幼兔橈骨臨界性骨缺損動物模型的建立

芮 敏鄭 欣王 帆李東亞李成宇曹 偉劉 洪郭開今

幼兔橈骨臨界性骨缺損動物模型的建立

芮 敏1鄭 欣1王 帆2李東亞1李成宇1曹 偉2劉 洪2郭開今1

目的 建立幼兔橈骨不同尺寸骨缺損模型，確定幼兔橈骨臨界性骨缺損長度。 方法選取健康3月齡雄性新西蘭兔20只（2.2～2.5 kg），采用左右側(cè)配對設(shè)計的方法在雙側(cè)橈骨中段分別制作15 mm及20 mm橈骨骨缺損模型，按骨缺損長度分為A組（15mm）及B組（20 mm），每組各20側(cè)。分別于術(shù)后第1天，術(shù)后第4、8、12周行CT檢查，應(yīng)用CT-Hedberg評分評估骨愈合情況。于術(shù)后12周處死所有實驗兔，取出尺橈骨標(biāo)本，通過大體觀察及HE染色組織學(xué)觀察分析缺損區(qū)骨愈合情況。 結(jié)果 術(shù)后實驗兔均存活，術(shù)后第12周大體觀察：A組19例（95%）橈骨斷端有連續(xù)性骨痂生成，新生骨表面光滑，塑形良好；B組缺損斷端髓腔封閉，缺損區(qū)由纖維組織填充。術(shù)后第12周CT圖像可見A組皮質(zhì)骨塑性完全，B組斷端及缺損尺側(cè)均有新骨生成，髓腔封閉。術(shù)后各時間點CT-Hedberg評分：A組（3.0±0.6，3.9±0.3，4.0±0.2）與B組（1.6±0.5，2.7±0.6，2.9±0.6）間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組織學(xué)結(jié)果：A組缺損已修復(fù)完全，新生骨組織內(nèi)可見血管再生，B組缺損區(qū)由纖維組織填充。結(jié)論 在進行幼齡兔骨缺損研究時，可選擇3月齡雄性新西蘭兔橈骨干構(gòu)建20 mm長骨缺損。

橈骨；骨／損傷；模型，動物；兔

兒童時期骨髓炎清創(chuàng)、嚴重創(chuàng)傷、巨大骨腫瘤切除術(shù)后等，均易導(dǎo)致肢體大段骨缺損，后期可產(chǎn)生肢體短縮、成角畸形，造成肢體功能障礙，嚴重影響兒童生長發(fā)育，如何修復(fù)大段骨缺損仍是小兒骨科醫(yī)生面臨的重大難題［1，2］。理想的骨缺損動物模型能為實驗研究提供有價值的參考數(shù)據(jù)，其中新西蘭兔是應(yīng)用較為廣泛的實驗動物［3，4］，但目前關(guān)于構(gòu)建幼齡新西蘭兔大段骨缺損模型的實驗研究甚少。本實驗通過選擇3月齡新西蘭兔，并于橈骨干中段制備不同長度骨缺損，以獲得相對可靠的幼齡兔骨缺損模型，為小兒骨缺損臨床基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物

選取3月齡健康、清潔級雄性新西蘭兔20只，體重2.2～2.5 kg，由江蘇省動物實驗中心提供［動物合格證：SYXK（蘇）2015—0030］。動物飼養(yǎng)室維持恒溫25℃左右，相對濕度40%～60%，單籠飼養(yǎng)，自由進食，活動。

二、動物分組與制備模型

采用左右側(cè)配對設(shè)計，在雙側(cè)前肢分別制作15 mm及20 mm橈骨干中段骨缺損。根據(jù)骨缺損大小分為A組（15 mm骨缺損組）及B組（20 mm骨缺損組）。取3%戊巴比妥鈉溶液1 mL／kg耳緣靜脈注射，麻醉成功后，雙側(cè)前臂術(shù)區(qū)備皮，仰臥位固定于手術(shù)臺，術(shù)區(qū)消毒、鋪巾，在前臂橈側(cè)中段切開皮膚、皮下組織及深筋膜，經(jīng)肌間隙暴露橈骨干。剝離部分橈骨干弧頂骨膜后，以其為中心，用小型擺鋸分別制作剝離骨膜的15 mm、20 mm長度橈骨干骨缺損。截骨時，注意使用小型拉鉤牽開以保護兩側(cè)軟組織，保持鋸片與橈骨干縱軸垂直。參照Zhang YD等術(shù)中處理骨膜的方法［5］：截除骨段后，仔細分離缺損區(qū)游離骨膜，從兩側(cè)斷端向干骺端剝離5 mm長骨膜，殘余骨膜管不予縫合，使用無菌生理鹽水徹底沖洗斷端周圍骨屑及積血，逐層縫合關(guān)閉皮膚切口，加壓包扎手術(shù)切口。術(shù)后3 d每天予以肌注青霉素40萬單位。術(shù)后分籠單獨喂養(yǎng)，自由進食水，活動。

三、觀察指標(biāo)

1.大體觀察：術(shù)后觀察動物精神狀態(tài)、飲食活動等一般狀況及切口有無感染表現(xiàn)，術(shù)后第12周處死動物，取出雙側(cè)尺橈骨標(biāo)本，肉眼觀察各組標(biāo)本骨痂生成量及斷端是否出現(xiàn)骨連接等情況。

2.CT檢查：所有實驗兔分別于術(shù)后第1天及術(shù)后第4周、第8周、第12周，使用128排CT機（Definition Flash，德國SIEMENS公司）行雙側(cè)前臂CT平掃，由相同人員以相同掃描條件行CT檢查。通過CT信號值變化，觀察各階段斷端新生骨生成量，并使用CT—Hedberg評分［6］定量分析骨愈合情況。該評分依據(jù)斷端新生骨占骨缺損區(qū)比例不同，將0%～25%計為1分，25%～50%計為2分，50%～75%計為3分，75%～100%計為4分。

3.組織學(xué)觀察：于術(shù)后12周處死動物，取雙側(cè)尺橈骨標(biāo)本，缺損斷端遠近側(cè)各保留長約5 mm正常骨組織，10%甲醛溶液固定24 h后用雙蒸水沖洗干凈，置入鹽酸—甲酸—冰醋酸—甲醛混合脫鈣液脫鈣，標(biāo)本軟化至能以針刺入骨組織為宜。沖洗干凈后經(jīng)乙醇溶液（30%—50%—70%—100%）逐級脫水，石蠟包埋，沿標(biāo)本縱軸制備骨組織切片，厚度約5 μm，經(jīng)蘇木精—伊紅（HE）染色后觀察骨缺損斷端骨愈合情況及缺損區(qū)纖維結(jié)締組織增生等情況。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間各時間點CT-Hedberg評分結(jié)果進行配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

術(shù)后第1天，各組實驗兔精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活動時跛行，自由覓食飲水。切口周圍有不同程度腫脹，3～5 d腫脹漸消退，術(shù)后10 d左右切口愈合良好，所有實驗動物均如期存活。

二、大體觀察

術(shù)后12周處死動物取材，A組20側(cè)橈骨，19側(cè)（95%）橈骨斷端有連續(xù)性橋接骨痂通過，新生骨表面較為光滑，與自身橈骨形態(tài)基本一致（圖1A），1側(cè)（5%）未愈合，可能與術(shù)中過多剝離骨膜有關(guān)；B組20側(cè)橈骨斷端均僅有少量錐形骨痂生成，髓腔閉塞，缺損中央由纖維組織填充（圖1B）。

三、CT觀察結(jié)果

術(shù)后第一天CT圖像顯示各標(biāo)本骨缺損區(qū)清晰可見，斷端整齊，周圍無骨屑殘留，術(shù)區(qū)軟組織不同程度腫脹。A組：術(shù)后第4周，多數(shù)標(biāo)本缺損區(qū)充滿新生骨痂影，形態(tài)不規(guī)則，且密度較正常骨組織稍低；術(shù)后第8周，斷端新生骨痂密度增高，形態(tài)較前規(guī)則，斷端可見有連續(xù)性皮質(zhì)骨生成，髓腔內(nèi)低密度影減少；術(shù)后第12周，骨痂塑性完全，與正常橈骨形態(tài)基本相似（圖2A～D）。B組：術(shù)后第4周，斷端及鄰近尺骨側(cè)有少量低密度新骨生成；術(shù)后第8周，新生骨密度增高，部分髓腔閉塞；術(shù)后第12周，斷端骨痂硬化，髓腔閉塞，中央缺損區(qū)為軟組織影（圖3 A～D）。術(shù)后各時間點CT-Hedberg評分顯示，A組評分均比B組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 術(shù)后不同時期CT-Hedberg評分表Table 1 Scores of CT-Hedberg postoperation

四、組織學(xué)觀察

術(shù)后第12周組織學(xué)觀察可見，A組標(biāo)本骨缺損修復(fù)完全，新生骨組織內(nèi)有大量成熟骨小梁，骨板排列較規(guī)則，且可見再生血管（圖4A）；B組缺損斷端髓腔封閉，斷端有成熟板狀骨向缺損中心方向生長，靠近尺骨側(cè)亦有新生骨組織，但骨小梁排列不規(guī)則，中央缺損區(qū)見缺損空腔及纖維結(jié)締組織（圖4B）。

圖1 術(shù)后12周大體觀察圖。A：A組（15 mm缺損）標(biāo)本斷端有橋接骨痂生成，新生骨形態(tài)與正常橈骨基本一致（箭頭標(biāo)記）；B：B組（20 mm缺損）標(biāo)本斷端及鄰近尺骨側(cè)僅有少量新骨生成，髓腔閉合（右側(cè)箭頭標(biāo)記），中央缺損區(qū)為纖維軟組織（左側(cè)箭頭標(biāo)記）； 圖2 A組術(shù)后各時間點CT觀察結(jié)果。A：術(shù)后第1天斷端平行整齊，切口周圍軟組織腫脹；B：術(shù)后第4周斷端及鄰近尺骨側(cè)可見大量低密度新生骨痂生成；C：術(shù)后第8周斷端低密度骨痂影較前減少，并有連續(xù)性皮質(zhì)骨生成，但形態(tài)尚不規(guī)則；D：術(shù)后第12周皮質(zhì)骨厚度增加，塑性完全，與正常橈骨形態(tài)基本一致，髓腔部分再通； 圖3 B組術(shù)后各時間點CT觀察結(jié)果。A：術(shù)后第1天斷端整齊，切口周圍軟組織腫脹；B：術(shù)后第4周斷端及鄰近尺骨側(cè)有少量不規(guī)則新生骨痂生成，且密度不均勻，呈云絮狀；C：術(shù)后第8周斷端新生骨痂密度較前增高，部分斷端髓腔開始閉合；D：術(shù)后第12周斷端新生骨硬化，髓腔閉塞，缺損中央為軟組織影，未修復(fù)； 圖4 術(shù)后第12周斷端組織學(xué)染色結(jié)果，HE染色圖片（×20）。A：A組（15 mm）可見缺損部位為較成熟的骨組織，骨板排列較為規(guī)則，箭頭標(biāo)記處為新生血管；B：B組（20mm）可見由斷端向缺損中心生長的骨組織，靠近邊緣處骨板排列雜亂，骨細胞較少，箭頭標(biāo)記處可見中央缺損區(qū)為纖維結(jié)締組織Fig．1 Gross observations at12 weeks postoperation； Fig．2 CT sectional views of group A postoperation； Fig．3 CT sectional views of group B postoperation； Fig．4 Histological evaluations of defects at 12 weeks postoperation（HE staining×20）

討 論

小兒四肢骨缺損傳統(tǒng)治療方法多采用自體骨或異體骨充填移植。兒童時期可供移植用的骨量較少，當(dāng)骨缺損病變范圍較大時，自體骨無法滿足移植的需要，且術(shù)后可造成取骨部位慢性疼痛、切口感染等；異體骨誘導(dǎo)性差，有傳播疾病的風(fēng)險［4，7］。近年來，骨組織工程技術(shù)有望成為修復(fù)大段骨缺損的有效途徑之一，建立幼齡動物長骨大段骨缺損動物模型對于研究兒童骨缺損修復(fù)的實驗研究具有重要的意義。

骨缺損實驗中，常用動物有羊、犬、豬，鼠、兔等。鼠類雖然實驗成本較低，但其骨結(jié)構(gòu)原始，骨損傷后修復(fù)機制與人類不同［3］。兔類具有與人體相似的骨組織結(jié)構(gòu)，建模后能較好地模擬人骨缺損后的生物力學(xué)改變及骨修復(fù)機制。新西蘭兔橈骨結(jié)構(gòu)與人類相似，上下尺橈關(guān)節(jié)連接緊密，骨干間由骨間膜緊密結(jié)合，活動度小。且橈骨不是主要負重骨，制造骨缺損后，臨近尺骨可支撐固定，不需額外植入內(nèi)外固定物，能夠避免術(shù)后負重及固定物對骨愈合的影響，對動物日?；顒佑绊戄^小［4，8］。

合適的大段骨缺損尺寸，即臨界性骨缺損（critical size defect，CSD），是動物骨缺損模型的重要參數(shù)，它指在一定周期內(nèi)未經(jīng)治療、無法自愈的最短骨缺損長度［9］。有學(xué)者認為動物長骨CSD長度應(yīng)為其周徑的1.5～2.5倍以上或為長骨長度的10%以上［10］。既往研究中存在多種長骨CSD大小，從10～20 mm不等［8，11］。參考李東亞等［11］在6月齡新西蘭兔橈骨制備骨缺損的方法，并結(jié)合本研究中對兔橈骨影像學(xué)相關(guān)測量數(shù)據(jù)，顯示橈骨中段周徑約為9 mm，本實驗選擇了15 mm及20 mm兩種骨缺損尺寸，并未設(shè)置更大長度缺損組。本實驗CT結(jié)果顯示：術(shù)后第8周15 mm組絕大部分斷端有橋接骨痂形成，而20 mm組標(biāo)本仍存在缺損空腔；術(shù)后第12周，15 mm組斷端基本塑形完全，與正常橈骨形態(tài)大致相同，20 mm組斷端髓腔閉合，中央缺損區(qū)未見連續(xù)性骨痂生長。且術(shù)后各時間點，15 mm組CT-Hedberg評分均高于20 mm組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Meimandi等［8］在實驗中選取10～12月齡雄性新西蘭兔制作10 mm橈骨干骨缺損模型，術(shù)后60 d后組織學(xué)結(jié)果顯示，斷端僅有纖維性連接，尚未形成橋接骨痂，且三點彎曲試驗顯示其生物力學(xué)穩(wěn)定性較正常骨組織差。李東亞等［11］對橈骨骨缺損大小進行了對照研究，他們選取18只雄性6月齡新西蘭兔隨機分為3組分別制作10 mm、15 mm、20 mm橈骨干骨缺損，術(shù)后12周大體標(biāo)本顯示10 mm組斷端愈合完全，而15 mm、20 mm組均未愈合，缺損空腔由纖維組織填充，Hedberg評分顯示15 mm組評分顯著小于10 mm組，而與20 mm組相比，二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，基于該實驗結(jié)果，他們認為6月齡雄性新西蘭兔橈骨CSD大小為15 mm較合理。Bodde EW等［6］認為實驗動物月齡是影響骨再生的一個重要因素。3月齡新西蘭兔處于幼齡期，約相當(dāng)于人類兒童5～7歲［12］。Rivas研究發(fā)現(xiàn)新西蘭兔長骨在19～32周時停止生長［12］。本實驗骨缺損愈合時間及CSD大小與Meimand Parizi A［8］及李東亞等［11］國內(nèi)外實驗結(jié)果存在差異，可能是因為本研究選擇了骨生長旺盛的幼齡期新西蘭兔，而后兩者選擇了較為成熟的6月齡成年兔。王永剛等［13］選擇4～5月齡新西蘭兔制作股骨干骨缺損，直到術(shù)后12周斷端才形成骨痂橋接；Song等［14］選擇構(gòu)建6周齡新西蘭兔股骨干骨缺損模型，術(shù)后5～6周X線顯示斷端有大量骨痂生成，術(shù)后7～9周即形成骨痂橋接，平均骨愈合時間約為7.3周，短于本研究中骨愈合時間。

沈凱等［15］在5～6月齡新西蘭兔橈骨骨缺損模型建模中，保留了骨膜，并設(shè)計10 mm、15 mm、20 mm、25 mm及30 mm組進行對照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 mm缺損組出現(xiàn)骨愈合。本研究結(jié)果與沈凱等［15］的不同，本研究中20 mm組斷端并未愈合，可能與術(shù)中對缺損兩端骨膜進行一定程度的剝離有關(guān)。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，橈骨斷端骨膜可促進斷端骨愈合，應(yīng)徹底清理斷端殘余骨膜，以排除其對斷端骨愈合的影響［6］。Zhang YD等建議術(shù)中截斷橈骨后，兩側(cè)斷端骨膜應(yīng)向干骺端剝離約5 mm長，并徹底沖洗斷端殘余骨膜組織［5］。

綜上所述，本研究所選擇尺寸易于控制，手術(shù)操作簡單，易于推廣。選取3月齡幼兔構(gòu)建橈骨干骨缺損模型時，骨缺損長度應(yīng)選擇20 mm較為合適。不足之處在于：選擇3月齡幼兔作為實驗對象，相關(guān)實驗結(jié)論類比應(yīng)用于人類患兒其模型代表性存在爭議；實驗分組不夠詳細，考慮到幼兔的實驗飼養(yǎng)困難性問題，沒有設(shè)置1月齡及2月齡組進行對比以探討不同月齡對骨缺損愈合的影響；為便于手術(shù)操作及誤差控制，未細化設(shè)置12 mm、14 mm、18 mm組等組別。

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Establishment of amodel of radial critical-size defect in juvenile rabbits．

Rui Min1，Zheng Xin1，WangFan2，Li Dongya1，Li Chenghu1，Cao Wei2，Liu Hong2，Guo Kaijin．1，Department of Orthopedics；2Department of Radiology，Affiliated Municipal Hospital，Xuzhou Medical University，Xuzhou 221000，China. Corresponding author：Guo Kaijin，E-mail：xzgkj＠sina.com

Objective To establish a radial defectmodel with different lengths and determine the optimal length of bone critical-size defects in juvenile rabbits.Methods Twenty healthy male New Zealand white rabbits aged 3 months（2.2～2.5 kg）were selected.And 15 mm and 20 mm radial bone defects were made randomly in bilateral radius respectively.Based upon defect length，radiuses were divided into group A（15 mm）and group B（20 mm）（n=20 each）.At Day 1 and 4-week intervals postoperatively，computed tomography（CT）scans were performed.The healing of bone defectwas evaluated with CT—Hedberg scores. The rabbits were sacrificed at12 weeks postoperatively and forearms were harvested for gross observations and histological analysis of new bone formation.Results All rabbits survived after operation.Continuous bridged callus with a smooth surfacewere observed in 19（95%）in group A.However，both endswere closed in group B and defect area was filled with fibrous tissue.In group A，perfectly plastic cortical bone was observed on CT images at12 weeks postoperatively.And small amountof calluswas found atboth ends and ulnar side of radius in group B with closed marrow cavity.CT—Hedberg score comparison showed a significant difference between groups A and B ateach timepoint postoperatively（3.0±0.6，3.9±0.3，4.0±0.2 vs1.6±0.5，2.7±0.6，2.9±0.6，P＜0.05）.Histological analysis showed that bone defect in group A had been repaired perfectly and neonatal revascularization was also present.In group B，the ends of defects were closed and defect area was filled with fibrous tissue.Conclusion A model of radial bone defecthas been established in juvenile rabbits.And 20 mm is themost ideal length.

Radius；Bones／IN；Models，Animal；Rabbits

2016—07—09）

（本文編輯：仇 君）

芮敏，鄭欣，王帆，等.幼兔橈骨臨界性骨缺損動物模型的建立［J］.臨床小兒外科雜志，2017，16（2）：189-193.

10.3969／j.issn.1671—6353. 2017.02.020.

Citing this article as：Rui M，Zheng X，Wang F，et al. Establishment of a model of radial-size defect in juvenile rabbits［J］.J Clin Ped Sur，2017，16（2）：189-193. DOI：10.3969／j.issn.1671—6353.2017.02.020.

10.3969／j.issn.1671—6353.2017.02.020

江蘇省衛(wèi)生計生委面上科研課題（H201528），江蘇省級重點研發(fā)專項資金項目（BE2015627），徐州市科技社會發(fā)展項目（KC15SH067）

1，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科（江蘇省徐州市，221000）；2，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市立醫(yī)院影像科（江蘇省徐州市，221000）

郭開今，E-mail：xzgkj＠sina.com