LncRNA TUG1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者血清中的表達(dá)及意義

潘洪川，劉海燕，張?jiān)鲁?，肖大宴，謝清平

（四川省眉山市人民醫(yī)院，四川眉山 620010）

LncRNA TUG1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者血清中的表達(dá)及意義

潘洪川，劉海燕，張?jiān)鲁ご笱纾x清平

（四川省眉山市人民醫(yī)院，四川眉山 620010）

目的探討檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1（long non coding RNA TUG1，LncRNA TUG1，TUG1）在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊哐逯械谋磉_(dá)及其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymemse chain reaction，QRT-PCR）檢測(cè)眉山市人民醫(yī)院收治的106例冠心病陽(yáng)性患者和98例冠心病陰性對(duì)照組的血清TUG1濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血清中胰島素樣生長(zhǎng)因子2B（insulin-like growth factor 2B，IGF2B）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的濃度。分析血清TUG1濃度與血清IGF2B、IL-6、TNF-α濃度的相關(guān)性。結(jié)果與冠心病陰性組比較，冠心病陽(yáng)性組血清TUG1濃度維持在相對(duì)較低的水平；而血清IGF2B、IL-6、TNF-α濃度在冠心病陽(yáng)性組明顯高于冠心病陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清TUG1濃度與IGF2B、IL-6及TNF-α濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（IGF2B：r=-0.767，P<0.001；IL-6：r=-0.671，P<0.001；TNF-α：r=-0.872，P<0.001）。結(jié)論冠心病患者血清TUG1濃度顯著降低，可能是潛在的診斷和預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后的血清標(biāo)志物。

冠狀動(dòng)脈疾?。婚L(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1；臨床意義

動(dòng)脈粥樣硬化是一種由脂質(zhì)代謝異常、慢性炎癥、免疫紊亂及遺傳等多種因素相互作用下發(fā)生的一種慢性代償性炎癥反應(yīng)，是許多心血管疾病的病理基礎(chǔ)；其病程涉及脂質(zhì)在血管內(nèi)膜沉積、內(nèi)皮細(xì)胞受損、血小板和白細(xì)胞（單核細(xì)胞）黏附、侵襲伴平滑肌細(xì)胞和膠原纖維增殖、泡沫細(xì)胞的形成。單核細(xì)胞黏附、遷移到內(nèi)皮層下引發(fā)炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)，也是防止動(dòng)脈粥樣硬化的重要靶點(diǎn)［1，3］。研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子2B（insulin-like growth factor 2B，IGF2B）mRNA結(jié)合蛋白參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1（long non coding RNA TUG1，LncRNA TUG1，TUG1）可能影響IGF2BmRNA結(jié)合蛋白的表達(dá)，我們推測(cè)LncRNA TUG1可能通過(guò)調(diào)節(jié)IGF2BmRNA結(jié)合蛋白表達(dá)，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)。本研究旨在研究LncRNA TUG1在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的作用及意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2014年10月至2015年12月期間相繼在眉山市人民醫(yī)院心內(nèi)科就診的患者，包括106例冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。╆?yáng)性患者和98例冠心病陰性對(duì)照。冠心病組：冠狀動(dòng)脈造影顯示有1支以上狹窄≥75%的患者，其中男67例，女39例，年齡59（35～88）歲。對(duì)照組：選擇同期就診、冠狀動(dòng)脈造影顯示狹窄≤25%的患者，其中男49例，女48例，年齡56.8（32～85）歲。所有患者間無(wú)血緣關(guān)系。采集外周血液樣本，同時(shí)收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、是否患有原發(fā)性高血壓（高血壓）、是否患有高血脂、是否患有糖尿病、是否發(fā)生過(guò)心肌梗死。所有入選患者確診后即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集靜脈血靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3 000 r/min離心15 min，留取上層血清，置于-80℃冰箱備用。所有患者均簽署知情同意書(shū)，經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清總RNA提取

將分離所得血清置于冰上融化；取250 μL血清樣品，加入750 μL Trizol，振蕩器混勻，靜置5 min；加入200 μL氯仿，振蕩器混勻，靜置10 min；室溫下離心12 000 r/min、10 min，留取上清液并量取其體積，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無(wú)Rnase的EP管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置3 min；室溫下離心12 000 r/min、10 min；倒出管內(nèi)液體，加用1 mL75%乙醇；室溫12 000 r/min離心2 min；倒出乙醇，并用Tip槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入10 μL無(wú)Rnase的雙蒸水（ddH2O），以能夠充分溶解RNA；用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析LncRNA TUG1的表達(dá)水平

提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymemse chain reaction，QRT-PCR）采用2xSYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L、15 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

1.4 血清指標(biāo)的檢測(cè)

血清IGF2B、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）均采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。酶聯(lián)免疫分析試劑盒由上海華壹生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。血液標(biāo)本中TUG1、IGF2B、IL-6、TNF-α濃度以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或One-way ANOVA方差分析；TUG1與IGF2B、IL-6及TNF-α相關(guān)性分析采用線性回歸法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

106例冠心病陽(yáng)性患者和98例冠心病陰性對(duì)照者的臨床資料比較，詳見(jiàn)表1和表2。與冠心病陰性組比較，冠心病陽(yáng)性組血清TUG1濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1A、圖1B。

表1 兩組計(jì)量臨床資料比較 ［±s］

表1 兩組計(jì)量臨床資料比較 ［±s］

臨床特征 冠心病陽(yáng)性組 冠心病陰性組P值n年齡（歲）身高（cm）體質(zhì)量（kg）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）106 62.1±15.4 160.5±12.7 61.7±16.8 126.0±18.1 77.9±12.0 98 59.5±13.7 158.1±14.4 60.4±17.0 119.8±13.0 72.6±10.4 0.610 0.762 0.649 0.573 0.084

表2 兩組計(jì)數(shù)臨床資料比較 ［n（%）］

圖1 兩組血清TUG1濃度比較圖（QRT-PCR分析結(jié)果）

2.2 兩組血清IGF2B、IL-6及TNF-α濃度比較

冠心病陽(yáng)性組血清IGF2B、IL-6及TNF-α濃度分別為（121.20±12.48）ng/mL、（150.65±11.48）ng/mL和（160.56±11.175）ng/mL，顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 兩組血清IGF2B、IL-6及TNF-α濃度比較柱狀圖

2.3 相關(guān)分析結(jié)果

線性相關(guān)分析結(jié)果提示，血清TUG1濃度與IGF2B、IL-6及 TNF-α濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（IGF2B：r=-0.767，P<0.001；IL-6：r=-0.671，P< 0.001；TNF-α：r=-0.872，P<0.001），見(jiàn)圖3A、圖3B、圖3C。

圖3 血清TUG1濃度與IGF2B、IL-6及TNF-α濃度的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

炎癥貫穿冠心病發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)病理、生理過(guò)程，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和不穩(wěn)定的中心環(huán)節(jié)［6-7］。眾所周知，人類基因組中的可轉(zhuǎn)錄本超過(guò)90%，但是其中只有大約2%為蛋白編碼基因。這意味著非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組中的重要組成部分，在這些非編碼RNA中，長(zhǎng)度為21～23 nt的微小RNA（microRNA，miRNA）已被證明在多種生物及病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）及其亞型基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA，這一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的ncRNA，近年來(lái)亦被證明是非編碼RNA中可發(fā)揮生物學(xué)功能的重要組分［2，4］。眾多研究結(jié)果提示，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，LncRNAs均有參與并發(fā)揮重要作用，然而，LncRNAs在心血管系統(tǒng)疾病中的作用卻尚不十分清楚［5，8］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BmRNA結(jié)合蛋白參與動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA TUG1可能影響IGF2BmRNA結(jié)合蛋白的表達(dá)，我們推測(cè)LncRNA TUG1可能通過(guò)調(diào)節(jié)IGF2BmRNA結(jié)合蛋白表達(dá)從而影響動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)。本研究通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)我院收治的106例冠心病陽(yáng)性患者和98例冠心病陰性對(duì)照患者血清TUG1濃度，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血清中IGF2B、IL-6、TNF-α濃度。分析其TUG1與血清IGF2B、IL-6、TNF-α濃度的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與冠心病陰性組比較，冠心病陽(yáng)性組患者血清TUG1濃度維持在相對(duì)較低的水平。而IGF2B、IL-6、TNF-α在冠心病陽(yáng)性組血清中的濃度明顯高于冠心病陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血清TUG1濃度與IGF2B、IL-6及TNF-α濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，LncRNA TUG1有望成為新的早期診斷冠心病的血清學(xué)指標(biāo)，可作為冠心病早期診斷和鑒別標(biāo)志物，具有較好的臨床應(yīng)用前景，然而其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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Expression and significance of serum LncRNA TUG1 in patients with coronary atherosclerotic heart disease

PAN Hong-chuan，LIU Hai-yan，ZHANG Yue-chao，XIAO Da-yan，XIE Qing-ping
（People′s Hospital of Meishan City，Meishan，Sichuan 620010，China）

ObjectivesTo investigate the expression and clinical significance of long non coding RNA TUG1（LncRNA TUG1，TUG1）in patients with coronary atherosclerotic heart disease（CAD）.MethodsSerum concentrations of TUG1 in coronary atherosclerotic heart disease positive group（n=106）and coronary heart disease negative group（n=98）were measured by quantitative real time polymemse chain reaction（QRT-PCR）.Serum concentrations of insulin-like growth factor 2B（IGF2B），interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α）were tested by enzyme linked immunosorbent assay.Correlations between serum concentrations of IGF2B，IL-6，TNF-α and serum concentration of TUG1 in CAD positive group were analyzed.ResultsCompared with negative group，serum concentrations of TUG1 were maintained at a relatively low level in the positive group；serum concentrations of IGF2B，IL-6 and TNF-αin CAD positive group were significantly higher than those in CAD negative group（P<0.05）. Correlation analysis revealed that serum concentrations of TUG1 and IGF2B，IL-6，TNF-α negatively correlated with serum concentration of TUG1（IGF2B：r=-0.767，P<0.001；IL-6：r=-0.671，P<0.001；TNF-α：r=-0.872，P<0.001）.ConclusionsSerum concentration of TUG1 in patients with CAD significantly decreases，which may be as a potential marker for diagnosis and prognosis of coronary heart disease.

coronary atherosclerotic heart disease；long non coding RNA TUG1；clinical significance

R541.4

：A

：1007-9688（2017）02-0151-04

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.02.08

2016-04-05）

潘洪川（1978-），男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楣谛牟〔±砩怼?/p>