清熱解毒扶正顆粒對(duì)內(nèi)毒素大鼠肺腎組織NF—κBp65蛋白的影響

萬啟南++韋袞政 李黔云++祁燕++童曉云++陳維??

摘要：目的探討清熱解毒扶正顆粒對(duì)內(nèi)毒素大鼠肺腎組織NF-κBp65蛋白的影響。方法72只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、甲強(qiáng)龍組以及中藥低、中、高劑量組，采用腹腔注射脂多糖法建立大鼠內(nèi)毒素血癥模型。正常組對(duì)照組、模型對(duì)照組予生理鹽水1 mL/100 g灌胃，每天1次；甲強(qiáng)龍組給甲基強(qiáng)的松龍117 mg/100 g灌胃，每天1次；中藥組給清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量1 mL/100 g灌胃，每天1次；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用Western blotting法檢測(cè)大鼠肺、腎組織NF-κBp65蛋白的表達(dá)。結(jié)果模型對(duì)照組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常對(duì)照組，中藥高劑量組與甲強(qiáng)龍組較好地降低內(nèi)毒素大鼠肺、腎組織NF-κBp65蛋白水平，兩組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中藥低劑量組和中劑量組降低NF-κBp65蛋白水平的效果較差，與高劑量組和甲強(qiáng)龍組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論清熱解毒扶正顆粒能有抑制內(nèi)毒素大鼠肺腎組織NF-κBp65蛋白表達(dá)的效果，降低內(nèi)毒素血癥的炎癥反應(yīng)，對(duì)內(nèi)毒素有一定的治療作用。

關(guān)鍵詞：清熱解毒扶正顆粒；內(nèi)毒素血癥；NF-κB p65蛋白

中圖分類號(hào)：R2855文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）05-0016-05

[WT5HZ][JZ]Effects of Qingre Jiedu Fuzheng Granule on NF-κBp65 Protein in Lung-Kidney[JZ]Tissue of Endotoxin Rats

[WT5BZ][JZ]WAN Qi-nan， WEI Gen-heng， LI Qian-yun， QI Yan， TONG Xiao-yun， CHEN Wei

[WT5"BX][JZ]（Yunnan Hospital， Kunming of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， Yinnan）

[WT5HZ]【Abstract】[WTBZ]Objective： To study the effect of Qingre Jiedu Fuzheng Granule on NF-κBp65 protein in lung-kidney tissue of endotoxin rats. Methods： 72 rats were randomly divided into a normal control group， a model control group， a methylprednisolone group and low， medium and high dose groups of traditional Chinese medicine. Rat endotoxemia models were established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide method. The normal group and the model control group were given intragastric administration of 1 mL/100g of normal saline once daily. The methylprednisolone group was administrated 1.17 mg/100g of methylprednisolone once daily. The low， medium and high dose groups were administrated 1 mL/100 g of Qingre Jiedu Fuzheng Granule once daily. After the experiments were finished， the expression of NF-κBp65 protein in lung and kidney tissue of the rats was detected by Western blotting. Results： The level of NF-κBp65 protein in the model control group was significantly higher than that in the normal control group. The NF-κBp65 protein level in the lung and kidney of endotoxin rats of the high dose group and the methylprednisolone group decreased and there was no statistic difference between the two groups. The level of NF-κBp65 protein in the low dose group and the middle dose group decreased poorly， but compared with that of the high dose group and the methylprednisolone group， there was statistical difference. Conclusion： Qingre Jiedu Fuzheng Granule can inhibit the expression of NF-κBp65 protein in the lung and kidney of endotoxin rats， reduce the inflammatory reaction of endotoxemia and has certain curative effect on endotoxin.

[WTHZ]【Key words】[WTBZ]Qingrejiedu Fuzheng Granule， endotoxemia， NF-κB p65 protein

內(nèi)毒素血癥（ETM）是指循環(huán)血中出現(xiàn)可檢出的內(nèi)毒素的病癥。內(nèi)毒素血癥發(fā)生原因主要是在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下全身的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙，免疫機(jī)能下降，誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥及全身免疫反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致機(jī)體組織、細(xì)胞的損傷[1][2]。內(nèi)毒素血癥誘導(dǎo)的大量炎性介質(zhì)失控性釋放所致的全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS），以及進(jìn)一步惡化發(fā)展成為的多臟器功能失常綜合征（MODS）是嚴(yán)重感染患者走向死亡的主要途徑，而該惡性進(jìn)展的關(guān)鍵啟動(dòng)因子為內(nèi)毒素及其誘導(dǎo)的失控性釋放的大量炎性介質(zhì)。脂多糖（LPS）是常用的誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥的毒素。在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路中，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號(hào)通路的激活與多種致炎介質(zhì)釋放密切相關(guān)[3]。NF-κB位于TLR下游信號(hào)通路的樞紐位置，它是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，主要由P65和P50兩個(gè)亞基組成，在常態(tài)下，NF-κB存在于細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，與其抑制因子IκB結(jié)合。作為多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，不僅參與介導(dǎo)了免疫應(yīng)答、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖的多種基因的表達(dá)調(diào)控，而且在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用[4-5]。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子，白細(xì)胞介素等炎性分子刺激后，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，最終引起NF-κB的活化，并誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced NO synthase，iNO）、趨化因子如IL-8、巨噬細(xì)胞趨化因子（MDF）及趨化因子受體等多種炎性分子的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，反饋激活NF-κB，加劇了組織的損傷[6-7]。

內(nèi)毒素血癥與中醫(yī)學(xué)“熱毒”、“溫病”、“瘟疫”等病癥相類似，中醫(yī)藥對(duì)此類病癥有一定的療效，名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方清熱解毒扶正顆粒具有清熱解毒、涼血化瘀、益氣養(yǎng)陰的功效，對(duì)此類病癥有一定的效果。研究表明，清熱解毒扶正顆粒有明顯抑制炎性腫脹作用；明顯降低內(nèi)毒素所致家兔的高熱；降低內(nèi)毒素致高熱家兔的C-反應(yīng)蛋白水平。臨床研究表明，清熱解毒扶正顆粒能明顯降低老年肺炎患者升高的體液免疫指標(biāo)；降低升高的血白細(xì)胞、血清降鈣素原、C反應(yīng)蛋白水平，有顯著的抗感染作用。能降低慢性阻塞性肺疾病患者的二氧化碳分壓，提高其氧分壓，對(duì)外感高熱、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等具有較好的療效[8-12]。現(xiàn)從TLR信號(hào)通路研究清熱解毒扶正顆粒對(duì)NF-κB p65的影響，探討如下。

1材料和方法

11材料

111實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇合格清潔型Wistar大鼠（合格證號(hào)：SCXK{川}2013-24，001643）72只，體重（200±20）g。

112主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑脂多糖（LPS，Sigma公司，批號(hào)：L2630），兔抗大鼠NF-κBp65抗體（sigma公司，批號(hào)L2630），數(shù)碼凝膠圖象處理系統(tǒng)（GIS-2009型號(hào)）；超低溫冰箱（海爾立式BD370LT-86L-1型號(hào)）；離心機(jī)（10R，美國(guó)Thermo公司）；紫外分光光度計(jì)（UV-2450PC型號(hào)）；恒溫箱（3111，美國(guó)Thermo公司）。

113實(shí)驗(yàn)藥品清熱解毒扶正顆粒：由翼首草，荷葉頂，魚腥草，柴胡，葛根，太子參，麥冬，丹皮，薏苡仁等十四味藥組成。由云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房鑒定中藥制劑室制備。1 g相當(dāng)于原生藥126 g。低劑量組含生藥為05 g/ml，中劑量組含生藥為1 g/ml，高劑量組含生藥為2 g/ml，甲基強(qiáng)的松龍（國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，40 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030727）。

12方法

[KG（0.15mm]121模型制備72只大鼠進(jìn)行編號(hào)，依隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、正常組、模型對(duì)照組、西藥組。除正常組外，其余大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[1]采用腹腔注射脂多糖致大鼠內(nèi)毒素血癥模型。具體操作方法是先每日測(cè)量大鼠體溫（肛溫）2次，連續(xù)2日，取2次體溫的平均值記為基礎(chǔ)體溫。單次體溫超過38℃或2次體溫差超過05℃的大鼠剔除。實(shí)驗(yàn)前6 h禁食不禁水。然后腹腔注射LPS，誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)熱，注射LPS后每隔05 h測(cè)1次體溫，連續(xù)測(cè)8 h。體溫低于38℃的大鼠剔除。[KG）]

122藥物治療①正常組予生理鹽水1 mL/100 g體重灌胃，每天1次；②模型對(duì)照組予生理鹽水1 mL/100 g體重灌胃，每天1次；③西藥組給甲基強(qiáng)的松龍117 mg/100 g體重灌胃，每天1次；④中藥低、中、高劑量組分別給予清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量1 mL/100 g體重灌胃，每天1次；各組連續(xù)灌胃28 d。

123實(shí)驗(yàn)標(biāo)本處理4周后（28 d）麻醉大鼠，解剖打開大鼠腹腔，腹主動(dòng)脈穿刺放血至大鼠死亡，剝離左腎臟外膜，切取左腎，解剖打開胸腔，分離肺組織器官，切取左上肺葉。腎、肺標(biāo)本置無菌試管中-20℃保存在。

13Western blotting檢測(cè)分別取各組肺、腎組織，用冷PBS液沖洗，在添加有蛋白酶抑制劑裂解液中勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)至無菌聚丙烯離心管中，經(jīng)超聲震蕩，離心提取總蛋白，分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。分別取各樣本總蛋白50 ug用聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后電轉(zhuǎn)移法至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室溫下將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉1h，然后加人兔抗大鼠NF-κBp65及內(nèi)參對(duì)照GAPDH的抗體，4℃過夜。室溫下TBST漂洗PVDF膜，加人用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗在室溫下孵育1h。TBST再次漂洗PVDF膜，ECL試劑盒化學(xué)熒光法覆蓋條帶，全自動(dòng)曝光機(jī)曝光，數(shù)碼凝膠圖象處理系統(tǒng)測(cè)定目的條帶的光密度值，進(jìn)行定量分析，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

14統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3/8]±s）表示，采用One-K-S檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；樣本方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較；方差不齊者采用兩個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)使用SPSS190統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在肺、腎組織中，低劑量組與中劑量組比較，2組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；低劑量組與高劑量組比較，高劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著低于低劑量組（P<005）；高劑量組更好地降低NF-κBp65蛋白水平；低劑量組與甲強(qiáng)龍組比較；甲強(qiáng)龍組NF-κBp65蛋白水平顯著低于低劑量組（P<001），甲強(qiáng)龍組較好地降低NF-κBp65蛋白水平；低劑量組與正常組比較，低劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常組（P<001）；低劑量組與模型組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；中劑量組與高劑量組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平明顯高于高劑量組（P<005），中劑量組降低NF-κBp65蛋白水平明顯低于高劑量組；中劑量組與甲強(qiáng)龍組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著高于甲強(qiáng)龍組NF-κBp65蛋白水平（P<005）；中劑量與正常組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常組（P<005）；中劑量與模型組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著低于模型組（P<005）。高劑量組與甲強(qiáng)龍組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005），降低NF-κBp65蛋白水平效果相當(dāng)；高劑量組與正常組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；高劑量組與模型組比較，高劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著低于模型組（P<001），高劑量組降低NF-κBp65蛋白水平的效果顯著；甲強(qiáng)龍組與正常組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；甲強(qiáng)龍組與模型組比較，甲強(qiáng)龍組NF-κBp65蛋白水平顯著低于模型組（P<001）；正常組與模型組比較；模型組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常組（P<001），造模后，NF-κBp65蛋白水平顯著升高。肺、腎組織NF-κBp65灰度值見表1，肺組織NF-κBp65蛋白表達(dá)見圖1，腎組織NF-κBp65蛋白表達(dá)見圖2。

3討論

在內(nèi)毒素炎癥反應(yīng)中，LPS激活TLR4通路目前主要有兩條公認(rèn)的信號(hào)途徑[13]：一條是髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴的信號(hào)通路；另一條是MyD88非依賴的信號(hào)通路。IL-1R受到IL-1刺激后，啟動(dòng)信號(hào)途徑招募的第一個(gè)銜接分子就是MyD88[14]。MyD88激酶作為IL-1R的銜接蛋白，募集下游的蛋白激酶IRAK，導(dǎo)致IRAK自身磷酸化；磷酸化IRAK與TRAF6結(jié)合，TRAF6活化引起兩條不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一條包括P38MAPK和JNK通路在內(nèi)的MAPK信號(hào)通路，另一條是NF-κB通路，NF-κB作為一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)激活后，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，并激活細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而產(chǎn)生大量的致炎因子如TNF-α、NO、COX-2等，引起組織炎癥反應(yīng)性損傷。TLR4/NF-κB通路是啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的經(jīng)典通路，NF-κB是細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)傳導(dǎo)中關(guān)鍵性炎癥因子。阻斷內(nèi)毒素炎性反應(yīng)信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制炎性因子的釋放，促進(jìn)炎性因子的阻斷將對(duì)內(nèi)毒素炎性反應(yīng)有重要的治療作用。

[KG（0.15mm]中醫(yī)藥治療內(nèi)毒素血癥既有直接的拮抗內(nèi)毒素作用，更有其顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫對(duì)內(nèi)毒素的解毒功效[15]。本研究從TLR4信號(hào)通路中針對(duì)NF-κBp65炎癥反應(yīng)信號(hào)環(huán)節(jié)進(jìn)行探討，結(jié)果顯示，脂多糖腹腔注射后，大鼠的肺腎組織NF-κBp65蛋白水平比正常組顯著增高，清熱解毒扶正顆粒低劑量組、中劑量組降低NF-κBp65蛋白水平較較弱，而高劑量組有效降低內(nèi)毒素大鼠NF-κBp65蛋白水平，其效果與甲強(qiáng)龍相當(dāng)，比低劑量組、中劑量組顯著增強(qiáng)，存在量效關(guān)系。清熱解毒扶正顆粒能夠抑制炎癥反應(yīng)引起的NF-κBp65激活、轉(zhuǎn)錄，從而降低由于NF-κBp65激活導(dǎo)致的下游多種炎性因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-а、NO、COX-2、MDF等炎性介質(zhì)激活、釋放，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)，減輕組織炎性損傷。復(fù)方中藥療效是多成分的效應(yīng)，可多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)地發(fā)揮作用。清熱解毒扶正顆粒對(duì)內(nèi)毒素血癥的療效途徑包含了NF-κBp65信號(hào)通路，其效果與甲強(qiáng)龍相似，提示清熱解毒扶正顆粒與甲強(qiáng)龍有類似的信號(hào)通路作用機(jī)制，至于其如何對(duì)NF-κBp65產(chǎn)生抑制作用，有待進(jìn)一步研究。[KG）]

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