一種復(fù)方口服美容液的抗衰老作用及毒理學(xué)實驗研究

謝曉輝，朱 瑤，竇智燕，陳健文，徐巨才

?論 著?

一種復(fù)方口服美容液的抗衰老作用及毒理學(xué)實驗研究

謝曉輝1，朱 瑤1，竇智燕1，陳健文1，徐巨才2

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣東 廣州 510006；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院 廣東 廣州 510640）

目的：探究一種中草藥組方口服液的美容功效及其毒理學(xué)安全性。方法：采用D-半乳糖聯(lián)合光照誘導(dǎo)裸鼠皮膚衰老模型，評價該組方對皮膚衰老的改善作用；通過小鼠經(jīng)口亞急性毒性實驗，連續(xù)喂食14d，對組方進行安全性評價。結(jié)果：本中草藥組方口服液中、高劑量能有效增加皮膚透明質(zhì)酸的含量，提高皮膚含水量，增加皮膚中膠原蛋白和彈性蛋白的含量，對皮膚病理學(xué)有改善作用；經(jīng)口亞急性毒性實驗可見有腹瀉和體重稍減輕現(xiàn)象，但未見明顯毒性及死亡。結(jié)論：本中草藥組方口服液有一定延緩裸鼠皮膚衰老的功效，且未見明顯毒性。

中藥；抗皮膚衰老；光老化；D-半乳糖

皮膚衰老作為機體衰老的重要部分，常伴隨著皮膚及其附屬器官的萎縮、功能減退、皮膚干燥等現(xiàn)象[1]。皮膚衰老原因分為內(nèi)在因素和外在因素，前者與年齡有關(guān)，而后者主要包括紫外線及空氣污染，故面頸部、手臂等長期暴露的皮膚，最先顯現(xiàn)出衰老表象[2]。目前對皮膚衰老的研究多基于自由基氧化損傷學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為皮膚衰老與機體抗氧化、清除自由基的能力下降相關(guān)，并認(rèn)為適量增加抗氧化物質(zhì)、清除體內(nèi)過量自由基可延緩皮膚衰老[3]。中藥因富含酚類、萜類等天然抗氧化活性物質(zhì)，故其在抗皮膚衰老的研究中越來越多。本文考察的組方由黃芪、玉竹、生地黃、玫瑰花提取物聯(lián)合膠原蛋白、彈性蛋白肽、透明質(zhì)酸組成。本研究采用D-半乳糖皮下注射聯(lián)合紫外照射致裸鼠衰老模型，探討組方對裸鼠皮膚衰老的改善作用；另設(shè)計連續(xù)喂食14d亞急性毒性實驗，對組方進行安全性評價，為進一步開發(fā)抗皮膚衰老產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 中草藥組方：由0.07g/ml黃芪、0.05 g/ml玉竹，0.05g/ml生地黃、0.025g/ml玫瑰花、0.12g/ml水解膠原蛋白、2.4mg/ml透明質(zhì)酸鈉及1.2mg/ml彈性蛋白肽組成的棕色濃縮液，其總生藥含量為0.301g/ml；亞急性毒性實驗樣品生藥含量為1.2g/ ml，口服液2～8℃密封避光保存。彈性蛋白肽是以牛韌帶為原料，經(jīng)前處理、酶解、噴霧干燥等工藝制得，其蛋白質(zhì)含量≥90.0%，肽含量（以干基計）≥50.0%，其中相對分子量質(zhì)量小于5000Da的蛋白質(zhì)水解物所占比≥80.0%。

1.1.2 實驗動物和環(huán)境：SPF級BALB/c-nu裸鼠，雄性，21～34d日齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供；SPF級昆明小鼠，體重18～22g，由廣州中山大學(xué)實驗動物中心提供；動物飼料為SPF級鼠滅菌飼料，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。實驗環(huán)境為：溫度：20℃～25℃；濕度：40%～70%。

1.1.3 主要儀器和試劑：皮膚測試儀（型號：HKJ-SK03，HUNTKEY Company）、紫外線殺菌燈（型號：TUV36W，廣州市博勝光電技術(shù)有限公司）、酶標(biāo)儀（型號：ELX-800，美國BIOTEK）、勻漿機（型號：VCX 130PB，SONICS & MATERIALS INC）。皮膚Ⅲ型膠原蛋白試劑盒（批號：Q13137357）、透明質(zhì)酸ELISA試劑盒（批號：Q09137359）、羥脯氨酸ELISA試劑盒（批號：Q20137358）、D-半乳糖（批號：101622565，sigma-Aldrich）均購自武漢華美生物工程有限公司。彈性蛋白ELISA試劑盒（批號：201511）、膠原蛋白ELISA試劑盒（批號：201511）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 中草藥組方口服液功效實驗：裸鼠72只，隨機分為6組，每組12只，分別為空白對照組（給予等量蒸餾水）、模型組（給予等量蒸餾水）、樣品低劑量組（4.16ml/kg）、樣品中劑量組（8.33ml/kg）、樣品高劑量組（16.66ml/kg）、彈性蛋白肽陽性對照組（8.3mg/kg）。除空白組外，每組每日頸背部皮下注射5% D-半乳糖1000mg/kg，同時進行UV照射，波長為350～400nm，照射時間是40min/d，光源距鼠約40cm垂直高處；空白組每日頸背部皮下注射等體積的生理鹽水，正常光照飼養(yǎng)。持續(xù)造模40d，于造模第11d開始，每組按劑量灌胃給予相應(yīng)樣品或蒸餾水，連續(xù)喂食30d。

每日觀察裸鼠狀態(tài)，每周定期用皮膚水分測定儀測定皮膚含水量。實驗結(jié)束后，眼眶取血，分離血清用于檢測血清透明質(zhì)酸含量；處死裸鼠，取頸背部皮膚，除去皮下脂肪及其他結(jié)締組織，部分皮膚加入9倍質(zhì)量的預(yù)冷生理鹽水制成10%組織勻漿，取上清液測定皮膚中透明質(zhì)酸、膠原蛋白和彈性蛋白含量；部分皮膚放于80℃烘箱烘干24h，計算皮膚含水量=（干燥前質(zhì)量 - 干燥后質(zhì)量）/干燥前質(zhì)量 ×100%；剩余組織HE染色，進行組織病理學(xué)檢查。

1.2.2 中草藥組方口服液經(jīng)口亞急性毒性實驗：SPF級昆明小鼠40只，雌雄各半，隨機分成2組，每組20只，分為空白對照組及給藥組?？崭?5h后，灌胃給予0.4ml/10g口服液，喂食2h后供應(yīng)水和飼料，各組喂食后立即觀察動物的反應(yīng)情況，連續(xù)喂食14d。觀察內(nèi)容包括動物飲食、行為、分泌物、排泄物的變化，記錄動物的死亡情況、中毒癥狀及中毒反應(yīng)的起始時間、持續(xù)時間、嚴(yán)重程度等。分別于喂食前，喂食后2d、3d、5d、7d、14d稱量動物體重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 中草藥組方口服液功效實驗

2.1.1 一般狀態(tài)觀察：與空白對照組相比，模型組裸鼠隨造模時間延長而活動減少、食欲下降、皮膚皺褶增加，各給藥組與模型組比較癥狀均有所改善。

2.1.2 皮膚含水量：干燥法測定的皮膚含水量結(jié)果見表1，給藥30d后，與模型組相比，樣品中、高劑量組皮膚含水量顯著升高（P＜0.01）。水分測定儀測定結(jié)果見表2，與模型組相比，樣品高劑量組給藥三周后皮膚水分升高（P＜0.05），給藥四周后，樣品中、高劑量組皮膚水分升高（P＜0.05）。以上結(jié)果提示本中草藥組方口服液可能具有增加衰老裸鼠皮膚水分的功效。

2.1.3 血清及組織生化指標(biāo)含量：血清及皮膚中透明質(zhì)酸含量測定見表3，與空白對照組相比，模型組血清及皮膚組織中透明質(zhì)酸含量顯著降低（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，樣品中劑量組皮膚勻漿中透明質(zhì)酸的含量顯著提高（P＜0.05）；樣品高劑量組裸鼠血清和皮膚勻漿中的透明質(zhì)酸含量均有所提高（P＜0.05 or P＜0.01），以上結(jié)果提示本中草藥組方口服液具有增加衰老裸鼠血清及皮膚中透明質(zhì)酸的功效。皮膚中膠原蛋白和彈性蛋白含量的測定見表3，與空白組相比，模型組總膠原蛋白和彈性蛋白含量顯著降低；與模型組相比，樣品高劑量組能有效增加皮膚膠原蛋白和彈性蛋白的含量（P＜0.05），以上結(jié)果提示本中草藥組方口服液具有增加衰老裸鼠皮膚中膠原蛋白和彈性蛋白的功效，其作用效果與彈性蛋白肽相當(dāng)。

表1 各組裸鼠皮膚含水量測定結(jié)果 （xˉ±s，n=12）

2.1.4 組織病理學(xué)檢查：顯微鏡下觀察HE染色，結(jié)果見圖1，空白對照組的小鼠皮膚表皮層平整、角化層薄，真皮層無可見炎癥細(xì)胞；而模型組的小鼠皮膚損傷較嚴(yán)重，其表皮層褶皺多、凹凸不平，部分表皮層變薄并且角化嚴(yán)重，真皮層可見炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組對比，樣品中劑量組和高劑量組表皮層褶皺少，表皮層增厚而角化層變薄，真皮層炎癥細(xì)胞減少甚至無；另彈性蛋白肽組表皮層較平整，真皮層炎癥細(xì)胞少，但角化較嚴(yán)重；提示中、高劑量中草藥組方口服液具有緩解皮膚病理學(xué)損傷的功效。

2.2 中草藥組方口服液經(jīng)口亞急性毒性實驗：樣品組每天灌胃給予0.4ml/10g中草藥組方口服液，喂食后3h內(nèi)小鼠活動變少，部分小鼠有腹瀉現(xiàn)象，但未見其他異常；2d后，部分小鼠臀部的毛發(fā)有輕微脫毛現(xiàn)象；喂食2d、3d、5d、7d、14d后的體重略低于空白對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），空白對照組未見明顯異常，體重情況詳見表4。

表2 各組裸鼠皮膚水分測定結(jié)果 （%，xˉ±s，n=12）

表3 各組裸鼠生化指標(biāo)測定結(jié)果 （xˉ±s，n=12）

圖1 裸鼠皮膚HE染色病理切片（×400）

表4 小鼠體重隨喂食時間變化情況 （g，xˉ±s，n=20）

3 討論

皮膚衰老是由機體內(nèi)在因素和外在環(huán)境因素共同作用下導(dǎo)致的，隨著人們生活水平的提高，市場對于抗皮膚衰老相關(guān)產(chǎn)品的需求愈來愈迫切。目前抗皮膚衰老常見藥物有：維生素C、E、輔酶Q等；而皮膚提緊術(shù)、肉毒素注射、激光治療等也作為對抗皮膚衰老的手段[4]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和中藥藥理學(xué)研究的不斷深入，中草藥在抗皮膚衰老方面取得了很多突破性的進展，中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，皮膚衰老是機體臟腑衰老的外在表現(xiàn)，內(nèi)服中藥調(diào)理五臟功能，可達(dá)到延緩皮膚衰老的療效[5]。

本研究中的中草藥組方由黃芪、玉竹、玫瑰花、生地黃提取物聯(lián)合膠原蛋白、彈性蛋白肽、透明質(zhì)酸組成。有研究表明黃芪具有益陽補氣、托毒生肌、加快皮膚新陳代謝及延緩小鼠皮膚衰老的作用[6-7]；玉竹多糖可增強衰老模型小鼠的免疫功能，延緩小鼠衰老[8]；玫瑰花提取物能提高果蠅抗氧化系統(tǒng)自由基清除作用，降低體內(nèi)脂褐素水平，具有延緩衰老、延長壽命的作用[9]；生地黃塊根提取物具有較好的抗氧化活性，可清除氧自由基以防止機體衰老[10]。膠原蛋白口服可增強皮膚膠原活性[11]；彈性蛋白肽可增加皮膚中的彈性纖維含量，增加皮膚彈性[12]；口服透明質(zhì)酸可增加由真皮至表皮內(nèi)源透明質(zhì)酸的含量，使皮膚具有一定的韌性和彈性[13]。本實驗中經(jīng)中草藥組方口服液功效實驗證明，本組方口可顯著提高皮膚含水量，增加皮膚總膠原蛋白、彈性蛋白和透明質(zhì)酸的含量，對延緩皮膚衰老具有積極作用。亞急性經(jīng)口毒性實驗中，喂食后3h內(nèi)小鼠活動變少，部分小鼠有腹瀉現(xiàn)象；2d后，部分小鼠臀部的毛發(fā)有輕微脫毛現(xiàn)象；體重略低于空白對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異，無死亡發(fā)生，未見明顯毒性。綜上所述，本中草藥組方口服液具有一定改善皮膚衰老的功效，且口服安全。但本文對于該中草藥組方對抗裸鼠皮膚衰老的機理機制尚未深入研究，需進一步完善。

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Experimental Research on Anti-Aging Effect and Acute Toxicity of a Compound Oral Liquid

XIE Xiao-hui1,ZHU Yao1,DOU Zhi-yan1,CHEN Jian-wen1,XU Ju-cai2
(1.School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510006,Guangdong,China; 2.School of Light Industry and Food,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

traditional Chinese medicine; resist skin aging; photoaging; D-galactose

R339.3+8

A

1008-6455（2017）05-0035-04

2016-12-10

2017-04-29

編輯/張惠娟

陳健文，男，高級工程師，主要從事藥品及保健食品的開發(fā)與評價；通信地址：廣東省廣州大學(xué)城外環(huán)東路132號中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室；E-mail：573016880@qq.com

謝曉輝，男，在讀研究生，主要從事藥品及保健食品評價

Abstract: Objective To study the cosmetic eff i cacy and toxicological safety of a Chinese herbal compound oral liquid. Methods D-galactose combined with ultraviolet light to induced skin aging model to evaluate the effect of the prescription on skin aging; The mice were fed with 14 d for subacute oral toxicity test to evaluate the safety of sample liquid. Results The middle and high dosage of the Chinese herbal compound oral liquid can effectively increase the content of hyaluronic acid in the skin, increase the skin water content, increase the content of collagen and elastin in the skin, and protect the skin morphology. The diarrhea and weight loss were observed, but no obvious toxicity and death. Conclusion The Chinese herbal formula oral liquid can improve the water retention capacity of skin, enhance skin elasticity, reduce skin wrinkles, delay skin aging, no obvious acute toxicity.