一株鵝源多殺性巴氏桿菌TSP-1的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

張召興，李蘊(yùn)玉，張香齋，賈青輝，常超越，閆艷娟，李佩國(guó)

(河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066004)

一株鵝源多殺性巴氏桿菌TSP-1的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

張召興，李蘊(yùn)玉，張香齋，賈青輝，常超越，閆艷娟，李佩國(guó)*

(河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066004)

為了確定引起雛鵝急性死亡的病原菌，從送檢的病死雛鵝的肝臟、心血、肺臟病料組織中分離到1株病原菌，并命名為T(mén)SP-1。通過(guò)培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、16S rRNA基因序列分析等鑒定方法，分離菌株TSP-1鑒定為多殺性巴氏桿菌。動(dòng)物試驗(yàn)表明，分離菌株TSP-1具有很強(qiáng)的致病性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：分離菌株TSP-1對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考、阿奇霉素、阿米卡星等4種藥物高度敏感；對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素等4種藥物中度敏感；對(duì)氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素等6種藥物耐藥。

鵝；多殺性巴氏桿菌；分離鑒定；16S rRNA；藥敏試驗(yàn)

鵝巴氏桿菌病是由禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起鵝的一種急性、敗血性傳染病[1]。該菌是一種禽類(lèi)養(yǎng)殖中常見(jiàn)病原菌，廣泛存在環(huán)境中，可感染家畜、家禽等多種動(dòng)物也可感染人，可以引發(fā)豬肺疫、禽霍亂、牛出血性敗血癥等多種疾病[2，3]。巴氏桿菌可以感染不同日齡的鵝，一旦發(fā)病多數(shù)呈急性敗血癥型，發(fā)病率和死亡率都較高[4]。該病主要通過(guò)消化道和呼吸道感染，也可以通過(guò)吸血昆蟲(chóng)和損傷的皮膚、黏膜等多種途徑感染[5]。同種動(dòng)物之間可以相互感染，發(fā)病無(wú)明顯的季節(jié)性，但在氣候劇變、冷熱交替、悶熱、潮濕等時(shí)期多發(fā)生。外界環(huán)境的改變，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力降低是本病主要的發(fā)病誘因之一，家禽發(fā)生該病時(shí)，多呈流行性[6]。

2016年11月，唐山市某養(yǎng)鵝場(chǎng)，38日齡雛鵝突然發(fā)病，多數(shù)病鵝呈急性死亡，病鵝出現(xiàn)了精神沉郁、食欲減少或不食、咳嗽，并且口鼻有黏液性分泌物流出，還伴有嚴(yán)重的腹瀉癥狀，有的昏迷痙攣而死亡。對(duì)病死鵝進(jìn)行剖檢，無(wú)菌采集病料肝臟、肺臟、心血等組織進(jìn)行分離鑒定，確定了引起雛鵝死亡的病原菌為多殺性巴氏桿菌，并對(duì)分離菌株TSP-1進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以期為該病的防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

唐山市某養(yǎng)鵝場(chǎng)，38日齡的雛鵝5萬(wàn)只，發(fā)病率為25%，死亡率為19%，對(duì)送檢的死亡的雛鵝進(jìn)行剖檢，無(wú)菌操作采集具有典型病理變化的肝臟、心血、肺臟等病料，進(jìn)行分離鑒定。

1.2 主要試劑與儀器

普通瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯(購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；藥敏紙片(購(gòu)于北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)；美蘭染色液試劑盒(購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；小牛血清(購(gòu)于四季青公司)；微量發(fā)酵管(購(gòu)于杭州天和微生物公司)；ID32E腸道菌鑒定試條(購(gòu)于法國(guó)梅里埃公司)；瓊脂糖，TAE，DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix，Gold View核酸染液，10×Loading buffer，樹(shù)脂型TM基因組DNA提取試劑盒(均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；體積分?jǐn)?shù)為0.07的綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)基；常規(guī)的試劑及儀器由本實(shí)驗(yàn)提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

38日齡雛鵝8只，購(gòu)于唐山市某養(yǎng)鵝場(chǎng)。

1.4 病原的分離純化

無(wú)菌采集的病死雛鵝的肝臟、心血、肺臟和脾臟等病料組織，接種于體積分?jǐn)?shù)為0.07的綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，選取圓形、透明、露珠樣優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌接種劃線含普通培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后，提取純化培養(yǎng)后優(yōu)勢(shì)菌落接種在體積分?jǐn)?shù)為0.10的含小牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，并調(diào)取純培養(yǎng)的單菌落涂片，美蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 病原菌生化試驗(yàn)

按微量發(fā)酵管和ID32E腸道菌鑒定試劑條說(shuō)明書(shū)經(jīng)行操作，用自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.6 病原菌的16S rRNA PCR檢測(cè)

將純化培養(yǎng)后的分離菌株STP-1接種于含體積分?jǐn)?shù)為0.10的小牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)12～16 h。按照樹(shù)脂型TM基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道的16S rRNA通用引物，由上海生工生化有限公司合成。以提取的基因組DNA為模板，經(jīng)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系( 50 μL)：2×Taq Marker Mix25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL, ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，72 ℃中延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)。取出5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠中，150 V電泳20 min，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，將PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄基因序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.7 致病性試驗(yàn)

[8]的方法，將實(shí)驗(yàn)雛鵝分為2組，每組4只，第1組為試驗(yàn)組，每只雛鵝腹腔注射分離菌株TSP-1劑量為0.25 mL(5×108CFU/mL)；第2組接種等量的營(yíng)養(yǎng)肉湯作為陰性對(duì)照。接種12 h后，觀察7 d記錄發(fā)病及死亡情況，對(duì)于死亡的雛鵝剖檢，無(wú)菌取其肝臟、心血、肺臟等病料組織分離并鑒定。

1.8 藥敏試驗(yàn)

采用K-B藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法結(jié)果判斷[9]。

2 結(jié)果分析

2.1 病死鵝剖檢結(jié)果

剖檢變化可見(jiàn)，病死雛鵝呈敗血癥型，肝臟腫大，質(zhì)脆呈現(xiàn)淡黃色或白色大小不等壞死點(diǎn)；肺充血、出血、水腫，氣管內(nèi)有帶有血絲的粘液，伴有出血；心冠脂肪及心外膜有大量出血點(diǎn)；小腸黏膜嚴(yán)重出血，有的小腸腸腔內(nèi)存在大量黃色的粘液。

2.2 分離菌株形態(tài)特征與培養(yǎng)特性結(jié)果

分離菌株TSP-1在體積分?jǐn)?shù)為0.07的綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)基，可見(jiàn)均勻一致的灰白色、圓形、濕潤(rùn)、不溶血的露珠樣小菌落(圖1)；在普通瓊脂上可見(jiàn)灰白色、針尖大的、圓形的菌落，但是生長(zhǎng)貧瘠。涂片染色鏡檢，美藍(lán)染色呈典型的兩極濃染球桿菌，呈卵圓形，中央不易著色。

圖1 分離菌株TSP-1株美藍(lán)染色鑒定結(jié)果(1 000×)

2.3 分離菌株的生化特性鑒定結(jié)果

分離菌株TSP-1 硫化氫、尿素酶、VP、賴(lài)氨酸和鳥(niǎo)氨酸、精氨酸雙水解酶陰性，接觸酶、氧化酶為陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性。經(jīng)ATB自動(dòng)生化儀鑒定分析系統(tǒng)檢測(cè)分析，鑒定結(jié)果為多殺性巴氏桿菌，評(píng)定結(jié)果合格率為 99.9%(表1)。

2.4 分離菌株的16S rRNA PCR擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果

用16S rRNA的通用引物對(duì)分離菌株TSP-1進(jìn)行了PCR 鑒定，分離菌株TSP-1擴(kuò)增出大約為1 500 bp的目的條帶(圖2)。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接(圖3)，與GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列進(jìn)行比對(duì)，與已發(fā)表的多殺性巴氏桿菌的基因序列同源性為100%，確定了分離菌株TSP-1為多殺性巴氏桿菌。

表1 分離菌株生化特性鑒定結(jié)果

注：+為陽(yáng)性，-為陰性。

圖2 分離菌株TSP-1株16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果M，DL-2000 Marker；1～3，分離菌株TSP-1

圖3 分離菌株TSP-1測(cè)序拼接序列結(jié)果

表2 分離菌株STP-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：R為耐藥，I為中介，S為敏感。

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組雛鵝在攻毒24 h后出現(xiàn)死亡。剖檢后，無(wú)菌采集肺臟、肝臟、心血組織等進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果顯示所分離菌與TSP-1株一致。對(duì)照組4只雛鵝健康存活，表明分離菌株TSP-1具有一定致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株TSP-1對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考、阿奇霉素、阿米卡星等4種藥物高度敏感(表2)；對(duì)頭孢曲松、慶大霉素、恩諾沙星、強(qiáng)力霉素等4種藥物中度敏感；對(duì)氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素等6種藥物耐藥。

3 討 論

本次試驗(yàn)對(duì)病死的雛鵝進(jìn)行剖檢，無(wú)菌采集病料肝臟、肺臟、心血等組織中分離到1株病原菌，并命名為T(mén)SP-1。通過(guò)培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)鑒定方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示分離菌株TSP-1的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)及生化特性與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]中報(bào)道的多殺性巴氏桿菌的形態(tài)特性及生化特性一致，初步判定分離菌株TSP-1為多殺性巴氏桿菌。

為了進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用16S rRNA PCR方法進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)序結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件比對(duì)，與多殺性巴氏桿菌同源性為100%，從分子生物學(xué)的角度證實(shí)了TSP-1為多殺性巴氏桿菌。在細(xì)菌的分離鑒定過(guò)程中，用以PCR方法鑒定作為輔助的檢測(cè)方法，能夠更加準(zhǔn)確地確定病原，也是常用的方法[2]，許多文獻(xiàn)報(bào)道了利用多殺性巴氏桿菌標(biāo)志性的基因，建立診斷多殺性巴氏桿菌PCR方法[11]。

鵝巴氏桿菌病是危害業(yè)養(yǎng)鵝主要疾病之一，該病發(fā)病急、死亡快，其發(fā)病率和死亡率都很高，近幾年報(bào)道的該病不斷增多，嚴(yán)重影響的我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展[12]。本次實(shí)驗(yàn)在唐山地區(qū)分離的鵝多殺性巴氏桿菌TSP-1株具有很強(qiáng)的致病性，與張邑帆等[13]報(bào)道的從病死鵝中分離的多殺性巴氏桿菌具有很強(qiáng)的致病性一致。鵝多殺性巴氏桿菌病在防治過(guò)程中比較困難，由于飼養(yǎng)環(huán)境中病原微生物污染，另外在養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)生于各種應(yīng)激有關(guān)，導(dǎo)致抵抗力下降，引發(fā)該病的發(fā)生[14]。目前，應(yīng)該研制多殺性巴氏桿菌多價(jià)疫苗來(lái)有效預(yù)防該病的發(fā)生。本次實(shí)驗(yàn)藥敏試驗(yàn)顯示，僅對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考、阿奇霉素、阿米卡星4種藥物高度敏感；對(duì)其他的藥物存在不同的耐藥性。與楊澤曉等[8]報(bào)道的鵝多殺性巴氏桿菌對(duì)頭孢他啶、頭孢唑肟和氟苯尼考等藥物敏感，對(duì)其他的藥物有耐藥性一致。與劉紅玉等[2]、于成接等[5]報(bào)道的有差異性，可能與分離的地區(qū)、血清型有關(guān)。因此當(dāng)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生該病時(shí)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合理用藥，才能獲得良好的治療效果。

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(責(zé)任編輯：朱寶昌，楊靜)

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學(xué)報(bào)編輯部

Identification and Drug Sensitivity Test of P.MultocidaTSP-1 Isolated from Goose

ZHANG Zhaoxing, LI Yunyu, ZHANG Xiangzhai, JIA Qinghui, CHANG Chaoyue, Yan Yanjuan, LI Peiguo

(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao Hebei, 066604, China)

In order to identify the pathogen causing acute death in goose, a suspected pathogenic bacterium from the clinical death cases of goose, was isolated and named as STP-1. The morphological observation, biochemical identification and sequence analysis of 16S rRNA were conducted. All the data indicated the suspected strain was a member ofP.multocida. STP-1 strain also had a strong pathogenicity to goose in further animal regression. Drug sensitivity test exhibited STP-1 was high sensitive to spore cefixime, florfenicol, azithromycin and amikacin, moderately sensitive to ceftriaxone, gentamicin, enrofloxacin and doxycycline, but resistant to ampicillin, amoxicillin and tetracycline etc.

goose;P.multocida; identification; 16S rRNA; drug sensitivity test

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.01.010

2017-03-02

S852.61

A

1672-7983(2017)01-0048-05

張召興(1988-)，男，研究生在讀。主要研究方向：動(dòng)物病原微生物及其防控。

*通訊作者，男，博士，教授。主要研究方向：動(dòng)物疫病防控技術(shù)。E-mail:lpeiguo@163.com。