復(fù)合固態(tài)發(fā)酵棉粕中鹽類物質(zhì)的優(yōu)化

田永強(qiáng)， 劉惠琴， 盧燕霞， 張阿強(qiáng)， 陳錫明

(1.蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅 蘭州 730000)

復(fù)合固態(tài)發(fā)酵棉粕中鹽類物質(zhì)的優(yōu)化

田永強(qiáng)1， 劉惠琴1， 盧燕霞1， 張阿強(qiáng)1， 陳錫明2

(1.蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅 蘭州 730000)

通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計方法和DPS v7.05統(tǒng)計軟件中的均勻設(shè)計方法研究了鹽類物質(zhì)對棉粕發(fā)酵底物中游離棉酚降解率的影響。Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果表明只有生物素對降解率的影響是極顯著的，其他因素均不顯著，進(jìn)而不能進(jìn)一步通過Box-Behnken(BBD)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證此試驗(yàn)結(jié)果。因此選出對降解率具有正效應(yīng)的因素利用DPS v7.05統(tǒng)計軟件中的均勻設(shè)計方法來研究這些因素對降解率的影響。最后得出各個因子的最佳組合：X1(尿素)1.44%，X2(檸檬酸三銨)0.20%，X3(氯化膽堿)0.20%，X4(磷酸氫二鉀)0.34%，X5(硫酸鎂)1.00%，X6(硫酸銅)1.00%，X7(硫酸錳)1.00%，X8(硫酸鋅)0.10%。

鹽類物質(zhì)；固態(tài)發(fā)酵；棉粕；游離棉酚

棉粕是一種富含蛋白質(zhì)的植物性飼料源，但其含有毒性較高的游離棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，限制了在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用[1-3]。游離棉酚是限制棉粕利用的主要因素，它的去除方法有化學(xué)法、物理法、溶劑浸提法和微生物發(fā)酵法[4-7]。通過微生物降解游離棉酚的研究始于國外[8-15],但是我國在后來逐漸建立起利用微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕而降解游離棉酚的方法[16-24]。微生物固態(tài)發(fā)酵棉粕不僅降低了游離棉酚的含量，而且提高了發(fā)酵后棉粕的營養(yǎng)價值，如蛋白及多種氨基酸含量等[25-28]。但微生物發(fā)酵棉粕仍然存在許多問題，如用來發(fā)酵棉粕的菌株性能不穩(wěn)定、耐受性不強(qiáng)、容易突變；微生物降解游離棉酚的詳細(xì)機(jī)制不清楚；菌種復(fù)合發(fā)酵棉粕的過程中，一些菌群之間的協(xié)同作用或拮抗作用的機(jī)理尚不明確，缺乏充分的理論依據(jù)等[29-33]。本研究在前期發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上，對底物中鹽類物質(zhì)的種類及其添加量進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試原料 棉粕、麩皮、玉米粉，均購自市場。

1.1.2 菌種 產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)(31272) 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；M2 從實(shí)驗(yàn)室提供的棉籽殼中分離獲得，鑒定為產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)。

1.1.3 試劑 正己烷，利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司；異丙醇，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；3-氨基-1-丙醇，上海麥克林生化科技有限公司；冰乙酸，利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司；苯胺，上海中泰化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)室所用試劑，均為分析純。

1.1.4 儀器 SW-CJ-1B型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；LDZX-50FA型高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；HNY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器(天津市歐諾儀器儀表有限公司)；722s型可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；JSP-100型多功能高速粉碎機(jī)(浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠)；KDN-08A凱氏定氮儀(上海昕瑞儀器儀表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 將酵母菌活化在YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)挑取3環(huán)接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)20 h，備用；將M2活化在LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h后，用接種環(huán)挑取3環(huán)接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)20 h，備用。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵方法 稱取30 g發(fā)酵底物于480 mL組培瓶中混合均勻，121 ℃滅菌20 min，將每組的無機(jī)鹽溶解于發(fā)酵底物∶水(質(zhì)量比)=1∶0.75的無菌水中，然后將鹽溶液加入到滅菌后的發(fā)酵底物中，攪拌均勻，按發(fā)酵底物重量4%的接種量把產(chǎn)朊假絲酵母和M2以體積比為7∶3的比例分別接入發(fā)酵物中，并攪拌均勻，在32.5 ℃發(fā)酵54 h后[34]，45 ℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩，將樣品放入自封袋中，備用。

1.2.3 發(fā)酵底物中鹽類物質(zhì)添加量的優(yōu)化方法 采用Mintab16.1.0軟件中DOE設(shè)計下的Plackett-Burman設(shè)計14個因子2水平的試驗(yàn)，共20個處理組，每個處理組3個重復(fù)，測定指標(biāo)為發(fā)酵底物中游離棉酚的降解率。設(shè)計參數(shù)和水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計參數(shù)和水平

通過對表2試驗(yàn)結(jié)果的分析得出，只有一個因素對游離棉酚降解率的影響是極顯著的，不適合用Box-Behnken(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計來評價指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系。因此，選出對游離棉酚的降解率有正效應(yīng)的因素進(jìn)行均勻優(yōu)化方法優(yōu)化其添加量，如表3所示，采用8因素10水平設(shè)計試驗(yàn)。試驗(yàn)采用DPS v7.05統(tǒng)計軟件中的均勻設(shè)計方法得到均勻優(yōu)化設(shè)計表U10(108)(見表4)，利用該表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，每個處理3個重復(fù)，共計30個樣本，測定指標(biāo)為發(fā)酵物中游離棉酚的降解率。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計表及結(jié)果

表3 鹽類物質(zhì)添加量優(yōu)化的因子與水平

注：X1為尿素，X2為檸檬酸三銨，X3為氯化膽堿，X4為磷酸氫二鉀，X5為硫酸鎂，X6為硫酸銅，X7為硫酸錳，X8為硫酸鋅，下表同

表4 酵底物中鹽類物質(zhì)添加量的優(yōu)化設(shè)計表U10(108)

1.2.4 指標(biāo)測定方法 游離棉酚的含量具體測定方法參照國標(biāo)GB13086-91，飼料中游離棉酚的測定方法參照文獻(xiàn)[35]。游離棉酚的降解率(%)=((未發(fā)酵棉粕中游離棉酚的含量-發(fā)酵棉粕中游離棉酚的含量)/未發(fā)酵棉粕中游離棉酚的含量)×100%?；罹鷶?shù)的測定采用平板計數(shù)法，按照國標(biāo)GB4789.15-84，食品微生物檢驗(yàn)方法。

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 在發(fā)酵底物中按優(yōu)化后的添加量添加相應(yīng)的鹽，對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。重復(fù)3次試驗(yàn)，每次三個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見表2。通過利用Minitab軟件對Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，如表5所示，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.336 02，預(yù)測誤差平方和為4 305.37，回歸方程的系數(shù)R2=0.863 5，調(diào)整后R2=0.481 3。 總體上，此結(jié)果只說明了生物素對降解率的影響是最顯著的，其他因素對降解率的影響不顯著，因此，選擇對降解率具有正效應(yīng)的8個因素(B、D、E、J、K、M、N、O)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能是實(shí)驗(yàn)設(shè)計中因素太多，其它原因有待進(jìn)一步研究。

2.2 無機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果分析

如表6所示，以游離棉酚的降解率為目標(biāo)函數(shù)Y，用DPS v7．05軟件對降解率和因子水平的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)逐步回歸分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

Y=62.287+19.510X6-24.395X7+35.381X72-0.851X82-0.034X2X4-5.314X3X7+2.578X5X6-5.386X5X8。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計分析結(jié)果

注：++表示差異極顯著；P為差異顯著性參數(shù)

統(tǒng)計結(jié)果表明，該方程的決定系數(shù)R2=1.000，表明次回歸方程與試驗(yàn)結(jié)果符合度極好，能夠準(zhǔn)確表達(dá)出因子與函數(shù)之間的關(guān)系。變量X7、X82、X2X4、X3X7、X5X8與Y呈負(fù)相關(guān)，其偏相關(guān)系數(shù)均為-1，差異極顯著(P<0.01)；變量X6、X72、X5X6與Y呈正相關(guān)，其偏相關(guān)系數(shù)均為1，差異極顯著(P<0.01)。根據(jù)該二次多項(xiàng)回歸方程，DPS v7.05軟件擬合的Y最高指標(biāo)時各個因子組合：X1(尿素)1.44%，X2(檸檬酸三銨)0.20%，X3(氯化膽堿)0.20%，X4(磷酸氫二鉀)0.34%，X5(硫酸鎂)1.00%，X6(硫酸銅)1.00%，X7(硫酸錳)1.00%，X8(硫酸鋅)0.10%。

表6 無機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在接種量為發(fā)酵底物質(zhì)量的4%，產(chǎn)朊假絲酵母和M2的接種比以體積比為7∶3，發(fā)酵溫度32.5 ℃，發(fā)酵時間54 h，發(fā)酵底物的初始含水量75%，各種鹽的添加量為尿素1.44%，檸檬酸三銨0.20%，氯化膽堿0.20%，磷酸氫二鉀0.34%，硫酸鎂1.00%，硫酸銅1.00%，硫酸錳1.00%，硫酸鋅0.10%的最優(yōu)條件下發(fā)酵棉粕，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。游離棉酚的降解率在最佳條件下為65.254%。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表8可知，發(fā)酵前后游離棉酚的含量顯著下降，從763.52 mg/kg下降到265.295 mg/kg，降解率達(dá)到65.254%。粗蛋白含量變化不明顯，只升高了2.04%。一般發(fā)酵前先用分光光度計測定種子液的OD600值(1OD600=2.8×108cfu)，然后通過接種量和接種比分別算出發(fā)酵底物中的活菌數(shù)。待發(fā)酵完成后，通過平板計數(shù)法測定底物發(fā)酵后的活菌數(shù)。由表8可知發(fā)酵后的活菌數(shù)比發(fā)酵前有所增加，M2的活菌數(shù)增加了224倍，產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)增加了679倍。

表8 發(fā)酵前后棉粕中游離棉酚、粗蛋白含量及活菌數(shù)

3 結(jié) 論

通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計方法和DPS v7.05統(tǒng)計軟件中的均勻設(shè)計方法研究了無機(jī)鹽對棉粕發(fā)酵底物中游離棉酚降解率的影響。前期優(yōu)化得出的最佳發(fā)酵條件下，即接種比7∶3(體積比)，接種量為發(fā)酵底物質(zhì)量的4%，發(fā)酵底物中初始含水量為其質(zhì)量的75%，發(fā)酵溫度32.5 ℃，發(fā)酵時間54 h，發(fā)酵棉粕后降解率為59.031%。此條件下在底物中添加的鹽：X1(尿素)1.44%，X2(檸檬酸三銨)0.20%，X3(氯化膽堿)0.20%，X4(磷酸氫二鉀)0.34%，X5(硫酸鎂)1.00%，X6(硫酸銅)1.00%，X7(硫酸錳)1.00%，X8(硫酸鋅)0.10%，游離棉酚的降解率能達(dá)到65.254%。底物中添加鹽類物質(zhì)后，游離棉酚的降解率有所提升。

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[35]飼料中游離棉酚的測定方法, GB13086-91.

Optimization of Saline Material in Composite Solid Fermentation of Cottonseed Dregs

TIAN Yong-qiang1, LIU Hui-qin1, LU Yan-xia1, ZHANG A-qiang1, CHEN Xi-ming2

(1.Coll.ofChem. &Biol.Engin.,LanzhouJiaoTongUni.,Gansu,Lanzhou730070; 2.Cold&AridReg.Environt'l&Engin.Res.Inst.,ChineseAcad.ofSci.,Gansu,Lanzhou730000)

The effect of saline material on degradation rate FG of cottonseed dregs fermentation by Plackett-Burman experimental design methods and statistical software DPS v7.05 uniform design method was studied. Plackett-Burman experimental results showed that only biotin extremely significant affects the degradation rate, other factors are not significant, and thus can not be further tests to verify the results by Box-Behnken (BBD) experiments. Therefore, the impact of these factors on the degradation rate of the selected factors had a positive effect on the degradation rate using of statistical software DPS v7.05 uniform design method. Finally, the best combination of each factor was obtained: X1(urea) 1.44%, X2(ammonium citrate) 0.20%, X3(choline chloride) 0.20%, X4(dipotassium hydrogen phosphate) 0.34%, X5(magnesium sulfate) 1.00%, X6(copper sulfate) 1.00%, X7(manganese sulfate) 1.00%, X8(zinc sulfate) 0.10%.

saline material； solid state fermentation； cottonseed dregs； free gossypol

甘肅省科技支撐計劃項(xiàng)目(613035)

田永強(qiáng) 男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師。從事微生物分離、鑒定和應(yīng)用研究。E-mail：357181873@qq.com

2016-03-11；

2016-08-09

Q81

A

1005-7021(2017)02-0035-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.005