豬腹瀉性病毒病熒光定量PCR鑒別診斷方法研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

豬腹瀉性病毒病熒光定量PCR鑒別診斷方法研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 于新友 李天芝

熒光定量PCR方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、快速高效、定量準確、全封閉反應等優(yōu)點，越來越受到廣大獸醫(yī)相關工作者的關注，在動物疾病診斷中應用越來越廣泛，本文綜述了豬腹瀉性病毒病熒光定量PCR鑒別診斷方法的研究進展情況，以期為今后豬腹瀉性病毒病的診斷和防控工作提供參考。

豬腹瀉性病毒?。粺晒舛縋CR；鑒別診斷

腹瀉是當前威脅養(yǎng)豬業(yè)的一類重要疾病，導致豬腹瀉的原因很多，包括營養(yǎng)性腹瀉、細菌性腹瀉、病毒性腹瀉和寄生蟲等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一種因素，病毒性腹瀉傳播快、危害大、無特效藥物治療，且發(fā)生與流行在近年呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]，引起豬發(fā)生腹瀉的病毒主要有流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒及豬繁殖與呼吸綜合征病毒[2]等。核酸檢測技術是通過對疾病相關的核酸分子研究，了解疾病的發(fā)生、發(fā)展情況，為疾病的診斷及防控工作提供參考。隨著技術的不斷發(fā)展和成熟，核酸檢測技術在獸醫(yī)臨床中的地位顯得更為重要。實時熒光定量PCR是在PCR技術基礎上發(fā)展起來的一種的核酸檢測技術。它是在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，不再需要對PCR產(chǎn)物進行檢測，即可實現(xiàn)對未知模板定性檢測或定量分析。因其具有特異性強、靈敏度高、重復性好、快速高效、定量準確、全封閉反應、高通量等優(yōu)點，在獸醫(yī)臨床診斷中應用越來越廣泛，本文綜述了豬腹瀉性病毒病熒光定量PCR診斷方法的研究進展，以期為今后豬腹瀉性病毒病的診斷和防控工作提供參考。

1 實時熒光定量PCR技術

1.1 熒光定量PCR技術原理

實時熒光定量PCR就是在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光探針，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，獲得不同樣品達到一定的熒光信號(閾值)時所需的循環(huán)次數(shù)，即Ct值。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

1.2 熒光定量PCR技術分類

實時熒光定量PCR包括染料法和探針法兩種，探針法是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，染料法則是利用與雙鏈DNA小溝結合發(fā)光的理化特征指示擴增產(chǎn)物的增加，常用的染料有SYBR GreenⅠ、SYBR Gold、Power SYBR Green等。探針法特異性好，染料法操作簡便，成本低。

2 在豬腹瀉性病毒病檢測中的應用

2.1 豬流行性腹瀉病毒診斷

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)可導致豬流行性腹瀉，主要特征是嘔吐、脫水和水樣腹瀉，多發(fā)生于冬、春季節(jié)。各日齡的豬均可感染PEDV發(fā)病，其中哺乳仔豬受到的危害最嚴重。董世娟等[3]建立檢測PEDV的TaqMan熒光定量PCR方法，建立的定量標準曲線Ct值和模板起始拷貝數(shù)對數(shù)在108～101copies/μL有良好的線性關系，相關系數(shù)的平方為0.997，該法可檢測6.368copies/μL的模板量。于長青等[4]建立了基于SYBR GreenⅠ的PEDV熒光定量PCR檢測方法。結果顯示，該法擴增效率為100.4%，相鄰擴增曲線之間間距均勻，所有產(chǎn)物的熔解曲線具有單一整齊的峰，標準曲線具有優(yōu)良的線性關系，最低可準確檢測520拷貝/μL的模板量，重復性試驗的變異系數(shù)小于3%。曹貝貝等[5]建立了檢測PEDV的SYBR Green I熒光定量RTPCR方法。該法對常見的病毒均未檢測到熒光信號，而僅對PEDV檢測為陽性，其靈敏度為57copies/μL，組內和組間變異系數(shù)均小于1%。

2.2 豬傳染性胃腸炎病毒診斷

傳染性胃腸炎病毒(TGEV)可引起豬傳染性胃腸炎，該病是一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征高度傳染性疾病，秋始、冬春為該病高發(fā)期。各種不同品種和月齡的豬都能感染TGEV發(fā)病，2周齡受到的危害最為嚴重，一旦感染后，其死亡率可高達100%。5周齡以上的豬感染后雖然死亡率不高，但生長緩慢，飼料利用率低。王建中等[6]參照GenBank登錄的TGEV S基因序列設計引物，通過優(yōu)化反應條件，建立了檢測TGEV的熒光定量PCR檢測方法，結果顯示，該法具有良好的特異性，對其他病原的檢測結果為陰性，其檢測敏感性可達43.07copies/μL，是普通RT-PCR檢測方法的100倍。方振華等[7]將TGEV N基因部分片段克隆并連接到pGEM-T Easy載體上，得到重組質粒，以此為標準模板進行SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR擴增并制作標準曲線，建立TGEV的熒光定量RT-PCR檢測方法。該法檢測靈敏度可達10copies/μL，具有良好的特異性和重復性。李繼良等[8]根據(jù)TGEV的N基因設計引物，建立了基于SYBR GreenⅠ的TGEV熒光定量PCR檢測方法，該法的擴增效率為101%，標準曲線的決定系數(shù)為0.9997，可準確檢測的最低核酸模板濃度為490copies/μL，重復性試驗的變異系數(shù)小于3%。

2.3 豬輪狀病毒診斷

豬輪狀病毒(PoRV)可引起豬的腹瀉，1～4周齡仔豬最易感，發(fā)病率在80%以上，死亡率為7%～20%，育成豬和成年豬通常為隱性感染[9]。主要臨床表現(xiàn)為厭食、嘔吐、水樣腹瀉，導致仔豬嚴重脫水和酸堿平衡紊亂，繼發(fā)細菌性感染后，病死率升高。陳小金等[10]根據(jù)GenBank中登錄的A群豬輪狀病毒(PoRV)毒株序列，針對VP7基因設計了1對特異性引物，建立了檢測A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法，結果顯示，該法1.3×108～1.3×102copies/ μL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)的平方為0.999，最低檢測限為1.3×101copies/μL，對豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）核酸檢測結果為陰性，批內及批間變異系數(shù)均低于2%。高婉俊等[11]建立了檢測G9型Po RV的Taq Man熒光定量RT-PCR檢測方法，結果顯示，該法的相關系數(shù)的平方為0.991，對其他常見的Po RV(G5)、TGEV、PEDV、PRRSV和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)等豬病原檢測均陰性，具有良好的特異性，最低可以檢測到的病毒滴度為103TCID50，比普通RT-PCR方法靈敏度高約1,000倍，組內和組間變異系數(shù)均小于0.87%，穩(wěn)定性高，重復性好。

2.4 豬偽狂犬病毒診斷

豬偽狂犬病毒(PRV)不但能引起母豬繁殖障礙（如流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔），還可引起仔豬的拒食、嘔吐、腹瀉、呼吸困難、口吐白沫，有共濟失調、轉圈和抽搐等神經(jīng)癥狀，感染率和死亡率可達100%。田青等[12]根據(jù)PRVg B基因保守序列，設計引物和Taq Man探針，建立了檢測PRV的熒光定量PCR方法。該法可檢測到相當于10copies/μL的病毒DNA，比常規(guī)PCR檢測方法高約100倍，敏感性較強，該方法檢驗CSFV、PRRSV和PCV2呈現(xiàn)陰性結果，特異性強，變異系數(shù)小于1%，具有良好的重復性。 張志等[13]針對PRV疫苗株基因組缺失的3.5kb片段，設計3套引物和探針，建立了一種新的快速鑒別PRV野毒株和疫苗株的實時熒光定量PCR方法。該法的檢測極限可達10copies/μL，并與CSFV、PRRSV、PPV和PCV2等不存在交叉反應現(xiàn)象，批內和批間重復性試驗的變異系數(shù)分別（1.70±1.07）%和（2.22±1.02）%，重復性好。陳如敬等[14]根據(jù)PRV gE基因序列，設計引物，建立基于SYBR GreenⅠ染料的PRV實時熒光定量PCR檢測方法。結果表明，該法檢測豬PRV gE基因在7.53×10-1～7.53×10-6copies/ μL線性關系較好，從生成的熔解曲線可見，建立的方法僅對豬PRV檢測出現(xiàn)單一特異峰，其熔解溫度(Tm值)為(92.9±0.1)℃，PCV2、PPV、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌均未見特異性峰值，該法組內和組間變異系數(shù)分別為0.31%～1.14%和0.42%～1.74%。

2.5 豬瘟病毒診斷

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病。不同年齡、性別、品種的豬均易感，一年四季均可發(fā)生。根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為急性型豬瘟、慢性型豬瘟、非典型性豬瘟和遲發(fā)型豬瘟，急性型與慢性型豬瘟均有腹瀉的臨床表現(xiàn)，主要為急性型豬瘟病初便秘，隨后出現(xiàn)糊狀或水樣并混有血液的腹瀉，大便惡臭。慢性型豬瘟食欲時好時壞，便秘和腹瀉交替發(fā)生。謝金文等[15]建立了能鑒別CSFV強毒感染與弱毒疫苗的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，其Tm值分別為84.5±0.5℃和88.5±0.5℃，該法特異性強，對其他相關病毒無特異性擴增，敏感性高，最低檢出量為5×RID50的細胞毒基因組拷貝，重復性好，并且擴增效率高、線性范圍廣、檢測時間短。岳鋒等[16]根據(jù)GenBank中CSFV 5'NTR的保守序列，設計1對特異性引物和TaqMan探針，以CSFV全長基因重組質粒pGEM-CSFV為標準品，建立TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線，進行特異性、敏感性和重復性試驗。結果表明，標準曲線循環(huán)閾值與模板濃度具有良好的線性關系，相關系數(shù)的平方為0.999，敏感性高，最低檢測限為1×101copies/μL，特異性強，與PCV2、PPV、PRV和PRRSV無交叉反應性，重復性好，組內和組間變異系數(shù)均小于2%。杜冬華等[17]根據(jù)CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差異，建立了能同時檢測CSFV野毒株和疫苗株的雙重Taq Man real-time PCR鑒別檢測方法。結果表明，建立的CSFV雙重Taq Man real-time PCR標準曲線Ct值與1×101～1×106copies/μL之間的E2基因拷貝數(shù)呈良好的線性關系，靈敏度達10copies/μL，且特異性和重復性很好。

2.6 豬圓環(huán)病毒2型診斷

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、母豬繁殖障礙、斷奶豬和育肥豬呼吸道疾病、豬皮炎腎病綜合征、豬腹瀉綜合征以及仔豬的中樞系統(tǒng)疾病等多種疾病。其中引起的豬腹瀉綜合征主要表現(xiàn)為腹瀉與正常排便交替出現(xiàn)，用藥效果不明顯，反復遷延。郭慧娟等[18]建立了一種檢測PCV2的TaqMan熒光定量PCR方法。結果顯示，該法與豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬流感病毒、PRRSV、PRV、CSFV等均無交叉反應，最低可檢測4.53×102copies/μL的模板量，比PCR檢測方法高100倍，其標準曲線線性范圍是102～109copies/ μL，重復性好。于新友等[19]采用PCR擴增PCV2 ORF2基因242bp片段，并克隆入pMD18-T載體中，以純化的重組質粒為模板作熒光定量PCR擴增，建立了PCV2熒光定量PCR檢測方法，該方法檢測靈敏度可達1.2×10-1copies/μL，與PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、乙型腦炎病毒(JEV)核酸均不發(fā)生擴增反應，具有很好的特異性和重復性。郝立沙等[20]根據(jù)GenBank中PCV2保守序列，設計1對特異性引物和Taq Man探針，制備標準品，建立PCV2的熒光定量檢測方法。結果表明：該方法在1×101～1×108copies/μL的模板范圍內具有良好的線性關系，相關系數(shù)可達0.999，敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍，對PPV、PRV、CSFV、PRRSV均為陰性，沒有交叉反應，批內、批間重復試驗變異系數(shù)均小于2.50%，在臨床檢測中，比常規(guī)PCR方法檢測PCV2的陽性檢出率高出38%。

2.7 PRRSV診斷

PRRSV可引起豬繁殖與呼吸綜合征，各日齡豬均可感染，母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙，母豬流產(chǎn)率可達30%以上，仔豬可表現(xiàn)為呼吸困難、腹瀉等，仔豬腹瀉多發(fā)生于出生2d以后，糊狀下痢，有的排出灰色或黑色焦油狀稀便，部分便中帶血，發(fā)病率50%以上，死亡率30%以上，無明顯的季節(jié)性，吳海港等[21]根據(jù)PRRSV的ORF7保守序列分別設計引物和TaqMan探針，建立了基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測PRRSV的方法。該法擴增效率為97%，具有良好的線性關系。利用建立的方法檢測PCV2、PPV、PRV、CSFV、JEV，結果均為陰性，特異性性好。靈敏度試驗表明該方法檢測極限為5copies/μL。溫青娜等[22]根據(jù)歐洲型PRRSV N基因、美洲型PRRSV M基因和高致病性PRRSV nsp2基因的各自保守序列設計特異性的引物和不同熒光標記的TaqMan熒光探針，通過優(yōu)化反應體系和擴增條件，建立了能夠檢測歐洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重實時熒光定量PCR方法。該方法的重復試驗表明其批內和批間的變異系數(shù)最高值分別為1.84%和1.76%，靈敏性試驗表明其檢測下限為10copies/μL，特異性試驗表明與其他一些豬源病毒無交叉反應，具有良好的特異性，臨床試驗表明，該方法能夠快速準確地檢測出臨床組織樣本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸，該法還可以檢測出歐洲型PRRSV目的基因。

2.8 其他病毒診斷

熒光定量PCR方法還用于豬博卡病毒[23]、豬嵴病毒[24]和豬捷申病毒[25]等多種豬腹瀉相關病毒的檢測，試驗結果都表明熒光定量PCR是一種簡便、快速、高靈敏和高特異的核酸擴增方法。

3 小結

熒光定量PCR方法作為一種快速基因擴增方法，自出現(xiàn)以來，受到了廣泛的關注，在國內外疾病診斷、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個領域都取得了重大成就，在動物疾病病因的確診方面發(fā)揮的巨大的作用，檢測敏感性高，可檢測潛伏期的病原，起到了對豬場疾病的預警作用，檢測結果快速、準確，可及時分析豬的病因，采取合適的治療措施，從而及時有效控制疫情，使養(yǎng)殖場損失降到最低。但熒光定量PCR技術同樣存在一些不足，①在對模板進行定量檢測時，由于各單位所用的標準品各不相同，產(chǎn)生的標準曲線也不同，導致實驗結果會有偏差。②在對RNA模板的樣品進行定量時，不用廠家的逆轉錄酶的效率不同，可能導致結果不一致。③由于進行封閉檢測，不通過電泳檢測結果，所以不能監(jiān)測擴增產(chǎn)物的大小，尤其是用染料法檢測時易出現(xiàn)假陽性結果。④對操作人員要求高，一旦出現(xiàn)問題，不能分析原因。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，各國專家學者不斷研發(fā)出新型的熒光定量PCR儀器，降低了儀器成品，開發(fā)了一些便攜式熒光定量PCR，方便攜帶，成本低廉，并不斷降低試劑的成本，提高試劑檢測的敏感性，如果再制定一系列統(tǒng)一的檢測標準，對檢測人員開展相應的培訓，熒光定量PCR檢測方法必定在豬腹瀉性病毒病的基層實驗室檢測和流行病學調查中發(fā)揮重要的作用。■

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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-08-17)。