RSK 4與TRAF4在不同乳腺細胞中的表達及分子作用通路研究

楊寧朱佳郇雪潔伍越楊華偉

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺一區(qū)；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

林歡1，2朱小東1，3，4陳澤曇1，2李齡1，3，4曲頌1，3，4趙偉1，3蘇芳1，3韋靜妮1，3梁忠國1，3莫柒艷1，2武江波1，2蒙慧玲1，2

基礎(chǔ)研究

RSK 4與TRAF4在不同乳腺細胞中的表達及分子作用通路研究

楊寧1，2朱佳1，2郇雪潔1，2伍越1，2楊華偉1

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺一區(qū)；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院

目的 研究抑癌基因p90核糖體S6蛋白激酶4（p90 ribosomal protein S6 kinase 4，RSK4）相互作用蛋白與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4（tumor necrosis factor receptor associated factor 4，TRAF4）在不同乳腺細胞株中的表達，探討RSK4-TRAF4相互作用蛋白所在分子作用通路對乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測RSK4和TRAF4在HBL-100正常乳腺細胞株和MCF-7、H er-2陽性型、MDA-MB-231人乳腺癌細胞株中的表達情況。用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測RSK4和TRAF4以及MAPK通路下游蛋白ERK1/2在HBL-100、MCF-7、H er-2陽性型、MDA-MB-231 4種乳腺細胞株中的表達。結(jié)果 RSK4mRNA、TRAF4mRNA在4種細胞中均表達，RSK4mRNA在HBL-100表達量最高，在MCF-7、H er-2陽性型、MDA-MB-231細胞中含量依次降低；TRAF4mRNA在4種細胞中的表達量由低到高依次為HBL-100、MCF-7、H er-2陽性型、MDA-MB-231細胞，RSK4mRNA、TRAF4mRNA在4種細胞中兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RSK4與TRAF4在4種細胞中蛋白表達水平與mRNA表達水平相一致，具有高度相關(guān)性（rRSK4＝0.92，P＜0.01；rTRAF4＝0.82，P＜0.01）；ERK1/2蛋白表達量由高到低依次為MDA-MB-231、H er-2陽性型、MCF-7、HBL-100。在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，RSK4和TRAF4表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)（r1＝－0.81，P＜0.01）；在蛋白翻譯水平，RSK4和TRAF4同樣呈現(xiàn)出高度負(fù)相關(guān)（r2＝－0.84，P＜0.01）。結(jié)論 RSK4和TRAF4具有較高的負(fù)相關(guān)性，RSK4與TRAF4相互作用后可能通過MAPKs下游信號通路ERK起分子調(diào)控作用。

乳腺腫瘤；人乳腺癌細胞株；p90核糖體S6蛋白激酶4；腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4；ERK信號通路

近年來，我國乳腺癌發(fā)病率明顯上升，每年新增達3%～4%，超過世界水平（1%～2%）。在北京、上海、廣州等經(jīng)濟發(fā)地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率居首位［1］。乳腺癌是多基因共同作用的異質(zhì)性較強的全身性疾病。抑癌基因p90核糖體S6蛋白激酶4（p90 ribosomal protein S6 kinase 4，RSK4）作為絲裂酶原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）信號通路下游重要的調(diào)控因子在癌癥中的作用越來越受重視。研究表明，RSK4可能是乳腺癌抑癌基因，具有負(fù)性調(diào)控細胞的功能，干擾表達后可加速乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力［2］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，RSK4與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4（tumornecrosis factor receptorassociated factor 4，TRAF4）存在蛋白質(zhì)相互作用［3］，因此，我們設(shè)想RSK4-TRAF4蛋白質(zhì)復(fù)合物可能通過MAPKs通路下游細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）起分子調(diào)控作用。本研究擬初步確定RSK4、TRAF4和ERK1/2在4種乳腺細胞株中的表達水平及兩者的相關(guān)性，探討RSK4-TRAF4相互作用蛋白所在分子通路對乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7、H er-2陽性型和正常乳腺細胞株HBL-100均購自上海中科院研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、PBS購自Gibico公司，胎牛血清購自BI公司，Trizol購自美國 Invitrogen公司；實時熒光定量PCR試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本Takara公司；RSK4引物、TRAF4引物和GAPDH引物由Takara南寧代理科迪公司合成；RIPA蛋白裂解液、蛋白上樣緩沖液和二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、ECL熒光化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天公司；抗RSK4、GAPDH單克隆抗體購自Abcam公司；TRAF4抗體購自Santa cruz公司；HRP標(biāo)記抗小鼠二抗、兔二抗購自上?？党忌锕?；熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；大型多功能分光光度計購自美國法馬西亞公司；實時熒光定量PCR儀和高速多功能冷凍離心機購自美國Thermo公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自英國Syngene公司；水平電泳儀槽、垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜設(shè)備購自北京六一廠；顯影設(shè)備購自BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%C O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDA-MB-231、MCF-7細胞。將H er-2陽性型和HBL-100細胞株培養(yǎng)于含有15%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%C O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達到80%左右時，進行細胞傳代。1.2.2 實時熒光定量PCR檢測4種細胞中RSK4和TRAF4mRNA的表達 取對數(shù)生長期的細胞，按Trizol法提取細胞總RNA，依照實時熒光定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫結(jié)合Primer 6.0軟件設(shè)計引物（由Takara南寧代理科迪公司合成），引物序列及長度見表1。

表1 相關(guān)引物序列

根據(jù)SYBR Premix Ex Taq（TliRNaseH Plus）試劑盒操作說明書，反應(yīng)體系為25μL，SYBR 12.5μL，上下游引物各1μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，cDNA 2μL，雙蒸水8μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s，變性95℃5 s，退火62℃30 s，共40個循環(huán)，每孔設(shè)計3個重復(fù)孔。Ct值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)，按公式分別計算每組ΔCt，以MDA-MB-231細胞 mRNAΔCt作為參照，RSK4 mRNA的相對表達量為2-ΔΔCt。ΔCt＝Ct平均值（RSK4）-Ct平均值（GAPDH），ΔΔCt＝ΔCt（MCF-7/H er-2陽性型/HBL-100組）-ΔCt（MDA-MB-231組）。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測RSK4、TRAF4、ERK1/2蛋白的表達 待細胞長至90%時，用PBS沖洗3次，加入以1（蛋白酶抑制劑）∶50（蛋白裂解液）比例配好的溶液，提取細胞總蛋白，用BCA法測定每組的蛋白濃度。以10%SDS-PAGE進行電泳，用0.22μm孔徑硝酸纖維素膜進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，孵RSK4一抗（1∶10 000）、TRAF4抗體（1∶1 000）、ERK1/2抗體（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶10 000）于4℃搖床過夜。TBST洗滌30min，二抗室溫孵育1 h。洗膜后ECL試劑發(fā)光，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行密度掃描后進行灰度分析，以RSK4蛋白與GAPDH蛋白條帶的灰度比值反應(yīng)RSK4蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計量資料用t檢驗，兩兩比較用LSD檢驗，相關(guān)分析采用Pearson檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種細胞RSK4 mRNA、TRAF4mRNA的表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果如表2所示。

HBL-100、MCF-7、H er-2陽性型細胞分別與MDA-MB-231細胞比較，*P＜0.01

圖1 RSK 4 mRNA在4種細胞中的表達

圖2 TRAF4 mRNA在4種細胞中的表達

2.2 Western blot檢測4種細胞中RSK4、TRAF4和ERK1/2蛋白的表達

4種細胞中TRAF4和ERK1/2蛋白的表達結(jié)果如圖3，RSK4蛋白的灰度值依次為0.789±0.010、0.683± 0.013、0.602±0.015和0.526±0.006，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝391.8，P＜0.0001）。TRAF4蛋白的灰度值依次為 0.682±0.036、0.744±0.057、0.817±0.059和 0.890± 0.058，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝11.44，P＝0.0008）。RSK4、TRAF4、ERK1/2 3種蛋白在4種細胞中的表達分別兩兩比較，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RSK4蛋白表達含量由高到低依次為HBL-100、MCF-7、H er-2陽性型、MDA-MB-231細胞；TRAF4蛋白表達含量由高到低依次為MDA-MB-231、H er-2陽性型、MCF-7、HBL-100；ERK1/2蛋白表達量由高到低依次為MDAMB-231、H er-2陽性型、MCF-7、HBL-100。

圖3 4種細胞目的蛋白條帶圖

2.3 RSK4、TRAF4mRNA與其蛋白表達的相關(guān)性

在4種乳腺細胞中，RSK4 mRNA含量與RSK4蛋白表達量一致，前者表達越高，后者表達亦高，兩者呈正相關(guān)（rRSK4＝0.92，P＜0.01）。TRAF4mRNA與TRAF4蛋白表達也成正相關(guān)（rTRAF4＝0.82，P＜0.01）。見圖4、圖5。

圖4 RSK 4 mRNA與其蛋白表達的相關(guān)性

圖5 TRAF4m RNA與其蛋白表達的相關(guān)性

2.4 RSK4和TRAF4表達的相關(guān)性

RSK4 mRNA和TRAF4 mRNA兩者成負(fù)相關(guān)（r1＝－0.81，P＜0.01）。在蛋白翻譯水平，兩者也表現(xiàn)出高度負(fù)相關(guān)（r2＝－0.84，P＜0.01）。見圖6、圖7。

圖6 RSK 4 mRNA和TRAF4 mRNA表達的相關(guān)性

圖7 RSK 4蛋白和TRAF4蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

目前研究表明RSK4可以抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，而RSK4是RAS-MAPKs中重要的信號分子，能調(diào)控下游ERK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，RSK4酶活性主要來自Ser389和Ser232的磷酸化，是MAPKs ERK途徑中主要的下游底物［4］，可以被MAPKs磷酸化激活，通過底物磷酸化抑制FGFR2-RAS-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及對特異靶點的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制細胞分裂生長和分化［5］，但是其具體調(diào)控機制尚未闡明。本課題組前期研究顯示RSK4與PRMT5為相互作用的蛋白，而PRMT5和TRAF4是分子伴侶，通過鋅指樣結(jié)構(gòu)相連接［6］。蛋白質(zhì)作為生命活動的基本物質(zhì)，其功能的實現(xiàn)離不開與其他蛋白質(zhì)相互作用。TRAF4最初在乳腺癌淋巴結(jié)組織中提取的mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫中經(jīng)過差異篩選得到，是一種含有環(huán)指結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶，在人類多種癌癥中過表達［7］，能調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的依賴型SMAD和非依賴型SMAD信號通路。上皮間質(zhì)性轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是乳腺癌發(fā)生發(fā)展中重要的改變。研究表明，TGF-β可通過誘導(dǎo)EMT這一進程而促進腫瘤細胞運動和轉(zhuǎn)移侵襲能力［8］。目前研究初步證實細胞中TRAF4高表達可促進TGF-β信號通路上游R-Smad活化水平而伴隨乳腺癌患者的不良預(yù)后［9］。ERK是細胞內(nèi)多條信號通路的樞紐，其活化與腫瘤細胞的增殖密切相關(guān)。多肽轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β可以通過各種方式激活RASMAPK-ERK通路，能抑制早期腫瘤的生長，一定程度上阻滯細胞周期和誘導(dǎo)細胞死亡，晚期則促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］。在多種癌癥中，RAS-MAPKs與TGF-β信號通路存在相互作用，共同影響腫瘤的發(fā)展［11-12］。TGF-β與RAS-MAPKs兩條信號通路的相互影響作用較龐大復(fù)雜，在乳腺癌中的具體機制尚不明確。本課題組前期通過質(zhì)譜分析-標(biāo)簽純化實驗，明確了RSK4與TRAF4為相互作用蛋白，我們設(shè)想RSK4-TRAF4蛋白質(zhì)復(fù)合物可能是聯(lián)系TGF-β與RAS-MAPKs信號通路的關(guān)鍵蛋白。本研究初步確定了RSK4、TRAF4和ERK1/2在不同乳腺細胞株中的表達水平及相關(guān)性。

實驗結(jié)果顯示，在乳腺癌MDA-MB-231細胞中，ERK1/2表達量增加，RSK4呈低表達，提示乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可能與ERK信號水平升高和RSK4含量降低有關(guān)。此外，TGF-β信號能激活RAS通路使ERK信號活性增高，促使腫瘤細胞表型從高分化向低分化過度［13］。由此我們猜測，在乳腺癌中RSK4和TRAF4具有負(fù)相關(guān)性，但通路機制有待研究。由于目前未有關(guān)于RSK4與TRAF4在乳腺癌方面的相關(guān)性研究，本實驗研究采用體外細胞培養(yǎng)、實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法等方法，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對人乳腺細胞株HBL-100、MCF-7、H er-2陽性型、MDA-MB-231進行檢測，探討其對乳腺癌的共同影響機制。結(jié)果顯示4株細胞均表達RSK4和TRAF4，且兩者成負(fù)相關(guān)性，在低侵襲性乳腺癌細胞中，RSK4表達量高，而TRAF4表達量低；在高侵襲性乳腺癌MDA-MB-231細胞中，則反之。本研究利用Weston b lot方法檢測了ERK1/2通路蛋白，結(jié)果顯示細胞表達量由高到低依次為MDA-MB-231、H er-2陽性型、MCF-7、HBL-100。在雌激素受體陰性的高侵襲性細胞系MDA-MB-231中，ERK含量最高，進一步證實了RSK4是R AS-ERK通路中一個重要的抑制因子，能抑制ERK通路的活化和對特異靶點的轉(zhuǎn)錄激活。阻斷ERK通路可以抑制TGF-β介導(dǎo)的R-Smad絲氨酸位點的磷酸化，并影響ERK-Smad 4異源多聚體復(fù)合物的形成，抑制細胞分裂生長和分化［14］。同時，TRAF4在低侵襲性MCF-7細胞中表達量較低，低表達量的TRAF4減弱了TGF-β/Smad對上皮間質(zhì)性轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)調(diào)控能力，減低了乳腺癌細胞的侵襲遷移能力。Zhang等［9］研究發(fā)現(xiàn)TRAF4擴增與ERBB2基因擴增有明顯相關(guān)性。在一個含有2 960例乳腺腫瘤患者的大型公共臨床基因芯片數(shù)據(jù)庫中［15］，發(fā)現(xiàn)高表達TRAF4的患者預(yù)后較差，在H er-2陽性患者中TRAF4高表達也預(yù)示著更差的預(yù)后，與本實驗結(jié)果一致，TRAF4的表達量在H er-2陽性型細胞較正常乳腺細胞HBL-100高。在一項實驗性腫瘤模型中，H er-2和TGF-β受體信號已被證明在促進腫瘤生存和轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同作用［16］。

總之，抑癌基因RSK4是ERK信號通路下游的關(guān)鍵作用分子，TRAF4主要調(diào)控TGF-β/Smad信號通路，而ERK通路在平衡TGF-β/Smad信號途徑中起重要作用且兩個信號通路間存在相互影響的現(xiàn)象。因此，我們推測RSK4-TRAF4蛋白質(zhì)復(fù)合物可能是聯(lián)系TGF-β與RAS-MAPKs信號通路的橋梁，兩者共同影響乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，但其機制尚需進一步研究探討。

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［2016-11-25收稿］［2017-01-13修回］［編輯 江德吉］

Expression of RSK 4 and TRAF4 in different breast cell lines and cross-talk mechanism

Yang Ning1，2，Zhu Jia1，2，Huan Xuejie1，2，Wu Yue1，2，Yang Huawei1（1Department of Breast Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Yang Huawei.E-mail:lordyhw@163.com

Objective To study the expression of tumor suppressor gene p90 ribosomal S6 kinase 4（RSK4）and the interacting protein tumor necrosis factor receptor-associated factor 4（TRAF4）in different human breast cancer cell lines，and to study the potential role of these proteins in breast cancer invasion and metastasis.M ethods Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）was used to detect themRNA expression of TRAF4 and RSK4 in four human breast cancer cell lines（HBL-100，MCF-7，Her-2-positive type，MDA-MB-231）.Western blotting was used to detect the expression of RSK4，TRAF4 and MAPK pathway proteins downstream of ERK1/2 protein in the same four breast cancer lines.Results RSK4 and TRAF4 mRNAswere expressed in all four cell lines；the highest expression was observed for RSK4 mRNA in HBL-100 cells.Expression of RSK4 mRNA was slightly lower in MCF-7，Her-2-positive type and MDA-MB-231 cells.Expression of TRAF4 mRNA followed the trend:HBL-100Her-2-positive type>MCF-7>HBL-100.RSK4 mRNA levels correlated negativelywith TRAF4mRNA levels（r1=-0.81，P<0.01），and the samewasobserved for protein levels（r2=-0.84，P<0.01）.Conclusions RSK4 and TRAF4 expression negatively correlate with each other，which may be mediated by MAPKs downstream of the ERK pathway.

Breast neoplasms；Human breast cell lines；p90 ribosomal S6 kinase 4；Tumor necrosis factor receptor-associated factor 4；ERK signaling pathway

基礎(chǔ)研究

林歡1，2朱小東1，3，4陳澤曇1，2李齡1，3，4曲頌1，3，4趙偉1，3蘇芳1，3韋靜妮1，3梁忠國1，3莫柒艷1，2武江波1，2蒙慧玲1，2

R737.9

A

1674-5671（2017）01-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.08

國家自然科學(xué)基金資助項目（81260394）

楊華偉。E-mail：lordyhw＠163.com

【共同第一作者】朱佳