響應(yīng)面法優(yōu)化金柚核中類檸檬苦素的提取工藝

張聲源，鄒浩元，楊宇輝，周銘，陳一村，羅鋁鏗，李春泉，聶華，*

（1.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東梅州514031；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭515041；3.廣東匯群中藥飲片股份有限公司，廣東汕頭515041）

響應(yīng)面法優(yōu)化金柚核中類檸檬苦素的提取工藝

張聲源1，鄒浩元1，楊宇輝1，周銘1，陳一村2，羅鋁鏗1，李春泉3，聶華1，*

（1.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東梅州514031；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭515041；3.廣東匯群中藥飲片股份有限公司，廣東汕頭515041）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇超聲時間、超聲溫度和料液比為自變量，柚核中檸檬苦素類物質(zhì)的提取率為響應(yīng)值，進行Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計，運用響應(yīng)面分析法優(yōu)化梅州金柚核檸檬苦素類物質(zhì)的提取工藝。結(jié)果表明，梅州金柚核檸檬苦素類物質(zhì)超聲提取最佳工藝為提取溫度50℃，料液比1∶20（g/mL），超聲時間20 min。此工藝下檸檬苦素類物質(zhì)提取率為0.491mg/g（RSD=1.13%，n=3），與理論值0.487mg/g偏差很小。

柚核；超聲波輔助提??；檸檬苦素；響應(yīng)面法

梅州金柚為蕓香科柑橘屬植物柚[Citrus grandis（L.）Osbeck]的果實，其營養(yǎng)價值豐富、便于儲藏，有“天然水果罐頭”之稱，同時作為藥用具有止咳平喘、清熱化痰、健脾消食、解酒除煩等功效[1-2]。柚核為柚成熟果實的核（種子），據(jù)《嶺南采藥錄》記載，柚核性平、溫，味苦，歸肝經(jīng)，具有疏肝理氣、宣肺止咳的功效，臨床上可治療疝氣、肺寒咳嗽、呃逆等病癥[3]。檸檬苦素類物質(zhì)是一類三萜類化合物，主要存在于柑橘類果實中。研究發(fā)現(xiàn)，在柚果不同藥用部位中，檸檬苦素類物質(zhì)主要存在于柚核中，為柚核主要活性成分，同時也是引起柚果果汁苦味的主要原因之一[4-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，檸檬苦素類物質(zhì)具有顯著的抗癌、抗氧化、抗菌、鎮(zhèn)痛等生理活性，其提取工藝及功能活性產(chǎn)品的研制與應(yīng)用已引起了醫(yī)學(xué)界和食品界的廣泛關(guān)注[5-9]。

梅州是我國最大的金柚種植生產(chǎn)基地，1995年被國家首批百家中國特產(chǎn)之鄉(xiāng)組委會命名為“金柚之鄉(xiāng)”，2006年梅州金柚通過國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護認(rèn)證，2016年梅州金柚地理標(biāo)志證明商標(biāo)獲國家工商總局商標(biāo)局正式注冊，是廣東“十件寶”之一。據(jù)報道，目前梅州市柚果種植面積已超過53萬畝，產(chǎn)量超過70.3萬t，是全世界最大的金柚商品生產(chǎn)基地[10-11]。梅州金柚因其品質(zhì)獨特，其鮮果及其加工品遠(yuǎn)銷國內(nèi)外，而作為金柚產(chǎn)品加工過程的副產(chǎn)物柚核來源豐富、價格低廉，可作為提取生理活性物質(zhì)或藥品、食品開發(fā)的原料，進行多級加工和深度加工，提高金柚綜合利用力度。然而，針對梅州金柚這一豐富、優(yōu)良的地方特色資源的研究多集中于栽培技術(shù)、成分分析、產(chǎn)品開發(fā)等方面[12-14]，對柚核中檸檬苦素類物質(zhì)的提取工藝研究鮮見報道。本研究以梅州金柚柚核為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化梅州金柚核中檸檬苦素類物質(zhì)的超聲提取條件，以期為梅州金柚核中檸檬苦素類物質(zhì)的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅州金柚：采摘自廣東省梅州市陰那山自然保護區(qū)梅州金柚種植基地；檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品（批號MB5042，純度＞98%）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、濃硫酸、二氯甲烷、香草醛等試劑均為分析純。

UV-1800型紫外-可見分光光度計：日本島津公司；JP-100S型超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；BT125D型電子分析天平、BS110s型電子分析天平：德國Sartorius公司；N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會社；WJX-A1000型高速多功能粉碎機：浙江省永康市紅太陽機電有限公司；DHG-9123A型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

將干燥的柚核粉碎后過20目篩，加10倍量石油醚于50℃回流3次，每次60 min，脫脂后經(jīng)烘箱45℃干燥至恒重，得脫脂柚核粉末，保存于干燥器中（常溫）備用。

1.2.2 檸檬苦素類物質(zhì)的含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的檸檬苦素對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加二氯甲烷溶解并定容至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.2.2.2 供試品溶液制備

精密稱取脫脂柚核粉10.0 g置于200 mL具塞錐形瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇適量，按設(shè)定的功率、溫度、時間進行超聲提取，提取液經(jīng)抽濾、濃縮后，吸取二氯甲烷溶解、過濾并定容于25 mL容量瓶中，即得。

1.2.2.3 顯色劑配制

參照文獻[15]方法，準(zhǔn)確稱取2.0 g香草醛，用無水乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中。使用時往10 mL香草醛乙醇溶液（0.02 mg/mL）中加入15 mL濃硫酸，振蕩混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2.4 顯色方法

吸取樣品溶液1.4 mL于試管中，加入1.0 mL顯色劑，振蕩混勻，迅速振蕩10 s，加入2.5 mL甲醇溶液，混勻顯色，靜置10 min。

1.2.2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取檸檬苦素對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，得質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10（mg/mL）的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2.4中方法顯色后，于547 nm波長處測定吸光度[15]，以吸光度為縱坐標(biāo)，檸檬苦素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.6 檸檬苦素類物質(zhì)提取得率的計算

準(zhǔn)確吸取樣品溶液適量，按照檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算質(zhì)量濃度（C），再根據(jù)質(zhì)量濃度計算出柚核中檸檬苦素類物質(zhì)的提取得率（mg/g），計算公式如下：

式中：T為檸檬苦素化合物提取率，mg/g；C為提取液中檸檬苦素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品溶液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2.7 單因素試驗考察

考察超聲時間、提取溫度、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比5個因素對檸檬苦素類物質(zhì)提取含量的影響。各組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.2.8 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定3個因素的3個水平，以檸檬苦素類物質(zhì)提取率為評價指標(biāo)，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗的中心組合設(shè)計，見表1。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計的因素和水平表Table 1Factors and levels of Box-Behnken central composite design

自變量因素編碼及水平見表1，-1、0、1分別代表各因素的低、中、高3個水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件進行方差顯著性檢驗；采用Design Expert 8.0對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析；采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard curve of limonin

由圖1可看出，檸檬苦素含量（X）與吸光度（Y）呈線性關(guān)系。其回歸方程為Y=7.563X+0.024（R2=0.999 9），線性范圍0.020 mg/mL～0.100 mg/mL。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲時間

準(zhǔn)確稱取4份脫脂柚核粉末，每份10.0 g，固定超聲溫度30℃，料液比1∶10（g/mL），超聲波功率300 W和乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取次數(shù)為1次，提取時間選擇10、20、30、40 min。各提取液依次按1.2.2.2項方法處理，1.2.2.4項方法顯色和1.2.2.5項方法測定吸光度，計算檸檬苦素類物質(zhì)提取率，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。不同超聲時間下檸檬苦素類物質(zhì)提取率分別為（0.27±0.02）%、（0.41±0.02）%、（0.24±0.02）%和（0.21±0.02）%，故選擇超聲時間為10 min～30 min。

2.2.2 提取溫度

準(zhǔn)確稱取4份脫脂柚核粉末，每份10.0 g，固定料液比1∶10（g/mL），超聲波功率300 W，提取時間30 min和乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取次數(shù)1次，提取溫度選擇30、40、50、60℃。各提取液依次按1.2.2.2項方法處理，1.2.2.4項方法顯色和1.2.2.5項方法測定吸光度，計算檸檬苦素類物質(zhì)提取率，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。不同提取溫度下檸檬苦素類物質(zhì)提取率分別為（0.23±0.02）%、（0.41±0.02）%、（0.42±0.01）%和（0.17±0.02）%，故選擇提取溫度為35℃～50℃。

2.2.3 料液比

準(zhǔn)確稱取4份脫脂柚核粉末，每份10.0 g，固定超聲溫度30℃，超聲波功率300 W，提取時間30 min和乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取次數(shù)為1次，料液比選擇1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）。各提取液依次按1.2.2.2項方法處理，1.2.2.4項方法顯色和1.2.2.5項方法測定吸光度，計算檸檬苦素類物質(zhì)提取率，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。不同料液比下檸檬苦素類物質(zhì)提取率分別為（0.13±0.01）%、（0.44±0.02）%、（0.45±0.02）%和（0.43±0.01）%，故選擇料液比為1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)

準(zhǔn)確稱取5份脫脂柚核粉末，每份10.0 g，固定超聲溫度30℃，料液比1∶10（g/mL），超聲波功率300 W和提取時間30 min，提取數(shù)1次，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%。各提取液依次按1.2.2.2項方法處理，1.2.2.4項方法顯色和1.2.2.5項方法測定吸光度，計算檸檬苦素類物質(zhì)提取率，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下檸檬苦素類物質(zhì)提取率分別為（0.07±0.01）%、（0.12±0.01）%、（0.35±0.01）%、（0.41±0.02）%和（0.42±0.02）%。試驗結(jié)果顯示乙醇體積分?jǐn)?shù)＞60%時，提取率趨于平緩，對檸檬苦素類物質(zhì)的提取率影響小，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.5 提取次數(shù)

精密稱取4份脫脂柚核粉末，每份10.0 g，固定超聲溫度30℃、料液比1∶10（g/mL），超聲波功率200W、提取時間30 min和乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次。各提取液依次按1.2.2.2項方法處理，1.2.2.4項方法顯色和1.2.2.5項方法測定吸光度，計算檸檬苦素類物質(zhì)提取率，試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。不同提取次數(shù)下檸檬苦素類物質(zhì)提取率分別為（0.37±0.01）%、（0.41±0.01）%、（0.41±0.01）%和（0.42±0.01）%，結(jié)果顯示提取數(shù)＞2次時，提取率增大趨于平緩，提示提取次數(shù)對提取率的影響小，故確定提取數(shù)2次。

2.3 響應(yīng)面分析試驗

根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理，綜合單因素試驗考察結(jié)果，選取液料比、提取溫度、超聲時間為自變量，以原料中檸檬苦素得率為響應(yīng)值，稱取脫脂柚核粉末10.0 g，共17份，設(shè)計三因素三水平共17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，其中12個析因試驗，5個中心試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2中試驗數(shù)據(jù)采用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 8.0進行方差分析和響應(yīng)面3D圖和等高線圖繪制。因子經(jīng)過回歸擬合，得到回歸方程：Y=0.474 8+0.005 6A+0.006 425B+0.009 225C-0.004 4AB-0.001 55AC+0.004 75BC-0.003 3A2-0.003 1B2-0.004 95C2。方差分析見表3。

表2 金柚柚核中檸檬苦素類物質(zhì)提取工藝響應(yīng)面試驗安排Table 2Responsive surface test analysis of extraction process of limonins from Pomelo seeds

由方差分析可知，回歸方程模型高度顯著，決定系數(shù)R2=96.80%，說明響應(yīng)值的變化有96.80%來源于所選自變量；模型的變異系數(shù)0.594 7%，說明該模型精密度良好；失擬項不顯著，說明回歸方程在整個回歸區(qū)域的擬合情況良好，可用該回歸模型代替試驗真實點對結(jié)果進行分析。各因素中一次項A、B、C對響應(yīng)值的影響高度顯著（P＜0.01），依次為：C＞B＞A，說明試驗中各參試因子對得率的影響均達(dá)到極顯著水平；二次項AB、BC、A2、C2對響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05），依次為：C2＞BC＞AB＞A2，說明A與B、B與C之間存在顯著的交互效應(yīng)。

圖2直觀的給出了各因系交互作用的3D圖和等高線圖。

從響應(yīng)面3D圖的最高點和等高線圖可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點，同時也是等高線圖中最小橢圓的中心點。此外，根據(jù)3D圖和等高線圖可以看出，固定其他條件不變，超聲時間對檸檬苦素類物質(zhì)提取率影響呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，而隨著料液比和提取溫度的增大，檸檬苦素類物質(zhì)提取率逐漸增大，并逼進極值，這與單因素考察的結(jié)果基本吻合。

表3 檸檬苦素類物質(zhì)提取率方差分析Table 3Variance analysis on extraction yield of limonins

2.4 驗證試驗

通過響應(yīng)面分析軟件得到回歸模型預(yù)測的檸檬苦素最優(yōu)提取工藝條件為提取溫度49.92℃，料液比1∶19.92（g/mL），超聲時間19.98 min，在該條件下響應(yīng)面模型預(yù)測的檸檬苦素提取率為0.487%。為使實際操作更方便，最終確定檸檬苦素最優(yōu)提取工藝條件為50℃，料液比1∶20（g/mL），超聲時間20 min。為驗證試驗的可靠性，采用上述最優(yōu)提取工藝條件提取檸檬苦素。稱取脫脂后柚核粉末3份，每份10.0 g，按預(yù)測的最優(yōu)工藝條件進行驗證試驗，各提取液依次按1.2.2.2項方法處理，1.2.2.4項方法顯色和1.2.2.5項方法測定吸光度，計算檸檬苦素平均提取率為0.491%，RSD為1.13%，與理論值偏差很小，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)選檸檬苦素類物質(zhì)的提取條件具有可行性。

圖2 各試驗因素對檸檬苦素類物質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2Responsive surface and contour of Effects of each factor on extraction yield of limonins

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化梅州金柚柚核中檸檬苦素類物質(zhì)的超聲輔助提取條件，結(jié)果表明，提取溫度，料液比和超聲時間對檸檬苦素類物質(zhì)提取率影響顯著。檸檬苦素類物質(zhì)提取率響應(yīng)方程的方差分析和驗證試驗表明此方法合理可行，得到柚核中檸檬苦素類物質(zhì)提取最佳條件為：以脫脂柚核粉為原料，用提取溫度50℃，料液比1∶20（g/mL），超聲時間20 min。在此條件下檸檬苦素類物質(zhì)的提取率為0.491%（RSD=1.13%，n=3），與理論預(yù)測值0.487%偏差很小。本研究得到的提取工藝操作簡便，提取條件溫和，環(huán)保經(jīng)濟，可為柚核中提取檸檬苦素類物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗參考，同時對梅州金柚柚核的進一步開發(fā)利用具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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Optimization of Extraction Process for Limonins from Gold Pomelo Seeds by Response Surface Methodology

ZHANG Sheng-Yuan1，ZOU Hao-yuan1，YANG Yu-hui1，ZHOU Ming1，CHEN Yi-cun2，LUO Lü-keng1，LI Chun-quan3，NIE Hua1，*
（1.Medical College，Jiaying University，Meizhou 514031，Guangdong，China；2.Medical College，Shantou University，Shantou 515041，Guangdong，China；3.Traditional Chinese Medicine Company of Huiqun，Shantou 515041，Guangdong，China）

Based on the experiment of single factor，ultrasonic time，ultrasonic temperature，and solid-liquid ratio were selected to design Box-Behnken central composite.The optimum extraction conditions confirmed by the response surface methodology.Optimum extraction conditions were as follows：extraction time of 20 min，solid/liquid ratio of 1∶20（g/mL）and temperature of 50℃.Under these conditions，yield of total limonins was 0.491（mg/g）（RSD=1.13%，n=3），whose deviation was small by comparing with the theoretical value of 0.487（mg/g）.

pomelo seeds；ultrasound-assisted extraction；limonin；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.015

2016-08-03

廣東省科技計劃項目（2014A020221061，2015A090905019）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目（A2015629，A2015354）；梅州市產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)資金計劃項目（201411）

張聲源（1983—），男（漢），講師，博士，主要從事藥食兩用植物活性成分研究。

*通信作者：聶華（1979—），男（漢），講師，博士，主要從事藥物新劑型及功能食品開發(fā)。