可注射間充質(zhì)干細胞膜片修復兔顱骨極限缺損的實驗研究

張 蓉，高 瞻，倪前偉，王榮耀

?基礎研究?

可注射間充質(zhì)干細胞膜片修復兔顱骨極限缺損的實驗研究

張 蓉，高 瞻，倪前偉，王榮耀

（新疆軍區(qū)總醫(yī)院頜面外科 新疆 烏魯木齊 830000）

目的：評價使用可注射骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow stromal cells，MSCs）膜片修復兔顱骨極限缺損的成骨能力。方法：將體外分離培養(yǎng)擴增的兔MSCs，使用成骨誘導培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)2周, 形成細胞膜片。采用16只大白兔構(gòu)建兔顱骨極限缺損模型，隨機分為兩組，每組8只。實驗組，顱骨缺損處注射MSCs膜片；對照組，顱骨缺損處不植入任何材料，分別于術后8周和l2周取材，通過大體觀察、X線攝片及組織學檢查分析其修復顱骨缺損的效果。結(jié)果：體外構(gòu)建的MSCs膜片為細胞-細胞外基質(zhì)聚合體，茜素紅染色見膜片中細胞外基質(zhì)內(nèi)有鈣化結(jié)節(jié)沉積，掃描電鏡可見膜片內(nèi)豐富的膠原纖維和礦化結(jié)節(jié)聚集。細胞膜片植入兔顱骨缺損，8周時形成組織工程骨，12周時缺損得到完全的骨修復，而對照組僅見纖維組織形成。結(jié)論：成骨性MSCs膜片具有良好的骨修復能力。

骨組織工程；間充質(zhì)干細胞；細胞膜片技術；顱骨極限缺損

由于創(chuàng)傷、炎癥和腫瘤等因素所致的骨缺損是引發(fā)肢體功能喪失的主要原因。盡管自體骨移植是治療局部骨缺損的金標準，但是該方法由于取骨部位和數(shù)量的限制難以應用于較大的骨缺損。異體和異種骨移植，愈合過程漫長且存在不同程度的免疫排斥反應。隨著組織工程學的崛起和不斷發(fā)展，有望為骨修復與重建開辟新的途徑。但研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的“細胞－支架材料”策略，存在一些缺陷，如接種細胞大量流失、接種效率有限；細胞主要黏附于材料的表面而呈“漁網(wǎng)樣”分布不均；常用的蛋白酶消化收集細胞，易改變細胞的表型和生化成分，也常常破壞細胞外基質(zhì)和細胞間連接蛋白[1]。此外，現(xiàn)有的支架材料也不能完全滿足構(gòu)建組織的需要，存在潛在的免疫源性、生物活性不足，還可能由于不完全降解而形成纖維組織等問題[2-3]。

近年來出現(xiàn)的細胞膜片技術，提供了一種新的組織再生方法。它采用物理方法收獲完整的膜片狀形式的細胞-細胞外基質(zhì)聚集體，轉(zhuǎn)運或是粘附于材料表面，成為一個良好的骨構(gòu)建單位。利用此技術已成功構(gòu)建出骨、心肌、角膜、食管上皮等組織[4-6]。本實驗，旨在探討單純MSCs膜片的正位成骨能力，實驗將細胞膜片直接注射入兔顱骨極限缺損內(nèi)，術后8周和l2周取材，通過大體觀察、X線及組織學檢查分析其骨修復效果。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：3月齡清潔級新西蘭大白兔16只，體重2.5～3.0kg，由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院實驗動物中心提供，雌雄不限。隨機分為兩組，實驗組和對照組，每組8只。

1.2 主要試劑和儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)，0.25%胰蛋白酶(Sigma，美國)，PBS(Sigma，美國)，胎牛血清(杭州四季青生物公司，中國)，地塞米松(Sigma，美國)，β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)，L-抗壞血酸(Sigma，美國)；超凈工作臺（海爾公司，中國），CO2細胞培養(yǎng)箱（BINDER公司，德國），S-3400N掃描電鏡 (Hitachi,日本)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympas,日本)。

1.3 MSCs分離培養(yǎng)和細胞膜片的體外構(gòu)建：據(jù)文獻報道[7]的實驗方法分離培養(yǎng)兔MSCs。將第2代MSCs按密度1×106/cm2接種至直徑10cm的培養(yǎng)皿，使用成骨誘導培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸鈉10mM、抗壞血酸50mg/L的DMEM/F12培養(yǎng)液)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)，隔日半量換液1次。2周后皿底形成半透明乳白色薄膜，可使用組織鑷將膜片提起，用眼科組織剪切碎成小片段，懸浮至0.5ml無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中備用。

1.4 膜片中細胞DNA含量測定：采用熒光比色分析測定DNA含量以代表膜片中的細胞總數(shù)。取細胞膜片以PBS液沖洗兩次，加入10mM的乙二胺四乙酸2ml，超聲裂解10min，再加入1M的磷酸二氫鉀溶液0.3ml中。然后取上清液或小牛胸腺DNA標準液加入100ng/ml的Hoechst 33258熒光染料1.5ml和10mM的Tris緩沖液。使用DyNA Quant 200 熒光比色分析儀檢測樣品吸光度，再繪制熒光值與DNA含量標準曲線，最后計算樣品的DNA含量。根據(jù)接種前單細胞懸液DNA含量與計數(shù)板計算所知細胞數(shù)量的比值關系，得出每個細胞的DNA含量(7.2pg DNA/cell)，從而計算出膜片的細胞總數(shù)。

1.5 MSCs膜片性能檢測：定量檢測ALP活性，PBS漂洗后加入0.2%TritonX-100裂解液，離心后取上清液與磷酸硝基苯基磷酸鹽在37℃條件下反應30min，以酶聯(lián)檢測儀測定光吸收值以定量檢測ALP活性。此外取部分膜片樣本以4%多聚甲醛固定行茜素紅染色，部分樣本以3%戊二醛固定，行掃描電鏡觀察其超微形貌。

1.6 兔顱骨極限缺損模型的建立：16只新西蘭兔以速眠新（0.2ml/kg）肌肉麻醉，用8%硫化鈉頭頂部脫毛、固定、消毒和鋪巾；于頭頂部向后做舌形切口，切開皮膚、皮下至骨膜，翻起組織瓣顯露額骨和頂骨，制備直徑為15mm的顱骨全層缺損區(qū)（圖1A）；生理鹽水沖洗，對位縫合創(chuàng)口；術后動物分籠飼養(yǎng)，每日給予慶大霉素8萬單位肌注，連續(xù)3d，預防感染。

1.7 體內(nèi)移植：術后第4天，實驗組將MSCs膜片片段通過18G 針頭注射入顱骨缺損處（圖1B）；對照組顱骨缺損處不植入任何材料。

1.8 檢測方法

1.8.1 大體觀察：分別于術后8周及12周取材，每個時間點各取4只動物，大體觀察缺損處成骨情況。

圖1 顱骨缺損模型

1.8.2 X線攝片：觀察骨缺損區(qū)阻射情況，拍片條件為電壓50V，電流100MA，曝光時間0.05s。

1.8.3 組織學分析：樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定，10% EDTA脫鈣、脫水、石蠟包埋，切片行H&E染色光鏡下行組織形態(tài)學定性分析。每組每例樣本選取3張H&E切片，每張切片低倍鏡下隨機選擇3個視野，由兩人分別獨立采用Leicas Qwin Pro-image圖像分析系統(tǒng)(Wetzlar, 德國)觀察，分析新生骨組織的面積百分比(新生骨面積/切片組織染色區(qū)橫斷面積)。

2 結(jié)果

2.1 MSCs膜片特性檢測結(jié)果：MSCs高密度接種體外連續(xù)培養(yǎng)2周，形成半透明乳白色膜片，可用眼科鑷將其完整夾持起來（圖2A）；顯微鏡下觀察膜片中細胞呈多層生長（圖2B），茜素紅染色見細胞外基質(zhì)中沉積有多個大小不等的紅色鈣結(jié)節(jié)（圖2C）；SEM下觀察到膜片中紡錘樣細胞（圖3A），同時可見豐富的基質(zhì)纖維和礦化結(jié)節(jié)聚集（圖3B）；ALP定量檢測結(jié)果顯示，膜片片段的ALP含量略高于相同數(shù)目的單細胞。

圖2 細胞膜片特性

圖3 膜片SEM分析結(jié)果

2.2 MSCs膜片DNA含量檢測結(jié)果：DNA含量在細胞接種后的第1～2天變化不明顯；第3天開始迅速增加，至第12～14天趨于穩(wěn)定，MSCs膜片中細胞DNA含量隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸增加，見表1。

表1 細胞DNA含量檢測結(jié)果 (xˉ±s)

2.3 標本大體觀察結(jié)果：兩組動物均成活。術后8周，實驗組骨缺損區(qū)有部分硬組織形成，厚度不均，邊界清楚，與周邊骨質(zhì)可見部分融合，但鉗夾新生骨硬度明顯低于周邊骨質(zhì)(圖4A)；術后12周，實驗組骨缺損區(qū)充填硬組織明顯增多，植入物邊緣與周邊骨質(zhì)有明顯的骨融合，鉗夾硬度亦增加,與周邊骨質(zhì)相近（圖4B）。對照組在術后8周及12周，骨缺損區(qū)均為軟組織充填，與周邊顱骨界限清楚（圖4C）。

圖4 標本大體觀察

2.4 X線攝片檢測結(jié)果：術后8周，實驗組骨缺損區(qū)內(nèi)可見塊狀阻射影像，密度不均勻，且低于周圍骨質(zhì)，鄰近骨床有明顯環(huán)形透光影(圖5A)；術后12周，實驗組骨缺損區(qū)阻射影像面積增加，基本占據(jù)全部缺損區(qū)，與周邊顱骨密度接近(圖5B)；而對照組在術后8周及12周，骨缺損區(qū)均顯示為明顯的透光區(qū)，基本沒有阻射影像(圖5C)。

圖5 X線攝片觀察結(jié)果

2.5 組織學分析結(jié)果：標本HE染色及改良麗春紅三色染色觀察：術后8周實驗組骨缺損區(qū)內(nèi)有大量的組織工程骨形成，可觀察到成行密集排列在骨小梁周圍的成骨細胞，包埋于骨基質(zhì)內(nèi)的骨細胞，以及大量肥大透明軟骨細胞（圖6A、7A）；術后12周，缺損區(qū)內(nèi)軟骨組織進一步骨化，交織成網(wǎng)狀的成熟骨小梁，并可見散在的滋養(yǎng)血管，形成骨髓腔結(jié)構(gòu)（圖6B、7B）。組織定量學分析：術后8周新生骨所占面積為31.7%；術后12周新生骨面積為58.6%?？瞻讓φ战M8周和12周均僅見纖維組織，未見明顯新骨形成(圖6C～D、7C～D)。

3 討論

圖6 組織學HE染色檢查結(jié)果

本研究證實了單純利用骨髓間充質(zhì)細胞膜片修復自體顱骨缺損的可行性，以骨髓間充質(zhì)成骨細胞膜片技術構(gòu)建的組織工程骨有望成為骨缺損修復的途徑之一。與傳統(tǒng)的組織工程骨修復骨缺損方法相比，具有以下優(yōu)點：①采用全新的組織工程骨構(gòu)建方法，未運用外源性支架材料，避免了其伴隨的一些問題；②所構(gòu)建膜片完全來源于自體干細胞，不會引起宿主的排斥。

細胞膜片技術最早由日本學者Okano等[8]發(fā)明，利用細胞對溫敏性聚合物的親和性獲得細胞－細胞外基質(zhì)聚集體，無需使用蛋白酶消化。2007年Zhou等[9]報道了更簡便的細胞膜片制取方法，無需特殊材料或設備，細胞膜片形成后用細胞刮刀沿培養(yǎng)皿底刮取即可獲得。目前細胞膜片技術在骨組織構(gòu)建中也有諸多應用，但大多需要與支架材料相結(jié)合。Zhou等[9]將細胞膜片與磷酸三鈣和聚已酸內(nèi)酯復合材料復合，構(gòu)建出組織工程骨。Ueha等[10]利用磷酸三鈣作為支架材料，分別與骨髓間充質(zhì)干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞膜片復合培養(yǎng)，并用于兔股骨缺損治療，結(jié)果表明磷酸三鈣/骨髓間充質(zhì)干細胞膜片復合物成骨能力更強，并能完全修復股骨缺損。Ma等[11]將成骨分化的MSCs膜片折疊成圓柱狀，靜置孵育后移植至裸鼠背部皮下，構(gòu)建出具有一定體積和特定形態(tài)的組織工程骨。研究結(jié)果雖然證實了細胞膜片的異位成骨能力，說明單純使用成骨性干細胞膜片也可構(gòu)建出組織工程骨，但不能代表構(gòu)建組織具有修復骨缺損能力。

骨極限缺損，指在特定的骨骼上所造成的不能自行修復并愈合的最小缺損，顱骨極限缺損模型已被廣泛應用于骨組織再生檢測試驗中。根據(jù)國內(nèi)外文獻報道可知應用細胞膜片修復骨缺損的實驗，大多采用復合支架材料的方式。黃輝等[12]報道將細胞膜片包裹圓形珊瑚支架，用于修復兔顱骨極限缺損，以自體骨和單純珊瑚植入作為對照，結(jié)果顯示細胞膜片/珊瑚組在16周時得到明顯骨修復。閆旭等[13]報道將MSCs膜片結(jié)合凍存自體骨瓣回植于原顱骨缺損部位，對照組單純植入凍存自體骨瓣，結(jié)果表明MSCs膜片能有效促進凍存自體骨瓣與骨缺損邊緣的愈合。盡管已有眾多材料被應用于構(gòu)建組織工程骨，但仍未發(fā)現(xiàn)一種理想的材料。因而我們試圖不使用外源性支架材料，從而避免可能引起的炎癥反應、潛在的免疫原性、不完全降解而形成纖維組織等問題。

本研究中，MSCs連續(xù)培養(yǎng)后呈多層生長，不斷分泌豐富的細胞外基質(zhì)，細胞間連接為完整的膜片狀結(jié)構(gòu)，不必借助特殊的材料或設備，可通過簡捷的操作收獲。膜片中細胞完全包埋于基質(zhì)內(nèi)，體外培養(yǎng)的細胞幾乎全部用于組織構(gòu)建，細胞利用率高；采用物理方法收集體外擴增的多層生長的細胞，保留了自分泌的細胞外基質(zhì)、細胞間連接和細胞表面蛋白等；組織學及掃描電鏡檢查結(jié)果顯示，膜片由細胞及細胞外基質(zhì)組成，基質(zhì)中沉積豐富的礦化結(jié)節(jié),具備成骨特性；X線片證實，細胞膜片植入體內(nèi)12周后形成組織工程骨修復骨缺損，密度與周邊正常顱骨接近；組織學檢查發(fā)現(xiàn)，新生組織中有骨和軟骨兩種組織形成，表明膜片在體內(nèi)成骨的過程中，既有膜內(nèi)成骨，又有軟骨內(nèi)成骨。這一結(jié)果與采用細胞膜片與支架材料復合構(gòu)建組織工程骨的報道相一致[14-15]。

本研究還存在一些不足，由于實驗的目的在于驗證單純利用骨髓基質(zhì)細胞膜片修復自體骨缺損的可行性，其修復效果未與自體骨移植相比較。此外，細胞膜片機械性能略差，如修復負重部位的骨缺損還需與固定裝置聯(lián)合應用。

[1]Ishijima M,Hirota M,Park W,et al.Osteogenic cell sheets reinforced with photofunctionalized micro-thin titanium[J].J Biomater Appl,2015,29(10):1372-1384.

[2]Bardag-Gorce F,Oliva J,Wood A,et al.Carrier-free cultured autologous oral mucosa epithelial cell sheet(CAOMECS) for corneal epithelium reconstruction:a histological study[J].Ocul Surf,2015,13(2):150-163.

[3]Zheng R,Duan H,Xue J,et al.The influence of Gelatin/PCL ratio and 3-D construct shape of electrospun membranes on cartilage regeneration[J].Biomaterials,2014,35(1):152-164.

[4]Takeuchi R,Kuruma Y,Sekine H,et al.In vivo vascularization of cell sheets provided better long–term tissue survival than injection of cell suspension[J].J Tissue Eng Regen Med,2016,10(8):700-710.

[5]Matsuura K,Utoh R,Nagase K,et al.Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine[J].J Control Release,2014,190:228-239.

[6]Hoffmann W,Bormann T,Rossi A,et al.Rapid prototyped porous nickel-titanium scaffolds as bone substitutes[J].J Tissue Eng,2014,5(5):1-14.

[7]徐海春,王偉,徐曉東.利用骨髓間充質(zhì)干細胞膜片原位構(gòu)建“三明治”樣組織工程牙周膜的實驗研究[J].中國醫(yī)療美容,2016,6(7):78-81.

[8]Okano T,Yamada N,Sakai H,et al.A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide)[J].J Biomed Mater Res,1993,27(10):1243-1251.

[9]Zhou Y,Chen F,Ho ST,et al.Combined marrow stromal cell-sheet techniques and high-strength biodegradable composite scaffolds for engineered functional bone grafts[J].Biomaterials, 2007,28(5):814-824.

[10]Ueha T,Akahane M,Shimizu T,et al.Utility of tricalcium phosphate and osteogenic matrix cell sheet constructs for bone defect reconstruction[J].World J Stem Cells,2015,7(5):873-882.

[11]Ma D,Ren L,Liu Y,et al.Engineering scaffold-free bone tissue using bone marrow strom cell sheets[J].J Orthop Res,2010,28(5):697-702.

[12]黃輝,張森林,劉向輝,等.細胞－膜片復合珊瑚支架修復兔顱骨極限缺損的實驗研究[J].口腔頜面外科雜志,2011,21(4):256-260.

[13]閆旭,明磊國,羅鵬,等.骨髓間充質(zhì)干細胞膜片結(jié)合凍存自體骨瓣修復兔顱骨極限缺損[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2014,13(5):438-702.

[14]汪經(jīng)緯,張愛君,陶常波,等.人脂肪干細胞膜片修復裸鼠顱骨缺損研究[J].徐州醫(yī)學院學,2015,35(11):769-772.

[15]馬東洋,任利玲,毛天球.細胞膜片技術在組織工程和再生醫(yī)學領域的應用.生物醫(yī)學工程學雜志,2014,31(5):1164-1167.

編輯/張惠娟

Repair of Critical Bone Defects with Injectable Mesenchymal Stem Cells Sheets

ZHANG Rong,GAO Zhan,NI Qian-wei,WANG Rong-yao (Department of Oral and Maxillofacial Surgery,General Hospital of Xinjiang Military Command,Urumqi 830000,Xinjiang,China)

Objective The ability of cell sheet from MSCs to heal critical-size rabbit calvarial defect was evaluated. Methods We harvested MSCs sheets using a continuous culture method. Histological examination and scanning electron microscopy were performed to evaluate the osteogenic sheets. The cell sheet was then implanted into a 15mm diameter rabbit calvarial defect. The new bone formation inside the defect was investigated by radiographic, histological, and histomorphometric analyses in 8 and 12 week after operation respectively. Results The cell sheets showed evident mineralized nodules, indicating their in vitro osteogenic potential. Radiographic, histological and histomorphometric analyses revealed that the defect treated with cell sheet showed signif i cant bone formation. Conclusion The cell sheet can enhance bone regeneration in healing critical-size rabbit calvarial defect.

bone tissue engineering;mesenchymal stem cells;cell sheet;critical-size calvarial defect

R813

A

1008-6455（2017）05-0023-04

2017-01-18

2017-04-26