變，這是由于硅殼的保護(hù)作用，說明鍵合FITC熒光納米硅球光穩(wěn)定性良好.

3 結(jié)論

以氨基硅烷做橋梁分子，利用其氨基可與異硫氰酸熒光素(FITC)的異硫氰基(-N=C=S)加成連接，氨基硅烷可與正硅酸乙酯(TEOS)的硅羥基共價結(jié)合的特點(diǎn)，將FITC穩(wěn)固地鍵合在硅膠中.核-殼型與表面連接型鍵合FITC的熒光納米硅球形貌相似、粒徑接近，但表面連接型熒光硅球光漂白性嚴(yán)重.反相微乳液法制備的核-殼型熒光納米硅球比St?ber法粒徑更小且易控，熒光信號更強(qiáng)，染料泄漏低，光穩(wěn)定性良好.因此反相微乳液法為上述多種方法中最佳，其制備的鍵合FITC的熒光納米硅球有望在藥物標(biāo)記、傳輸、檢測、高通量藥物篩選及生物成像、傳感等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用.

圖6 (a) FITC (b) FITC-APTES@SiO2的熒光光譜圖Fig.6 Fluorescence spectra of FITC(a) and FITC-APTES@SiO2 (b)

圖7 FITC-APTES@SiO2的(左)染料泄漏曲線與(右)光穩(wěn)定曲線Fig.7 Dye leakage curve (left) and light stabilization curve (right) of FITC-APTES@SiO2

[1] 徐慶杰.功能性微球的可控制備與表征[D].無錫：江南大學(xué)，2013. XU Q J.The controllable preparation and characterization of functional microspheres[D].Wuxi:Jiangnan University，2013.

[2] 杜磊，劉烈雄，曹元成.基于光譜自編碼微球的多樣品酶聯(lián)免疫檢測混合篩選[J].精細(xì)化工，2004,21(9):667-670.DOI:10.13550/j.jxhg.2004.09.008. DU L,LIU L X,CAO Y C.Mixed screening of multi-samples in ELISA based on optical self-encoding microbeads[J].Fine Chemicals,2004,21(9):667-670.DOI:10.13550/j.jxhg.2004.09.008.

[3] 汪地強(qiáng)，劉白玲，胡杰，等.熒光微球的制備及應(yīng)用[J].高分子材料科學(xué)與工程，2004,20(4):42-45.DOI:10.3321/j.issn:1000-7555.2004.04.010. WANG D Q,LIU B L,HU J,et al.The preparations and applications of fluorescent microsphere[J],Ploymer Materials Science and Engineering,2004,20(4):42-45.DOI:10.3321/j.issn:1000-7555.2004.04.010.

[4] 張榮榮，徐自立.熒光微球的制備技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展[J].高分子通報，2009,1:63-70.DOI:10.14028/j.cnki.1003-3726.2009.01.005. ZHANG R R,XU Z L .Development of preparations and applications of fluorescent microsphere[J].Polymer Bulletin.2009,1:63-70.DOI:10.14028/j.cnki.1003-3726.2009.01.005.

[5] 陳中舉，張燕玲，黃金瑛.熒光標(biāo)記生物大分子及其應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊，2004,27(6):348-352.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2004.06.007. CHEN Z J,ZHANG Y L,HUANG J Y.The labeling of biological big molecule with fluorescence dye and its applications[J],Biomedical Engineering Foreign Medical Sciences,2004,27(6):348-352.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2004.06.007.

[6] ZHANG Q,WANG X L,LI P Z,et al.Biocompatible,uniform,and redispersible mesoporous silica nanoparticles for cancer-targeted drug delivery in vivo[J].Advanced Functional Materials,2014,24:2450-2461.DOI:10.1002/adfm.201302988.

[7] SCHULZ A,MCDONAGH C.Intracellular sensing and cell diagnostics using fluorescent silica nanoparticles[J].Soft Matter,2012,8(9):2579-2585.DOI:10.1039/c2sm06862a.

[8] 謝春娟，尹東光，李劍,等.新型FITC摻雜的二氧化硅熒光納米粒子的合成及其應(yīng)用于pH傳感的研究[J].分析化學(xué)，2010,38(4):488-492.DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00488. XIE C J，YIN D G，LI J,et al.Preparation of a novel type of fluorescein isothiocyanate doped fluorescent silica nanoparticles and its application as pH probe[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2010,38(4):488-492.DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00488.

[9] HAN Y,JIANG J,LEE S S,et al.Reverse microemulsion-mediated synthesis of silica-coated gold and silver nanoparticles[J].Langmuir,2008,24(11):5842-5848.DOI:10.1021/la703440p.

[10] SANTRA S,LIESENFELD B,BERTOLINO C,et al.Fluorescence lifetime measurements to determine the core-shell nanostructure of FITC-doped silica nanoparticles:An optical approach to evaluate nanoparticle photostability[J].Journal of Luminescence,2006,117:75-82.DOI:10.1016/j.jlumin.2005.04.008.

[11] BUMS A,SENGUPTA P,ZEDAYKO T,et al.Core/shell fluorescent silica nanoparticles for chemical sensing:towards single-particle laboratories[J].Small,2006,2(6):723-726.DOI:10.1002/smll.200600017.

[12] ZHANG X,SONG C,CHEN L,et al.A novel immunoassay for residual bovine serum albumin (BSA) in vaccines using laser-induced fluorescence millimeter sensor array detection platform[J].Biosensors and Bioelectronics,2011,26:3958-3961.DOI:10.1016/j.bios.2011.02.050.

(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Preparation and characterization comparison of FITC bonded fluorescent silica nanospheres with surface connection type and core-shell type

CAI Shaofan,JIN Qiu,WEI Haiying,Lü Yunkai
(College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Silica fluorescent nanoparticles were prepared with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the fluorescent molecule and silica as the biocompatible carrier.To enhance the stability of the microspheres,the bridge molecule (γ-aminopropyl triethoxysilane,APTES) was introduced.Owing to the non-unity of the connection sequences of FITC,SiO2with APTES,two types (surface connection type and core-shell type) of FITC bonded fluorescent silica nanospheres were prepared and compared in their morphologies and photobleachings.The results show that both types had similar morphology,but the surface connection type was optically bleached seriously.Furthermore,two typical methods of packaging silicon (St?ber and reverse microemulsion) were compared.Core-shell FITC bonded fluorescent silica nanospheres preparaed by reverse microemulsion method showed stronger fluorescence signal,and had smaller particle size and better dispersibility.In addition the value of fluorescent dye leak was less than 8% within 7 h in the dye leakage experiment and the fluorescence intensity decreased only 2.2% within 30 min in light stability experiment,which showed the low dye leakage degree and good light stability properties.

fluorescein isothiocyanate (FITC);fluorescent silica nanospheres;photobleaching;dye leakage;light stability

2016-08-03

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2016201213)

蔡少凡(1991—)，女，河南漯河人，河北大學(xué)在讀碩士研究生，從事熒光功能微球的研究. E-mail:csfan0906@126.com

魏海英(1977—),女，河北邯鄲人，河北大學(xué)副教授，博士，主要從事功能MOFs材料研究. E-mail:weihy@hbu.cn

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.03.005

O613.7

A

1000-1565(2017)03-0248-06