抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體基因克隆及其結(jié)構(gòu)分析

馬蘭　劉愛平　王佳　王小紅

摘要：[目的]克隆構(gòu)建黃曲霉毒素B1（AFB1）單鏈抗體（scFv）基因，并對其編碼蛋白序列和結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測，為scFv分子修飾改造及在免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。[方法]以抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株為原料，通過PCR擴增重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL），以（Gly₄Ser），為柔性接頭（Linker）拼接構(gòu)建抗AFBlscFv基因，并采用在線生物信息學(xué)分析軟件對其氨基酸序列、理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測。[結(jié)果]抗AFBlscFv基因全長744bp，編碼248個氨基酸，分子量為26312.05Da，理論等電點（pI）5.70，其二級結(jié)構(gòu)中含有35個α-螺旋（占14.11%）、28個β-折疊（占11.29%）、85個延伸鏈（占34.28%）和100個隨機卷曲（占40.32%），在三級結(jié)構(gòu)中連接肽卷曲將VH和VL區(qū)域牽拉而相互靠近，形成典型的抗體結(jié)構(gòu)——溝槽結(jié)構(gòu)，是scFv的抗原結(jié)合區(qū)域。[結(jié)論]構(gòu)建的抗AFBlscFv其VH含有117個氨基酸、VL含有116個氨基酸，具備典型抗體結(jié)構(gòu)——溝槽結(jié)構(gòu)，能與抗原特異性結(jié)合。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1（AFB1）；單鏈抗體（scFv）；重鏈可變區(qū)（vH）；輕鏈可變區(qū)（VL）；溝槽結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S859.87 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）11-2064-07

0引言

[研究意義]黃曲霉毒素（Anatoxins，AFTs）是由黃曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（A.parasiti-CUS）等真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，至今共發(fā)現(xiàn)20多種黃曲霉毒素及其衍生物（Delmulleeta1.，2005；李鑫等，2012a），其中以黃曲霉毒素B1（AFBl）的毒性最強，已被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)列為I類致癌物質(zhì)（莊振宏等，2011）。由于AFB1污染食品及其原料范圍廣，對人類健康具有極大危害，因此非常有必要針對其建立一種準(zhǔn)確、快速的檢測方法。根據(jù)AFBl溶解性、光譜學(xué)特性等建立的檢測方法有薄層色譜法、氣相色譜分析法、高效液相色譜分析法等，雖然檢測靈敏度和準(zhǔn)確性高，但檢測成本高、前處理復(fù)雜，不適用于大批量樣品陽性篩查。免疫分析法是基于抗原抗體特異性反應(yīng)對AFB1進行定性和定量分析，具有方便、快速、成本低、特異性高等優(yōu)點（孫清，2016）?？贵w作為免疫分析的核心試劑，經(jīng)歷了多克隆抗體、單克隆抗體到基因工程抗體的發(fā)展。單鏈抗體（Singlechainantibodvfragment，scFv）是一類典型的基因工程抗體，由一段多肽鏈（Linker）將抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）連接而成（Hustoneta1.，1988），具有生產(chǎn)周期短、批次問差異小、可基因修飾等優(yōu)點，尤其在AFB1等小分子污染物檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。[前人研究進展]scFv分子量為26-28kD，是傳統(tǒng)抗體的1/5，但仍保持與待測物結(jié)合的特異性和檢測靈敏性，是生物毒素檢測領(lǐng)域最常用的基因工程抗體（Bazineta1.，2017）。在原核表達系統(tǒng)中，scFv制備一般有兩種途徑（Lieta1.，2013）：一種是基于噬菌體展示技術(shù)，從脾細胞中提取并擴增重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL），構(gòu)建噬菌體展示單鏈抗體文庫，通過“吸附-洗脫-擴增”過程從中篩選出與AFBl親和力強的scFv（Edupugantieta1.，2013；Wangeta1.，2016；徐重新等，2017）；另一種途徑是通過提取陽性單克隆雜交瘤細胞的RNA，體外將VH和VL連接，無需借助噬菌體展示體系，可避免展示文庫構(gòu)建和篩選等繁瑣的步驟，但此法會降低scFv與目標(biāo)物的親和力，一般比單克隆抗體低10-100倍（Hueta1.，2015）。孫憲連（2006）首次應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)成功制備獲得抗AFBlscFv；李鑫等（2012b）從單克隆細胞株8F6中克隆得到抗AFB1scFv，實現(xiàn)了scFv在大腸桿菌中的表達，并建立了間接競爭免疫分析方法，對AFBl的半抑制率（IC50）為0.57ng/mL；Li等（2013）通過提取20多株抗AFBl單克隆抗體陽性雜交瘤細胞的總RNA，構(gòu)建了抗AFB1scFv文庫，庫容為3.5×10₅CFU。此外，scFv也可在真核表達系統(tǒng)中表達。王婷等（2017）通過擴增抗AFBlscFv基因，將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母表達系統(tǒng)，用0.8%甲醇可誘導(dǎo)scFv發(fā)生可溶性表達。scFv的另一個優(yōu)勢是其基因序列已知，通過對其蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析可精確定位抗原抗體的結(jié)合位點（Hueta1.，2016），為體外改造和促進抗原抗體親和力提供技術(shù)支持。Min等（2015）從酵母突變文庫中篩選獲得抗AFBlscFv，分析該抗體氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其突變子通過變構(gòu)效應(yīng)與AFB1形成一個結(jié)合區(qū)域，從而提高抗體親和力。[本研究切入點]為提高scFv的應(yīng)用價值，當(dāng)前研究主要通過構(gòu)建或擴大抗體文庫等方式篩選出合適的scFv，但針對抗AFB1scFv重組構(gòu)建及其性質(zhì)分析的研究鮮見報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]以AFBl為研究對象，擴增抗AFB1抗體的VH和VL基因，通過柔性接頭將二者拼接以構(gòu)建抗AFB1scFv，并對其理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測，為scFv分子修飾改造及在免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實驗室構(gòu)建提供；T100^TMThermalCyclerPCR儀、蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)分析儀購自美國Bio-Rad公司；58IOR冷凍高速離心機購自德國Eppendorf公司；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI及大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞購自美國NewEnglandBiolab公司；RevertAidTMcDNA單鏈合成試劑盒購自美國Roche公司；其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株總RNA提取

從液氮罐中取出凍存的抗AFBl單克隆抗體雜交瘤細胞株，迅速放入37℃水浴鍋中解凍后置于完全培養(yǎng)液中復(fù)蘇。收集處于對數(shù)生長期的細胞，加入1.0mLTrizol試劑混合均勻，室溫下靜置5min后加入200.0μL三氯甲烷，混勻后靜置10min，12000r/min離心15min，將含有RNA的上清液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，再加入等體積異丙醇，靜置10min沉淀RNA，12000r/min離心20min，棄上清液，加入75%乙醇洗滌沉淀兩次，離心后加/k50.0μL經(jīng)DEPC處理的無菌水溶解RNA，取少量RNA測定其濃度和純度，剩余RNA于80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3cDNA第一鏈合成

以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：取5.0μLRNA，加入5.0μL5×緩沖液、2.0μLdNTP（2.5mmol/L）、1.0μLOligo（dT）Primer（50μmol/L）、2.0μLRNase抑制劑和0.5μL逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）。反轉(zhuǎn)錄程序：25℃10min，42℃1h，70℃15min。合成的cDNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4VH和VL基因擴增

以cDNA為模板PCR擴增抗體可變區(qū)VH和VL基因，參照Zhou等（1994）的方法設(shè)計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25.0μL：1.5μLcDNA模板，2.5μL10×緩沖液，1.0μLdNTP（2.5mmol/L），1.0μL正、反向引物（10gmol/L），0.2gLDNA聚合酶，無菌純水補足至25.0μL。擴增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，進行25個循環(huán)；72℃延伸7min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，以QIAquickGelExtractionKit試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物（VH和VL基因片段）。

1.5抗AFBlscFv基因構(gòu)建

利用重疊延伸PCR（sOE-PCR）構(gòu)建VH-linker-VL順序的scFv基因，連接肽為（Glv4Ser）₃。以1.0μLVH基因片段為模板，引物采用VH-linker-For和VH-linker-Back（表1），加入2.5μL10×PCR緩沖液、1.0μLdNTP（2.5mmol/L）和DNA聚合酶，無菌純水補足至25.0μL，擴增VH-linker基因片段；擴增程序與1.4一致。同理采用VL-linker-For和VL-linker-Back擴增VL-linker基因片段。以VH-linker和VL-linker各1.0μL互為模板，VH-linker-For和VL-linker-Back為引物（表1），擴增scFv基因；擴增程序與1.4一致，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

1.6抗AFBlscFv重組質(zhì)粒構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamH1分別酶切scFv基因和pET-3d載體，酶切產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，按QIAquickGelExtractionKit說明回收目的條帶，然后連接回收的酶切產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系：30ng基因片段，30ng載體質(zhì)粒，0.5μLT4DNA連接酶，1.0μLT4DNA連接酶緩沖液，16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞。挑取LB培養(yǎng)基上的單克隆，提取質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7scFv基因序列比對分析

根據(jù)scFv基因序列，采用Bioedit翻譯成氨基酸，并將翻譯結(jié)果輸入Igmt/v-Quest（http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）中，對scFv的框架區(qū)（FR）和超變區(qū)（cDR）進行劃分。同時，在NCBI數(shù)據(jù)庫中對其堿基序列和氨基酸序列進行比對分析，明確與其他抗體蛋白的同源性。

1.8scFv蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)scFv氨基酸序列，采用ExPASyProteomicsTools中的ProtParam程序（http：//web.expasy，org/prot-param/）計算其蛋白分子量、等電點等參數(shù)（Bazineta1.，2017），并以NPS@SOPMA程序（https：//npsa-pra-bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl？page=npsasopma.html）預(yù)測該抗體蛋白二級結(jié)構(gòu)。在SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）中輸入scFv氨基酸序列，通過序列比對找到與目標(biāo)蛋白相似性較高且具有已知結(jié)構(gòu)的序列，推測scFv蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與分析

2.1scFv可變區(qū)基因的擴增結(jié)果

提取獲得的抗AFB1單克隆抗體雜交瘤細胞株總RNA在凝膠成像系統(tǒng)中可觀察到3條明顯的條帶，分別為28SRNA、15SRNA和5SRNA（圖1）。以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后擴增VH和VL基因片段，結(jié)果均擴增得到單一的特異性條帶，兩個片段大小約350bp（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2scFv基因構(gòu)建及序列鑒定結(jié)果

回收VH和VL基因片段，以SOE-PCR構(gòu)建VH-linker-VL順序的scFv基因，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到大小約750bp的目的條帶（圖3），與預(yù)期結(jié)果相符。將scFv基因連接至pET-3d載體構(gòu)建獲得的DET-3d-scFv重組質(zhì)粒經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切鑒定，結(jié)果獲得兩條清晰的目的條帶（圖4），其大小分別為4600和750bp。以pET-3d通用引物測定雙酶切獲得的scFv基因序列，結(jié)果表明，scFv基因片段大小為744bp，其中VH片段為351bp、VL片段為348bp。

2.3scFv氨基酸序列分析及其同源性比對結(jié)果

Bioedit翻譯得到的scFv氨基酸序列如圖5所示，經(jīng)Igmt/v-Quest劃分得知VH含有117個氨基酸，VL含有116個氨基酸。由表2和表3可知，VH和VL基因堿基序列及其推導(dǎo)氨基酸序列均有相對應(yīng)的高同源性VH和VL，即可基本確認(rèn)克隆獲得的VH基因和VL基因是小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因，且比對結(jié)果表明VL的類型為Kappa鏈。

2.4scFv蛋白理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

通過ExPASyProteomicsTools中的ProtParam程序在線預(yù)測分析，得知scFv蛋白含有248個氨基酸，分子量為26312.05Da，理論等電點（pI）5.70。以NPS@SOPMA預(yù)測scFv蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其二級結(jié)構(gòu)中含有35個α-螺旋，占總數(shù)的14.11%；28個β-折疊，占11.29%；85個延伸鏈，占34.28%；100個隨機卷曲，占40.32%。通過SWISS-MODEL在線分析scFv氨基酸序列與模板5'GRU（ProteinDataBank編號）的同源性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的相似性為78.02%。由圖6可看出，在scFv蛋白三級結(jié)構(gòu)中連接肽卷曲將VH和VL區(qū)域牽拉而相互靠近，形成典型的抗體結(jié)構(gòu)——溝槽結(jié)構(gòu)，是scFv的抗原結(jié)合區(qū)域。其中紅色部分為重鏈，藍色部分為輕鏈，銀色部分為柔性多肽（Linker）。

3討論

與傳統(tǒng)的多克隆抗體和單克隆抗體相比，scFv的分子量小，僅為傳統(tǒng)抗體的1/5，能更好地穿透組織，可在基因水平上進行改造，且在大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、植物細胞等表達系統(tǒng)中均能表達（Wardeta1.，1989；劉金鳳等，2015；劉愛平等，2016），但scFv也存在自身缺陷，主要表現(xiàn)為穩(wěn)定性差、親和力不如單克隆細胞株，在原核表達系統(tǒng)中通常以包涵體的形式表達等（Wangeta1.，2006），進而限制其在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境檢測方面的推廣應(yīng)用。依據(jù)scFv基因序列的已知優(yōu)勢，在一定程度上可為scFv的實際應(yīng)用提供優(yōu)化策略。如通過分析目標(biāo)物不同親和力的氨基酸序列，可確定抗體某一區(qū)域?qū)τ谀繕?biāo)物結(jié)合能力的影響，從而獲得特異性結(jié)合位點。因此，通過對scFv蛋白的序列分析和結(jié)構(gòu)解析能更精確地定位其生物功能。

目前，接近90%的蛋白結(jié)構(gòu)是采用X射線衍射技術(shù)進行測定，該方法雖然能獲得精確的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，但操作復(fù)雜、儀器昂貴，對抗體純度要求高（李少暉等，2015）。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，基因序列信息越來越容易獲得。因此，在線數(shù)字化分析系統(tǒng)已成為蛋白功能研究必不可少的工具。同源建模（Homologymodeling）是一種實用、可靠的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，通過與數(shù)據(jù)庫中已知序列x射線晶體衍射比對，選取具有高度保守性的氨基酸序列，同源性在50%以上時再以理論計算方法對其進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化?；诳贵w的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，對某些特定位置進行定點突變的策略可用于提高抗體親和力。Li等（2012）通過分析抗AFBl單克隆抗體的氨基酸序列及預(yù)測其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該單克隆抗體上第49位絲氨酸（Ser）與第103位纈氨酸（Val）問的氫鍵和疏水作用對實現(xiàn)抗原與抗體的結(jié)合起重要作用。Min等（2016）在分析抗AFBlscFv氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將VHFR4的第110位丙氨酸突變成蘇氨酸（¹¹⁰Ala→Thr），其親和力提高了3.2倍。本研究成功構(gòu)建獲得抗AFBlscFv基因，并采用在線生物信息學(xué)分析軟件對其氨基酸序列、理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測，結(jié)果顯示，scFv基因片段大小為744bp，其中VH片段為351bp、VL片段為348bp，經(jīng)Igmt/v-Quest劃分得知VH含有117個氨基酸，VL含有116個氨基酸，二者均為小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因：scFv蛋白含有248個氨基酸，分子量為26312.05Da，理論等電點（pI）5.70，其二級結(jié)構(gòu)中含有35個α-螺旋（占14.11%）、28個β-折疊（占11.29%）、85個延伸鏈（占34.28%）和100個隨機卷曲（占40.32%），在三級結(jié)構(gòu)中連接肽卷曲將VH和VL區(qū)域牽拉而相互靠近，形成典型的抗體結(jié)構(gòu)——溝槽結(jié)構(gòu)，是scFv的抗原結(jié)合區(qū)域。該結(jié)果為scFv基因的表達、純化、活性及親和力研究等后續(xù)工作提供了重要的參考依據(jù)，也為確定關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點、改變結(jié)合部位的氨基酸序列或空間構(gòu)像提供了基礎(chǔ)信息，從而實現(xiàn)scFv的體外進化及提高其實際應(yīng)用能力。

4結(jié)論

構(gòu)建的抗AFBlscFv其VH含有117個氨基酸、VL含有116個氨基酸，具備典型抗體結(jié)構(gòu)——溝槽結(jié)構(gòu)，能與抗原特異性結(jié)合。

（責(zé)任編輯蘭宗寶）