Smac和Livin的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)性分析

劉瓊珊，張妙清，鄭芝祥

(汕頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 汕頭 515000)

Smac和Livin的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)性分析

劉瓊珊，張妙清，鄭芝祥

(汕頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 汕頭 515000)

目的 探討凋亡相關(guān)蛋白Smac、Livin在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 選取2014年3月至2015年3月汕頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科宮頸鱗狀細(xì)胞癌24例(宮頸癌組)，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ15例(CINⅠ組)，CINⅡ 13例(CINⅡ組)，CINⅢ 13例(CINⅢ組)，正常宮頸組織15例作為正常對照(對照組)，采用免疫組化法檢測各組的Smac和Livin表達(dá)情況。結(jié)果 宮頸癌組Smac陽性比例為83.33%，明顯高于對照組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.658，P<0.05)；宮頸癌組、CINⅡ組和CINⅢ組Smac陽性比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.204，P>0.05)；宮頸癌組、CINⅡ組和CINⅢ組Livin陽性比例分別為79.17%、76.92%和84.62%，明顯高于對照組(χ2值分別為19.420、17.279、14.412，均P<0.05)；CINⅠ組與對照組Smac和Livin陽性比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為0.536、0.000，均P>0.05)；CINⅠ組Smac和Livin陽性比例明顯低于CINⅡ組、CINⅢ組和宮頸癌組(χ2值分別為20.843、22.611，均P<0.05)；低分化患者Smac陽性比例為42.86%，明顯低于高中分化患者(χ2=11.657，P<0.05)；宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Smac和Livin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.872，P<0.05)。結(jié)論 Smac和Livin在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用。

宮頸鱗狀細(xì)胞癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變；Smac蛋白；Livin蛋白；免疫組化染色

宮頸癌是臨床上較為常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來呈現(xiàn)出了一定的上升趨勢[1-2]。對于婦科惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)特性的改變是影響到宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。細(xì)胞凋亡蛋白可以通過影響細(xì)胞周期、控制細(xì)胞擴(kuò)增速度，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的異常增殖。線粒體凋亡相關(guān)蛋白(Smac)、存活蛋白(Livin)可以影響宮頸上皮細(xì)胞的分化和凋亡，進(jìn)而參與到宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程之中[3-5]。本研究通過選取2014年3月至2015年3月汕頭市中心醫(yī)院宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)組織，探討了Smac、Livin的異常表達(dá)，及其與宮頸癌患者臨床病理特征間的關(guān)系，報道如下。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

選取2014年3月至2015年3月汕頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科宮頸活檢及手術(shù)存檔的宮頸組織石蠟包膜標(biāo)本80例，其中宮頸鱗狀細(xì)胞癌24例(宮頸癌組)，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ15例(CINⅠ組)，CINⅡ 13例(CINⅡ組)，CINⅢ 13例(CINⅢ組)，正常宮頸組織15例作為正常對照(對照組)，全部標(biāo)本均4μm厚連續(xù)切片。各組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

組別例數(shù)(n)年齡(歲)FP宮頸癌組2442．05±8．923．4060．763CINⅠ組1541．87±9．88CINⅡ組1342．10±10．14CINⅢ組1341．56±10．03對照組1540．18±9．77

1.2免疫組化染色

采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度4μm，3%H2O2室溫孵育 5min，采用去離子水水沖洗3次，每次3min，采用濃度為10% 牛奶蛋白(1g蛋白加入100mL純水)封閉，室溫孵育 5min，加入Smac、Livin抗體(鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司)， 37 ℃ 孵育 2h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，滴加HRP標(biāo)記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測公司)，37 ℃ 孵育 30min，PBS 沖洗3次，每次5min，加入 NBT/BCIP色劑顯色 5min，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.3實驗結(jié)果判斷

高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，對染色情況及陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評分，其中染色弱為1分，清晰為2分，染色強(qiáng)為3分；陽性細(xì)胞比例<1.0%為0分，1.0%～10.0%為1分，11.0%～50.0%為2分，51.0%～80.0%為3分，>80.0%為4分。兩者評分之和≥3分為陽性表達(dá)，<3分為陰性表達(dá)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組Smac和Livin檢測結(jié)果比較

Smac和Livin陽性細(xì)胞為胞質(zhì)染色，呈棕黃色(圖1)。宮頸癌組Smac陽性比例為83.33%，明顯高于對照組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.658，P=0.000<0.05)；宮頸癌組、CINⅡ組和CINⅢ組Smac陽性比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.204，P=0.332>0.05)；宮頸癌組、CINⅡ組和CINⅢ組Livin陽性比例分別為79.17%、84.62%和76.92%，明顯高于對照組(χ2值分別為19.420、14.412、17.279，均P<0.05)；CINⅠ組與對照組Smac和Livin陽性比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為0.536、0.000，均P>0.05)；CINⅠ組Smac和Livin陽性比例明顯低于CINⅡ組、CINⅢ組和宮頸癌組(χ2值分別為12.923和14.412、17.949和17.279、25.658和19.420，均P<0.05)，見表2。

圖1 免疫組染色圖(×400)

Fig.1 Immunohistochemical staining(×400)

表2 各組Smac和Livin檢測結(jié)果比較[n(%)]

Table 2 Comparison of Smac and Livin detection results among different groups [n(%)]

注：*與對照組比較P<0.05；#與CINⅠ組比較P<0.05。

2.2 Smac和Livin蛋白與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Smac和Livin蛋白陽性表達(dá)在宮頸癌患者不同年齡和臨床分期間差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；低分化患者Smac陽性比例為42.86%，明顯低于高中分化患者(P<0.05)，見表3。

表3 Smac和Livin蛋白與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3相關(guān)性分析

宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Smac和Livin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.872，P<0.05)，見表4。

表4 宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Smac和Livin相關(guān)性分析(n)

Table 4 Correlation analysis of Smac and Livin in cervical squamous cell carcinoma(n)

3討論

3.1宮頸癌相關(guān)分子生物學(xué)研究研究的重要意義

高危型人乳頭瘤狀病毒感染、多次人工流產(chǎn)及過早進(jìn)行性生活等，均可以促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。雖然宮頸細(xì)胞學(xué)、宮頸陰道鏡檢查等可以提高宮頸癌的早期篩查水平，改善患者的遠(yuǎn)期臨床預(yù)后[6]，但一項匯集了115例樣本量的臨床回顧性研究分析顯示，宮頸癌的平均生存時間不足24個月，5年生存率不足35%，生存指標(biāo)較差[7-8]。對于宮頸病變發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)生物學(xué)分子機(jī)制的研究，可以為宮頸癌的分子靶向治療或者其他生物學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)，從而提高患者的遠(yuǎn)期生存指標(biāo)。

3.2 Livin及Smac在癌癥發(fā)生中的作用

宮頸CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸原位癌是臨床上連續(xù)性的宮頸病變，在此過程中宮頸鱗狀上皮異常病變細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少，呈現(xiàn)出了明顯的分化不良的表現(xiàn)。而細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，可以通過影響mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)因子，進(jìn)而調(diào)控宮頸病變細(xì)胞的增殖和分化等病理過程[9-10]。Smac存在于哺乳動物細(xì)胞中，可以結(jié)合多種凋亡抑制分子，通過形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，影響半胱氨酸天冬氨酸酶的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡；Livin是內(nèi)源性的細(xì)胞凋亡抑制因子，可以抑制下游caspase-3、caspase-7等的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)性的異常增殖[11-12]。國內(nèi)外研究證實，Livin及Smac在卵巢癌、肝癌、乳腺癌等中的異常高表達(dá)，同時Livin及Smac的異常表達(dá)與患者的臨床病理特征具有密切的關(guān)系[13]，但在宮頸癌中的研究較少。雖然有研究探討了Livin及Smac與宮頸癌的關(guān)系，但相關(guān)研究的樣本量較少、臨床資料的收集偏移較為嚴(yán)重。

3.3 Livin及Smac在宮頸癌患者中的表達(dá)及與病理參數(shù)的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組、CINⅠ組、CINⅡ組和CINⅢ組患者宮頸病變組織中的Livin及Smac均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Livin及Smac參與到了宮頸病變的發(fā)生發(fā)展過程中。Livin及Smac可以通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸酶、磷酸化酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和增殖活性，促進(jìn)宮頸鱗狀上皮細(xì)胞的異常病變。 Xu等[12]與Jiang等[13]研究者通過回顧性分析了53例樣本量的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織的免疫組化資料，發(fā)現(xiàn)Livin的表達(dá)陽性率可較對正常宮頸對照組織上升25%，這與本研究的結(jié)論較為一致。宮頸CINⅠ病變組及對照組患者間并未發(fā)現(xiàn)Livin及Smac表達(dá)的顯著性差異(P>0.05)，提示Livin及Smac主要參與高級別的宮頸病變的發(fā)生發(fā)展過程。但是本研究發(fā)現(xiàn)在CINⅠ組、CINⅡ組和CINⅢ組各組患者中的相關(guān)蛋白表達(dá)具有一定的差異，CINI組織中的Livin及Smac陽性率較低，明顯低于CINⅡ及CINⅢ組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Livin及Smac對于高級別宮頸病變的促進(jìn)作用更為明顯。這與 Xu等[12]研究者的結(jié)論并不完全一致，考慮到樣本量的不足、檢測方法的差異及臨床資料的收集偏移等，均可能導(dǎo)致的統(tǒng)計結(jié)果的差別。Smac和Livin蛋白與宮頸癌患者的年齡及臨床分期并不具有明顯的關(guān)系，臨床分期為Ⅰ期及Ⅲ、Ⅳ期的宮頸癌患者，其Smac和Livin蛋白的表達(dá)陽性率均可維持在70%～80%左右，但在低分化的宮頸癌組織中可見Smac的高濃度表達(dá)，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Smac和Livin陽性比例均為100.00%，均明顯高于對照組(P<0.05)，這些均提示了Smac和Livin可能參與到了宮頸癌細(xì)胞的異常分化或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理過程。Smac可以促進(jìn)宮頸癌患者淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對于淋巴結(jié)的浸潤，促進(jìn)病情的進(jìn)展。相關(guān)關(guān)系分析也可見，Smac和Livin的表達(dá)呈正相關(guān)，二者在調(diào)控細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞分化等過程中可能發(fā)揮了協(xié)同性的作用，但其具體作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，在宮頸癌患者中Smac和Livin的表達(dá)陽性率明顯上升，同時二者與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及細(xì)胞分化程度具有一定的關(guān)系。本研究的局限性在于樣本量不足，同時對于Smac和Livin與宮頸癌患者遠(yuǎn)期生存預(yù)后的關(guān)系分析不足。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：張忠明]

Correlation analysis between expressions of Smac and Livin and the occurrence and development of cervical squamous cell carcinoma

LIU Qiong-shan, ZHANG Miao-qing, ZHENG Zhi-xiang

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ShantouCentralHospital,GuangdongShantou515000,China)

Objective To investigate the expressions and clinical significance of apoptosis related protein Smac and Livin in cervical squamous cell carcinoma. Methods From March 2014 to March 2015 24 cases of cervical squamous cell carcinoma (cervical cancer group), 15 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN)Ⅰ (CIN Ⅰ group), 13 cases of CIN Ⅱ (CIN Ⅱ group), 13 cases of CIN Ⅲ (CIN Ⅲ group), and 15 cases of normal cervical tissue (control group) were selected. The expressions of Smac and Livin in each group were detected by immunohistochemistry. Results The positive rate of Smac in cervical cancer group was 83.33%, which was higher than that in the control group with statistical significance (χ2=25.658,P<0.05). There was no significant difference in Smac positive rate among cervical cancer group, CIN Ⅱgroup and CIN III group (χ2=2.204,P>0.05). The positive rate of Livin in cervical cancer group, CIN Ⅱgroup and CIN Ⅲ group was 79.17%, 76.92% and 84.62%, respectively, which were significantly higher than that in the control group (χ2value was 19.420, 17.279 and 14.412, respectively, allP<0.05). There was no significant difference in the positive rates of Smac and Livin between CIN I group and the control group (χ2value was 0.536 and 0.000, respectively, bothP>0.05). The positive rates of Smac and Livin in the CIN Ⅰ group were significantly lower than those in CIN Ⅱgroup, CIN III group and cervical cancer group (χ2value was 20.843 and 22.611, respectively, bothP<0.05). The positive rate of Smac in the patients with low differentiation was 42.86%, which was significantly lower than that in the patients with high-medium differentiation (χ2=11.657,P<0.05). The expressions of Smac and Livin in cervical squamous cell carcinoma were positively correlated (r=0.872,P<0.05). Conclusion Smac and Livin play a synergistic role in the development and progression of cervical squamous cell carcinoma.

cervical squamous cell carcinoma; cervical intraepithelial neoplasia (CIN); Smac; Livin; immunohistochemistry

2016-10-24

劉瓊珊(1984-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤研究。

鄭芝祥，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.04.027

R737.33

A

1673-5293(2017)04-0444-04