不同抗生素和防腐劑對(duì)小球藻Chlorella sorokiniana細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

李亞軍　朱為菊　費(fèi)小雯　鄧曉東

摘要：[目的]分析不同抗生素和防腐劑對(duì)小球藻Chlorellasorokiniana細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，篩選出適宜的抗生素和防腐劑種類及其劑量，為建立小球藻C.sorokiniana無(wú)菌培養(yǎng)體系提供參考依據(jù)。[方法]在HSM培養(yǎng)基中分別添加10、20、40、60、80和100lag/mL抗生素，包括氯霉素、鏈霉素、青霉素、慶大霉素和頭孢噻肟，以及山梨酸鉀（50、100、150和200μg/mL）、乳酸鈉（0.5%、1.0%和2.0%）、富馬酸二甲酯（0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL）等防腐劑，培養(yǎng)3d后測(cè)定小球藻C.sorokiniana的細(xì)胞密度、葉綠素含量及光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（F_v/F_m）。[結(jié)果]添加10～100μg/mL青霉素或10～80μg/mL頭孢噻肟對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞密度、葉綠素含量和F_v/F_m的影響均不顯著（P>0.05，下同）；添加100μg/mL頭孢噻肟會(huì)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率為18.89%，并引起葉綠素含量和F_v/F_m極顯著下降（P<0.01，下同）。氯霉素、鏈霉素和慶大霉素等蛋白質(zhì)合成抑制類抗生素對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞的毒性較強(qiáng)，高于10μg/mL的鏈霉素和慶大霉素及高于20μglmL的氯霉素均極顯著抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的葉綠素含量和F_v/F_m也極顯著下降。3種防腐劑中，山梨酸鉀對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，添加200μg/mL山梨酸鉀還會(huì)促進(jìn)細(xì)胞葉綠素含量增加；乳酸鈉對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞有一定的毒性作用，其藻細(xì)胞密度、葉綠素含量和F_v/F_m隨添加濃度增加而降低；添加0.1～10.0μg/mL富馬酸二甲酯不影響小球藻C.sorokiniana的細(xì)胞密度及葉綠素含量，但F_v/F_m極顯著下降。[結(jié)論]建立小球藻C.sorokiniana無(wú)菌培養(yǎng)體系時(shí)宜選用青霉素和頭孢噻肟為抗生素、山梨酸鉀為防腐劑，其推薦使用濃度分別為青霉素100μg/mL、頭孢噻肟80μg/mL、山梨酸鉀200μg/mL。

關(guān)鍵詞：小球藻Chlorellasorokiniana；抗生素；防腐劑；細(xì)胞密度；葉綠素含量；F_v/F_m

中圖分類號(hào)：S963.213 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）11-2078-08

0引言

[研究意義]小球藻為一類單細(xì)胞真核生物，是綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬各種類的統(tǒng)稱，常見種類有普通小球藻（Chlorellavulgar-is）、橢圓小球藻（C.ellipsoidea）和蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）等，其變種可達(dá)上百種。因其富含蛋白質(zhì)、脂類、多糖和各種活性代謝產(chǎn)物，在醫(yī)藥保健、食品工業(yè)和水產(chǎn)動(dòng)物餌料等方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值（孔維寶等，2010；羅柳茵等，2016）。獲得小球藻純種資源是其推廣應(yīng)用的前提，但在藻種資源分離、培養(yǎng)及保存過(guò)程中，通常存在其他雜菌污染，而添加抗生素和防腐劑抑制雜菌生長(zhǎng)是獲得小球藻純種最有效的途徑。不同藻種對(duì)抗生素和防腐劑的耐受力也各不相同，因此，篩選出適宜的抗生素和防腐劑種類及其劑量是建立小球藻無(wú)菌培養(yǎng)體系的關(guān)鍵。[前人研究進(jìn)展]至今，已有10余種抗生素應(yīng)用于微藻的無(wú)菌化培養(yǎng)，如常見的氯霉素、氨芐青霉素和卡那霉素等。微藻對(duì)抗生素的敏感性與其種類密切相關(guān)。萊茵衣藻、柵藻、單針藻、埃氏小球藻對(duì)氯霉素較敏感，超過(guò)20μg/mL即可抑制藻類細(xì)胞生長(zhǎng)（楊芳芳等，2012；余旭亞等，2012；姜思等，2017；王亞君等，2017），但對(duì)普通小球藻和富油新綠藻不敏感，即使100μg/mL氯霉素也未影響其生長(zhǎng)（周文禮等，2009；張茜等，2016）。大多數(shù)藻種如小球藻、小硅藻、塔胞藻、雨生紅球藻、萊茵衣藻、富油新綠藻和波吉卵囊藻對(duì)氨芐青霉素和青霉素均不敏感，對(duì)卡那霉素則較敏感（岳偉萍，2005；李靜紅等，2009；張茜等，2016；姜思等，2017；王亞君等，2017；鄭凌凌等，2017）；但也有研究報(bào)道小球藻藻種Chlorellasp.對(duì)青霉素敏感（麻曉霞等，2011）。低劑量四環(huán)素會(huì)抑制萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，但富油新綠藻不受其影響（姜思等，2017）。此外，Guo等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，100μg/mL頭孢菌素（7-氨基頭孢霉烷酸）對(duì)小球藻、萊茵衣藻和麥可藻的生長(zhǎng)抑制率分別為12.0%、9.6%和11.7%；Teixeira和Granek（2017）通過(guò)對(duì)比等鞭金藻、微擬球藻和角毛藻對(duì)抗生素甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑的抗性，發(fā)現(xiàn)僅微擬球藻細(xì)胞生長(zhǎng)受這兩種抗生素的抑制。[本研究切入點(diǎn)]海南具有豐富的藻種資源，但可商業(yè)化利用的純?cè)宸N非常少，尤其從自然水體中分離獲得的藻種通常帶有很多其他雜菌，藻細(xì)胞生長(zhǎng)易受限制，且其培養(yǎng)液存儲(chǔ)時(shí)間非常短，一般3--4d即開始腐敗。因此，非常有必要在小球藻培養(yǎng)體系中添加抗生素和防腐劑以去除雜菌，進(jìn)而提高小球藻生長(zhǎng)速率和延長(zhǎng)藻液存儲(chǔ)時(shí)間。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]從自然水體中分離獲得一株小球藻，為推進(jìn)其在水產(chǎn)動(dòng)物餌料和食品添加劑領(lǐng)域中的應(yīng)用，而急需獲得純?cè)宸N。通過(guò)分析不同抗生素（氯霉素、鏈霉素、青霉素、慶大霉素和頭孢噻肟）和防腐劑（山梨酸鉀、富馬酸二甲酯和乳酸鈉）對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，篩選出適宜的防腐劑種類及其劑量，為建立小球藻無(wú)菌培養(yǎng)體系提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

小球藻藻種由農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用平板分離法從自然水體中分離得到，命名為HOC5。HSM培養(yǎng)基配方：NH4C10.50g/L、MgSO₄·7H₂O0.02g/L、CaCl₂·2H₂O0.01g/L、K₂HPO₄1.44g/L、KH₂PO₄0.72g/L和CH₃COOK2.00g/L。氯霉素、鏈霉素、青霉素、慶大霉素和頭孢噻肟購(gòu)自美國(guó)mmresco公司，其試驗(yàn)濃度梯度為10、20、40、60、80、100μg/mL，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次。山梨酸鉀、富馬酸二甲酯和乳酸鈉購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，其中，山梨酸鉀是根據(jù)GB2760-2014的相關(guān)規(guī)定，設(shè)50、100、150和200μg/mL4個(gè)濃度梯度；富馬酸二甲酯是參考吳暉等（2007）的方法，設(shè)0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL7個(gè)濃度梯度；乳酸鈉則根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)0.5%、1.0%和2.0%3個(gè)濃度梯度。

1.2DNA提取及藻種鑒定

將培養(yǎng)1周左右的藻種接種到50mL的HSM液體培養(yǎng)基中，于27℃下?lián)u床（230r/min）培養(yǎng)3d。5000r/min離心5min，收集藻種，并置于研缽中加入適量石英砂，液氮研磨。取適量藻粉置于2mL離心管中，加入150μL無(wú)菌水、300μLSDS抽提液（2%SDS、400mmol/LNa2EDTA、100mmol/LTris-HCl，pH8.0）和5μLRNase（20μL/μL），混勻后室溫靜置15min。12000r/min離心10min，取上清液，以苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）和氯仿：異戊醇（24：1）依次各抽提一次。抽提獲得的DNA用無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌一次后加入40μL無(wú)菌水溶解。

參照孫雪等（2009）的方法合成小球藻rDNAITS引物（ITS-F：5'-TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3'和ITS-R：5'-TTAAGTTCAGCGGGTAGTCTTGCC-3'）及rbcL引物（rbcL-F：5'-ATGKCTCCACAAACTGAAACTA-3和rbcL-R：5'-TTAAAGWGTATCGATWGTTTCGA一3）。利用PCR擴(kuò)增小球藻的ITS序列和rbcL基因，并將其克隆至pMD18-T載體，挑選陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索，并采用MEGA5.2構(gòu)建基于ITS和rbeL基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3小球藻細(xì)胞密度測(cè)定

每瓶培養(yǎng)基中加人1mL藻種（5×10⁶個(gè)/mL），培養(yǎng)3d后采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定各處理的藻細(xì)胞密度，并計(jì)算細(xì)胞抑制率：

抑制率（%）=（C₀-C）/C₀×100

式中，C₂表示未添加抗生素的小球藻細(xì)胞密度，C表示添加不同濃度抗生素后的小球藻細(xì)胞密度。

1.4葉綠素含量及F_v/F_m測(cè)定

取1mL小球藻培養(yǎng)液置于10mL玻璃管中，每管加入4mL丙酮，渦旋振蕩30s，4℃靜置1h后5000r/min離心5min，取上清液于波長(zhǎng)645和663nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算葉綠素含量：

葉綠素含量（mg/L）=（20.2×OD_645nm+8.02×OD_663nm）×V/1000

式中，V表示丙酮體積。

光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（F_v/F_m）反應(yīng)植物潛在的最大光合能力，直接采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（mini-PAM）進(jìn)行測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA）和LSD多重比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1小球藻藻種鑒定結(jié)果

以小球藻DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得HOC5的ITS和rbcL基因序列長(zhǎng)度分別為683和1429bp。ITS序列的同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，HOC5與小球藻科小球藻屬的Chlorellasorokiniana親緣關(guān)系最近（圖1）?；趓bcL基因同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示出類似結(jié)果（圖2）。HOC5的細(xì)胞形態(tài)如圖3所示，為單細(xì)胞，浮游，呈圓形或橢圓形，色素體1個(gè)，環(huán)狀周生，細(xì)胞直徑4.5～5.5lam。綜合分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可將HOC5鑒定為Csorokiniana。

2.2不同抗生素對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞密度的影響

小球藻C.sorokiniana在添加不同濃度抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d后，其細(xì)胞密度如圖4所示。與未添加抗生素（0μg/mL）的對(duì)照相比，添加10～100μg/mL青霉素并不影響小球藻C.sorokiniana細(xì)胞的生長(zhǎng)；添加10-80μg/mL頭孢噻肟也不影響小球藻C.sorokiniana細(xì)胞增殖，但添加濃度達(dá)100μg/mL時(shí)，藻細(xì)胞密度明顯下降，該濃度對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率達(dá)18.89%（表1）；添加低濃度的氯霉素（0-20μg/mL）能有效促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)濃度超過(guò)20μg/mL后，藻細(xì)胞密度隨氯霉素添加濃度的增加而呈急劇下降趨勢(shì)，80和100μg/mL氯霉素對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為20.94%和39.87%（表1）；鏈霉素和慶大霉素的添加濃度超過(guò)10μg/mL時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，抑制率分別為34.10%-54.64%和41.73%-64.30%（表1）。從圖5也可看出，與對(duì)照的深綠色培養(yǎng)液相比，藻細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的培養(yǎng)液均呈淺綠色，尤其在添加60μg/mL及以上濃度的慶大霉素培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液幾乎透明，其對(duì)應(yīng)的抑制率均超過(guò)60.00%。

2.3不同抗生素對(duì)小球藻C.sorokiniana光合作用的影響

由圖6可看出，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量與細(xì)胞密度的變化趨勢(shì)基本一致。與未添加抗生素（0μg/mL）的對(duì)照相比，添加青霉素基本上不影響小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量；添加20μg/mL及以上的慶大霉素和鏈霉素進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量呈極顯著下降趨勢(shì)（P<0.01，下同）；添加60μg/mL及以上的氯霉素進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量呈顯著（P<0.05，下同）或極顯著下降趨勢(shì)；添加10～80μg/mL頭孢噻肟進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量無(wú)顯著變化（P>0.05，下同），但添加濃度增至100μg/mL后，其葉綠素含量極顯著下降。

由圖7可看出，添加青霉素對(duì)小球藻C.sorokinia-na的F_v/F_m無(wú)顯著影響。與正常培養(yǎng)的小球藻C.so-rokiniana相比，添加20和40μg/mL慶大霉素培養(yǎng)的小球藻F_v/F_m極顯著下降，而添加60-100g/mL慶大霉素培養(yǎng)的小球藻C.sorokiniana因其細(xì)胞密度過(guò)低，未檢測(cè)出F_v/F_m；添加60-100g/mL氯霉素和鏈霉素能極顯著降低小球藻C.sorokiniana的F_v/F_m。

2.4不同防腐劑對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞密度的影響

由圖8可看出，添加0.5%和1.0%乳酸鈉尚未明顯阻礙小球藻C.sorokiniana細(xì)胞的生長(zhǎng)，但添加2.0%乳酸鈉后藻細(xì)胞密度下降50%左右；培養(yǎng)液中添加50-200μg/mL山梨酸鉀對(duì)藻細(xì)胞密度無(wú)顯著影響；小球藻C.sorokiniana培養(yǎng)液添加富馬酸二甲酯的適宜濃度為0.1～10.0μg/mL，添加濃度為25.0和50.0μg/mL時(shí)藻細(xì)胞幾乎不能生長(zhǎng)（圖9）。

2.5不同防腐劑對(duì)小球藻C.sorokiniana光合作用的影響

由圖10可看出，乳酸鈉會(huì)降低小球藻C.soroki-niana的葉綠素含量，添加2.0%乳酸鈉時(shí)其葉綠素含量極顯著下降；添加山梨酸鉀對(duì)小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量無(wú)顯著影響；添加0.1-10.0μg/mL富馬酸二甲酯也不影響小球藻C.sorokiniana的葉綠素含量，但添加濃度超過(guò)25.0μg/mL后葉綠素含量極顯著下降。在F_v/F_m方面，添力10.5%-2.00/4L酸鈉及0.5-10.0gg/mL富馬酸二甲酯培養(yǎng)的小球藻C.sorokiniana，其F_v/F_m較未添加防腐劑（0μg/mL）的對(duì)照極顯著下降，表明潛在的最大光合能力受到抑制。

3討論

青霉素主要通過(guò)抑制轉(zhuǎn)肽酶阻礙細(xì)菌的細(xì)胞壁合成，從而達(dá)到抗菌目的；頭孢噻肟為第三代頭孢菌素，與青霉素同屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素。本研究結(jié)果表明，小球藻C.sorokiniana對(duì)這兩種抗生素不敏感，僅高濃度（100μg/mL）的頭孢噻肟會(huì)引起藻細(xì)胞密度和葉綠素含量下降，同時(shí)潛在的最大光合能力極顯著下降。除小球藻外，波吉卵囊藻和富油新綠藻對(duì)青霉素也不敏感（李靜紅等，2009；張茜等，2016），但周文禮等（2009）報(bào)道低于100μg/mL的青霉素能促進(jìn)普通小球藻葉綠素a含量增加。本研究也發(fā)現(xiàn)青霉素對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞葉綠素含量無(wú)顯著影響，可能是藻種不同的原因。頭孢噻肟為7一氨基頭孢霉烷酸（7ACA）的衍生物，二者抗菌機(jī)制相似。Guo等（2016）報(bào)道100μg/mL7一氨基頭孢霉烷酸對(duì)小球藻Chlorellasp.的抑制率為12.00%，本研究中100μg/mL頭孢噻肟對(duì)小球藻C.sorokiniana的抑制率為18.96%，但Fu等（2017）研究證實(shí)細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制類抗生素（頭孢噻肟和氨芐青霉素）對(duì)微藻的毒性作用很小。不同藻種對(duì)抗生素的敏感性各不相同，除了與其種屬有關(guān)外，還與培養(yǎng)基的組分有關(guān)。李杰等（2003）、楊芳芳等（2012）曾研究報(bào)道，以固體和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的微藻對(duì)同一抗生素的敏感性也不相同。

氯霉素和鏈霉素的抗菌作用機(jī)制是分別與細(xì)菌核糖體蛋白的50S和30s亞基相結(jié)合，使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成受阻，而達(dá)到抑菌目的。慶大霉素與鏈霉素的抗菌作用機(jī)制相似，也是與細(xì)菌核糖體蛋白30S亞基相結(jié)合，只是慶大霉素較鏈霉素具有更廣的抗菌譜和更強(qiáng)的抗菌活性。已有研究證實(shí)，萊茵衣藻、柵藻、埃氏小球藻和單針藻對(duì)氯霉素非常敏感（余旭亞等，2012；姜思等，2017；王亞君等，2017），但也有研究報(bào)道真眼點(diǎn)藻、富油新綠藻、金藻和普通小球藻對(duì)100μg/mL及以下濃度的氯霉素不敏感（周文禮等，2009；楊芳芳等，2012；張茜等，2016）。Seoane等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加氯霉素24h后，綠藻Tetraselmissuecica的生長(zhǎng)和細(xì)胞活性均未受影響，但與光合作用相關(guān)的各項(xiàng)參數(shù)，如葉綠素a含量顯著下降，表明氯霉素對(duì)T.suecica有一定毒性。在鏈霉素和慶大霉素方面，Magdaleno等（2015）研究表明慶大霉素對(duì)月牙藻的毒性作用非常大，半數(shù)有效濃度（EC₅₀）為19.2mg/L；張茜等（2016）、王亞君等（2017）研究發(fā)現(xiàn)富油新綠藻、埃氏小球藻和單針藻對(duì)鏈霉素非常敏感；鄭凌凌等（2017）研究證實(shí)雨生紅球藻對(duì)鏈霉素和慶大霉素均非常敏感。本研究結(jié)果表明，氯霉素、鏈霉素和慶大霉素等蛋白質(zhì)合成抑制類抗生素對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞的毒性較強(qiáng)，高于10μg/mL的鏈霉素和慶大霉素及高于20μg/mL的氯霉素均極顯著抑制小球藻C.sorokiniana細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的葉綠素含量和F_v/F_m也極顯著下降。

山梨酸鉀為常用的食品防腐劑。孫建華等（1998）曾報(bào)道，山梨酸鉀可用于高濃度小新月菱形藻的保存。本研究結(jié)果表明，添加50-200μg/mL山梨酸鉀不會(huì)影響小球藻C.sorokiniana生物量的累積，當(dāng)添加濃度達(dá)200μg/mL時(shí)藻細(xì)胞密度略有增加，潛在的最大光合能力也明顯上升。乳酸鈉和富馬酸二甲酯尚無(wú)應(yīng)用于微藻無(wú)菌培養(yǎng)及保存的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，小球藻C.sorokiniana的細(xì)胞密度、葉綠素含量及F_v/F_m均隨乳酸鈉濃度增加而降低，表明乳酸鈉對(duì)小球藻C.sorokiniana細(xì)胞有一定的毒性作用；添加0.1-10.0μg/mL富馬酸二甲酯不影響小球藻C.sorokiniana的細(xì)胞密度及葉綠素含量，但F_v/F_m極顯著下降，表明富馬酸二甲酯會(huì)抑制小球藻C.sorokiniana潛在的最大光合能力。

4結(jié)論

青霉素和頭孢噻肟等破壞細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素對(duì)小球藻生長(zhǎng)影響較小，而氯霉素、鏈霉素和慶大霉素等抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的抗生素對(duì)小球藻毒性較大。山梨酸鉀不影響小球藻的生長(zhǎng)，乳酸鈉會(huì)抑制小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)，且添加濃度越高抑制作用越明顯。因此，建立小球藻C.sorokiniana無(wú)菌培養(yǎng)體系時(shí)宜選用青霉素和頭孢噻肟為抗生素、山梨酸鉀為防腐劑，其推薦使用濃度分別為青霉素100μg/mL、頭孢噻肟80μg/mL、山梨酸鉀200μg/mL。

（責(zé)任編輯蘭宗寶）