尿激酶對腦組織影響的研究進展

趙巖+++呂涌濤

[摘要] 尿激酶型纖溶酶原激活物，簡稱尿激酶（uPA）是纖溶酶原的主要激活物之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)尿激酶在多種病理和生理過程中發(fā)揮了重要作用，包括創(chuàng)傷愈合、組織再生、細胞遷移，特別是癌癥轉(zhuǎn)移和血管生成等多種病理和生理過程。同時，尿激酶在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中廣泛應(yīng)用，包括溶栓和顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺術(shù)中作為血腫液化劑使用。結(jié)合筆者工作，本文對尿激酶對腦組織的影響進行綜述。

[關(guān)鍵詞] 尿激酶；腦組織；神經(jīng)損傷修復(fù)；腦損傷；研究進展

[中圖分類號] R74 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（b）-0043-04

[Abstract] Urokinase type plasminogen activator （uPA） is one of the major activators of plasminogen. Recent studies have found that urokinase played an important role in physiological and pathological processes， including wound healing， tissue regeneration， cell migration， especially the physiological and pathological process of cancer metastasis and angiogenesis. At the same time， urokinase is widely used in the nervous system diseases， including the use of thrombolysis and intracranial hematoma minimally invasive surgery as a hematoma liquefaction agent. In this paper， the effects of urokinase on brain tissue were reviewed.

[Key words] uPA； Brain tissues； Repair of nerve injury； Brain injuries； Research progress

尿激酶型纖溶酶原激活物，簡稱尿激酶（urokinase，uPA）是纖溶系統(tǒng)的重要一員。uPA是一種特異性絲氨酸蛋白酶，可以被多種類型細胞合成，它可將不具有絲氨酸蛋白酶活性的纖溶酶原激活為具有絲氨酸蛋白酶活性、能溶解纖維蛋白的纖溶酶，對預(yù)防形成血栓和維持血流通暢很重要。目前uPA價格便宜，在國內(nèi)廣泛使用，且在顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)中作為血腫液化劑廣泛使用，其能夠?qū)⒀[快速溶解、引流，可明顯降低顱內(nèi)高壓，減輕對周圍腦組織的損害，減少腦疝的發(fā)生。uPA在國內(nèi)臨床應(yīng)用廣泛，然而關(guān)于uPA對腦組織影響的基礎(chǔ)研究較少，故本文主要對uPA的結(jié)構(gòu)、在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用、對腦組織的影響及臨床應(yīng)用進行綜述。

1 uPA的結(jié)構(gòu)研究

uPA是由中性粒細胞、單核細胞、成纖維細胞、上皮細胞、腫瘤細胞等多種類型的細胞合成和分泌的一種尿激酶原（pro-uPA），然后被纖溶酶、組織蛋白酶等激活成為一種絲氨酸蛋白水解酶，能催化纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，進而對纖維蛋白溶解、細胞外基質(zhì)降解等一系列病理生理過程起到重要調(diào)節(jié)作用。uPA基因位于第10號染色體長臂（10q24-qter），大小為6.4 kb，細胞首先合成的單鏈酶原形式的uPA[1]，其相對分子量為50～55 kD，由2個二硫鍵橋連的多肽鏈連接成A鏈（輕鏈）和B鏈（重鏈）。A鏈的氨基末端包含與受體結(jié)合的氨端片段（ATF，氨基酸Ser），ATF本身包含N端表皮生長因子結(jié)構(gòu)域（growth factor domian，GFD），其在氨基酸的12和32位之間負責(zé)與細胞表面特異性受體（uPA receptor，uPAR）結(jié)合。B鏈的羧基末端包含1個含有水解催化活性的絲氨酸蛋白酶片段（氨基酸Leu），其在氨基酸第179～184位之間為PAI-1的結(jié)合部位。uPA在第50～131位氨基酸殘基之間含有3對鏈內(nèi)二硫鍵，肽鏈折疊盤曲成一個環(huán)柄狀結(jié)構(gòu)為環(huán)柄狀結(jié)構(gòu)域（Kringle domain），也是uPA的一功能域。

2 uPA在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用

2.1 uPA與神經(jīng)元再生

uPA在神經(jīng)細胞再生、軸突生長及分支調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。Semina等[2]研究通過使用野生型和uPA缺陷小鼠的3D外植體背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)外源性uPA能顯著刺激WT和KO-uPA小鼠的神經(jīng)突向外生長。值得注意的是，與WT小鼠相比，來自KO-uPA小鼠的神經(jīng)節(jié)中的uPAR表達升高，并且KO-uPA外植體中的自發(fā)神經(jīng)突形成（神經(jīng)突長度）高于WT小鼠DRG。與WT小鼠相比，uPA的使用導(dǎo)致KO-uPA小鼠的DRG神經(jīng)突向外生長和神經(jīng)細胞遷移的影響顯著。這表明uPA有益于神經(jīng)突的起始、伸長和分支。uPA通過與uPAR相互作用而對細胞遷移和神經(jīng)軸突生長發(fā)揮作用，Semina等[2]使用Neuro 2A細胞培養(yǎng)物在體外使用uPA，觀察到軸突生長速率增加也證實這一點。

2.2 uPA與神經(jīng)損傷修復(fù)

陳沛等[3]曾試圖在面神經(jīng)斷傷修復(fù)模型的基礎(chǔ)上，使用外源性uPA，觀察uPA對斷傷后的面神經(jīng)修復(fù)的影響。結(jié)果顯示，加入uPA后，新生神經(jīng)纖維髓鞘面積恢復(fù)的更大，纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）表達增強。其認為可能的原因是uPA能去除纖維蛋白間接抑制炎性反應(yīng)來抑制損傷。與此同時，uPA通過對施萬細胞移行、分化發(fā)揮正性調(diào)節(jié)，促使分化成為髓鞘[4]。2014年，張倩等[5]在建立大鼠慢性高眼壓青光眼模型的基礎(chǔ)上，腹腔注射uPA和等量生理鹽水進行對照，結(jié)果顯示，uPA組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞數(shù)目明顯高于對照組，而且在超微結(jié)構(gòu)上，uPA組毛細血管壁的完整性明顯高于對照組。這幾位研究者分析uPA對視神經(jīng)的這種保護作用可能是其通過改善視網(wǎng)膜的微循環(huán)，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，增強視神經(jīng)軸突的修復(fù)作用。

2.3 uPA與血腦屏障

MMP-9主要由中性粒細胞、血管內(nèi)皮細胞、單核細胞、平滑肌細胞、星形膠質(zhì)細胞、巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞等分泌。MMP-9主要降解Ⅳ和Ⅴ型膠原、彈性蛋白、明膠及層粘連蛋白等參與腦血管病的病理生理過程。

腦缺血灌注后，在炎性細胞因子、激素、生長因子刺激下，MMPs能夠提高神經(jīng)細胞的凋亡速度，水解基膜下細胞外基質(zhì)成分蛋白同時增加血管通透性以及破壞血管完整性，并通過攻擊血腦屏障，導(dǎo)致腦出血和腦水腫以致病情加重[6]。2005年，國外研究者發(fā)現(xiàn)uPA可增加動脈MMP-9的含量及活性[7]。2009年，李杰等[8]采用自體血栓塞大腦中動脈制備大鼠大腦中動脈閉塞模型，6 h靜脈注射rt-PA與uPA，分別用免疫組化的方法檢測大鼠腦組織中MMP-9的表達水平。結(jié)果顯示在uPA溶栓后，MMP-9的表達水平明顯升高，進一步增加血腦屏障的通透性。2009年，宋玉強等[9]同樣在大鼠腦梗死模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)尾靜脈給予uPA后免疫組化法檢測腦組織的MMP-9表達水平，證實缺血后的級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的細胞因子可能誘導(dǎo)激活MMP-9，從而損傷血管內(nèi)皮的完整性，使血腦屏障通透性增高。

2.4 uPA與腦水腫

AQP-4是一種選擇性的水轉(zhuǎn)運蛋白，在腦組織中表達最豐富，主要分布于星形膠質(zhì)細胞膜表面，在神經(jīng)細胞上選擇性分布[10]。目前許多研究發(fā)現(xiàn)，AQP-4參加腦出血繼發(fā)的腦水腫過程[11]，且腦水腫程度與AQP-4的表達呈正相關(guān)。宋倩穎等[12]通過兔腦出血模型，給予不同濃度的uPA進行干預(yù)，采用免疫組化測AQP-4在腦水腫組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)AQP-4陽性細胞呈現(xiàn)先逐漸減少后增加的趨勢?？赡苁请S著uPA濃度增加，血腫溶解增多，減輕對周圍組織的壓迫，兔腦血腫周圍AQP-4陽性細胞的表達呈下降趨勢，但高濃度的uPA溶解血腫時會釋放血紅蛋白等代謝物質(zhì)，對血腦屏障通透性的破壞也隨之增強，高濃度的uPA對腦組織是否存在神經(jīng)毒性仍未可知。AQP-4在腦水腫過程的表達是動態(tài)的，不同時間階段起的作用仍然有待進一步研究。綜上所述，uPA干預(yù)后可以促進腦內(nèi)血腫的引流，但最佳的治療濃度仍然是討論焦點。

3 uPA在腦部損傷中的基礎(chǔ)研究

3.1 uPA與急性腦梗死

急性腦梗死是常見且危急程度極高的心腦血管疾病，嚴重影響到患者日后生存狀態(tài)尤其是質(zhì)量，因此對于腦梗死的臨床治療重視程度極高[13]。uPA是一種選擇性溶栓劑，其通過激活體內(nèi)的纖溶酶原變成纖溶酶，改善患者血流動力學(xué)。神經(jīng)細胞的骨架結(jié)構(gòu)微管相關(guān)蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP-2）主要存在于神經(jīng)細胞的細胞體和樹突中，對神經(jīng)元的發(fā)育、分化、神經(jīng)元突起的生長以及線粒體的軸突轉(zhuǎn)運發(fā)揮重要作用[14]。MAP-2減少，微管變形堆積、細胞骨架蛋白相互異常反應(yīng)，導(dǎo)致軸突轉(zhuǎn)運發(fā)生障礙以及神經(jīng)元功能障礙，是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的原因[15]。2005年，常麗英等[16]制作大腦中動脈閉塞模型，造模成功30 min后靜脈注射uPA進行溶栓，觀察uPA溶栓對MAP-2的影響。該研究病理學(xué)結(jié)果顯示，溶栓后梗死區(qū)域明顯縮小，神經(jīng)元的損傷顯著減輕。免疫組化結(jié)果表明，溶栓后MAP-2丟失的程度明顯減小。其分析uPA溶栓改善神經(jīng)功能的機制可能是：uPA溶栓治療使得閉塞的血管再通，挽救缺血半暗帶的腦組織，抑制缺血缺氧引起的鈣離子內(nèi)流、酸中毒等病理生理過程的進展，繼而減少MAP-2降解改善神經(jīng)功能。

3.2 uPA與腦復(fù)蘇

腦組織幾乎沒有能量的儲存，循環(huán)的血流連續(xù)不斷的為大腦提供氧和葡萄糖保證腦組織的能量供應(yīng)。全腦缺血后，很快出現(xiàn)氧和能量代謝衰竭，造成腦細胞和毛細血管壁受損，細胞內(nèi)鈣超載，氧自由基產(chǎn)生增加，激活膜上的磷脂酶A2，使膜磷脂分解，生成大量的花生四烯酸，再經(jīng)環(huán)氧酶途徑形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物PCG2和PGH2，前者經(jīng)TXA2合成酶催化形成TXA2，后者則生成PGI2，TXA2大量合成，致PGI2/TXA2比例失調(diào)，凝血機制紊亂，加之血小板功能異?？哼M，血小板聚集和黏附，使血液處于高凝狀態(tài)，以致于形成血栓[17]。郭曉東等[18]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心跳、呼吸驟停5、8 min復(fù)蘇后，腦內(nèi)血管有大量血栓形成，這不利于重建有效的腦血液循環(huán)。窒息5、8 min兩組大鼠在開始復(fù)蘇時給予uPA治療后，兩組大鼠腦神經(jīng)細胞損傷程度均較未用藥的對照組減輕，其中窒息5 min后用uPA組顯示出腦細胞壞死程度明顯低于未用uPA組。窒息8 min后用uPA復(fù)蘇組的神經(jīng)缺陷評分也顯示明顯低于未用uPA組，提示在心肺復(fù)蘇早期應(yīng)用uPA可以減輕因缺血造成的腦神經(jīng)細胞損害，降低復(fù)蘇后遺留的神經(jīng)缺陷。

3.3 uPA與腦出血

在顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)中，最早應(yīng)用的血腫液化劑是uPA。從國內(nèi)大量的臨床研究中可發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)聯(lián)合應(yīng)用uPA可以有效清除腦內(nèi)血腫[19-20]。基礎(chǔ)實驗方面，2016年，Tan等[21]將成年雄性SD大鼠自體血注入尾狀核。大鼠顱內(nèi)血腫內(nèi)隨機注射uPA、阿替普酶、生理鹽水。通過血腫和腦水腫，腦組織含水量、伊萬斯藍色熒光和神經(jīng)功能評分、MMPs、基質(zhì)金屬蛋白酶的mRNA，血腦屏障緊密連接蛋白及核因子B來評價在腦出血血腫溶解過程中這2種藥物的作用。結(jié)果顯示與阿替普酶比較，uPA能更好地改善腦水腫，改善腦出血預(yù)后，更有效地增加血腦屏障緊密連接蛋白的表達。有研究曾利用兔的腦出血模型，觀察不同uPA濃度對腦出血血腫及血腫周圍HO-1表達的影響，發(fā)現(xiàn)uPA濃度在5萬U/mL時可明顯增加兔腦血腫溶解的體積，兔腦出血血腫周圍的腦含水量增加，HO-1的表達也增多，兔腦血腫周圍腦含水量和HO-1陽性細胞數(shù)在3萬U/mL組最低[22-23]。這兩項研究都證明uPA濃度越高，血凝塊溶解的效果越好；同時高濃度uPA會加重血腫周圍腦組織的含水量和HO-1的表達。

神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）是一種與糖酵解過程有關(guān)的生物酶，共有αα、αβ、αγ、ββ、γγ五種同工酶，其中γγ存在于神經(jīng)元細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中[24]。在腦出血時，神經(jīng)元細胞膜的完整性受到破壞，NSE不與細胞內(nèi)肌動蛋白結(jié)合，從細胞內(nèi)釋放出來病迅速進入細胞間隙，通過血腦屏障進入外周循環(huán)，所以在腦出血后，血腫周圍組織NSE蛋白表達明顯增強[25-26]。國外研究者認為NSE具有保護、營養(yǎng)神經(jīng)元的作用[27]。 2016年李兆星等[28]用Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)建立大鼠腦出血模型，模型建立10 h后，向血腫腔內(nèi)注入5 μL含3000 UuPA的溶液來溶解血凝塊，2 h進行立體定向顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)，用免疫組化法和Western blot分別檢測NSE蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血腫內(nèi)注射uPA并進行立體定向抽吸血腫后，大鼠血腫周圍腦組織NSE蛋白表達情況降低。在腦出血早期進行顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)的同時使用uPA作位血腫液化劑，可較好地清除顱內(nèi)血腫，降低腦組織NSE蛋白的表達，從而保護神經(jīng)組織。

4 展望

通過對uPA不斷的深入研究，近年來研究者發(fā)現(xiàn)uPA在神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生、軸突生長、分支生長、神經(jīng)損傷修復(fù)、腦復(fù)蘇、腦水腫的發(fā)生和發(fā)展中都發(fā)揮一定的作用。大量的臨床對照研究也證實顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)聯(lián)合血腫液化治療方案在腦出血治療方面的有效性，但在顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)的臨床應(yīng)用中，選擇uPA作為血腫液化劑也存在一些討論熱點：首先選擇uPA作為血腫液化劑，uPA本身對腦組織會不會產(chǎn)生損害？其次在微創(chuàng)術(shù)中使用uPA，uPA劑量使用不規(guī)范，使用濃度從5000～50 000 U/mL不等，有沒有一個合適的量效關(guān)系（uPA用量-腦出血量）指導(dǎo)uPA的用量？在顱內(nèi)血腫微創(chuàng)穿刺清除術(shù)的臨床應(yīng)用中，uPA作為局部用藥缺少在腦內(nèi)代謝的相關(guān)研究。uPA在使用過程中存在的這些爭議，需進一步研究，尋找更優(yōu)良的使用方法和使用劑量。

[參考文獻]

[1 Pyke C，Kristensen P，Ralfkiaer E，et al. Urokinase-type plasminogen activator is expressed in stromal cells and its receptor in cancer cells at invasive foci in human colon adenocarcinomas [J]. Am J Pathol，1991，138（5）：1059-1067.

[2] Semina E，Rubina K，Sysoeva V，et al. Urokinase and urokinase receptor participate in regulation of neuronal migration，axon growth and branching [J]. EurJ Cell Biol，2016， 95（9）：295-310.

[3] 陳沛，龔樹生，宋鵬，等.尿激酶型纖溶酶原激活劑對大鼠面神經(jīng)損傷修復(fù)的影響[J].臨床耳鼻咽喉科雜志，2004， 18（10）：623-626.

[4] Akassoglou K，Yu WM，Akpinar P，et al. Fibrin inhibits peripheral nerve remyelination by regulating Schwann cell differentiation [J]. Neuron，2002，33（6）：861-875.

[5] 張倩.尿激酶對慢性青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用[D].新鄉(xiāng)：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，2014.

[6] Ebben HP，Nederhoed JH，Slikkerveer J，et al. Therapeutic application of contrast-enhanced ultrasound and low-dose urokinase for thrombolysis in a porcine model of acute peripheral arterial occlusion [J]. J Vasc Surg，2015，62（2）：477-485.

[7] Solomatina MA，Plekhanova OS，Men shikova MY，et al. Urokinaseincreases the content and activity of matrix metalloproteinases 2 and 9 during in vivo constrictive arterial remodeling [J]. Bull Exp Biol Med，2005，139（3）：283-286.

[8] 李杰，李光勤，蔣國會. rt-PA與尿激酶溶栓治療對MMP-9和血腦屏障通透性的影響[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2009，9（5）：445-449.

[9] 宋玉強，畢建忠.低頻超聲輔助尿激酶溶栓對大鼠腦梗死基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，47（12）：50-57.

[10] 林峰，吳江.腦水腫與通道蛋白4的關(guān)系及進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9（10）：17-19.

[11] 歐陽錫華，賈軍，劉政委.腦外傷患者AQP-4的表達及其與臨床預(yù)后的關(guān)系[J].四川醫(yī)學(xué)，2012，33（4）：676-677.

[12] 宋倩穎，尚冰冰，孫樹杰，等.腦出血后不同濃度尿激酶對水通道蛋白-4表達的影響[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2012， 2（24）：22-24.

[13] 孟翀，蘇麗君.低分子肝素鈉聯(lián)合小劑量尿激酶在腦血栓形成治療中的臨床分析[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11（19）：530-532.

[14] Walter E，Kaufmann，Shawn M，et al. Dendritic cytoskeletal protein expression in mental retardation：an immunohistochemical study of the neocortex in rett syndrome [J]. Cerebral Cortex，2000，10（10）：992-1004.

[15] Jiang W，Gu W，BrannstromT，et al. Cortical neurogenesis in adult rats after transient middle cerebral artery occlusion [J]. Stroke，2001，32（5）：1201-1207.

[16] 常麗英，趙惠，張?zhí)K明，等.溶栓治療對腦梗死大鼠細胞骨架結(jié)構(gòu)微管相關(guān)蛋白-2的影響[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2005，13（6）：446-449.

[17] 田京偉，蔣王林，王振華，等.紅花總黃酮對大鼠局部腦缺血及血栓形成的影響[J].中草藥，2003，34（8）：741-743.

[18] 郭曉東，馬立芝，高進，等.尿激酶對大鼠心肺復(fù)蘇后腦神經(jīng)細胞損傷及微血栓影響的實驗研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22（7）：752-754.

[19] Sun H，Liu H，Li D，et al. An effective treatment for cerebral hemorrhage：minimally invasive craniopuncture combined with urokinase infusion therapy [J]. Neurol Res，2010，32（4）：371-377.

[20] 黃佳勇，張英育，陳曉海，等.不同術(shù)式選擇治療高血壓腦出血198例臨床分析[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2014， 17（2）：69-71.

[21] Tan Q，Chen Q，Niu Y，et al. Urokinase，a promising candidate for fibrinolytic therapy for intracerebral hemorrhage [J]. J Neurosurg，2017，126（2）：548-557.

[22] 安輝.尿激酶濃度改變對兔腦出血血腫及血腫周圍HO-1表達的影響[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2011.

[23] 陳穎.不同濃度尿激酶溶解兔腦血腫對血腫周圍水通道蛋白-4表達的影響[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2011.

[24] Soh M，Dunlevy JR，Garrett SH，et al. Increased neuron specific enolase expression by urothelial cells exposed to or malignantly transformed by exposure to Cd2 + or As3 + [J]. Toxicol Lett，2012，212（1）：66-74.

[25] Goede A，Dressler J，Sommer G，et al. Wound age diagnostics after fatal traumatic brain injury. Expression of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein in brain tissue [J]. Rechtsmedizin，2015，25（4）：261-267.

[26] Geisen U，Benk C，Beyersdorf F，et al. Neuron-specific enolase correlates to laboratory markers of haemolysis in patients on long-term circulatory support [J]. Eur J Cardiothorac Surg，2015，48（3）：416-420.

[27] Gonzalez-Garcia S，Gonzalez-Quevedo A，Pena-Sanchez M，et al. Serum neuron-specific enolase and S100 calcium binding protein B biomarker levels do not improve diagnosis of acute stroke [J]. JR Coll Physicians Edinb，2012， 42（3）：199-204.

[28] 李兆星，王亞男，王曉瑛，等.立體定向抽吸術(shù)對大鼠腦出血后NSE表達的影響[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2016，14（5）：739-742.

（收稿日期：2017-01-07 本文編輯：李岳澤）