環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法在登革病毒臨床檢測中的運(yùn)用

周旋 鐘麗梅 胡亮杉 林茂銳 曹東林

【摘要】目的探討利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）快速診斷登革病毒的可行性。方法收集226例登革熱患者和30名健康體檢者的外周血標(biāo)本，分離血清，分別使用血清特異性抗體、LAMP及實(shí)時(shí)定量PCR檢測登革病毒RNA載量，統(tǒng)計(jì)分析各種檢測方法應(yīng)用情況。結(jié)果226例登革熱患者血清樣本中，登革病毒血清抗體陽性率為845%， PCR檢測登革病毒RNA陽性率為956%，LAMP檢測登革病毒陽性率969%，PCR及LAMP所檢測的登革病毒血清分型均以1型為主。3種方法對30名健康體檢者的登革病毒檢測結(jié)果均為陰性。在登革病毒104～108 copies的范圍內(nèi)，隨著病毒載量的增加，LAMP的反應(yīng)時(shí)間隨之縮短。結(jié)論LAMP可用于登革病毒的快速檢測。

【關(guān)鍵詞】登革病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；快速檢測

Application of loopmediated isothermal amplification in clinical detection of dengue virusZhou Xuan， Zhong Limei，Hu Liangshan， Lin Maorui， Cao Donglin Department of Laboratory Medicine， Guangdong Second Provincial General Hospital， Guangzhou 510317， China

Corresponding author， Cao Donglin， Email： caodl@126com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the feasibility of loopmediated isothermal amplification （LAMP） applied in the rapid diagnosis of dengue virus MethodsPeripheral blood samples were collected from 226 dengue fever patients and 30 healthy subjects during physical examination After serum isolation， the loading capacity of dengue virus RNA was measured by serological antibodyspecific method， LAMP and realtime quantitative PCR， respectively The detection results among three approaches were statistically compared ResultsAmong 226 serum samples， the positive rate was 845% detected by serological antibodyspecific method， 956% for realtime quantitative PCR and 969% for LAMP Both realtime quantitative PCR and LAMP mainly detected type I dengue virus Negative results of dengue virus were obtained in the healthy individuals by three techniques Within the range of 104108 copies of dengue virus， the reaction time of LAMP was shortened along with the increasing loading capacity of dengue virus ConclusionLAMP can be utilized for rapid detection of dengue virus

【Key words】Dengue virus； Loopmediated isothermal amplification； Rapid detection

登革熱是由登革病毒感染所致的急性傳染病。登革病毒屬黃病毒科，含單股線狀RNA，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播[1]。目前實(shí)驗(yàn)室檢測登革病毒的方法主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測及核酸檢測[23]。運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒的方法因耗費(fèi)的時(shí)間長、操作要求高、敏感度低，已較少用于臨床樣本的檢測中[46]。血清學(xué)方法有的比較耗時(shí)，有的不夠敏感，而且與其他黃病毒也有交叉反應(yīng)的可能。目前核酸檢測技術(shù)發(fā)展極為迅速，早期即有多種方法應(yīng)用于登革病毒檢測，然而對設(shè)備和技術(shù)的要求較高限制了其使用范圍。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）僅需到達(dá)某一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，具有鑒定簡便、成本低廉、設(shè)備要求低、特異度高、擴(kuò)增高效的優(yōu)點(diǎn)，在鑒定各種細(xì)菌與病毒中得到迅猛發(fā)展，應(yīng)用該方法檢測登革病毒在國外早有報(bào)道，而國內(nèi)報(bào)道相關(guān)較少[7]。為此，本研究探討LAMP檢測登革病毒應(yīng)用于我國臨床的可行性。

材料與方法

一、血清樣本的收集

2014年7月至2015年12月我院收治的門診發(fā)熱患者中，經(jīng)登革抗體檢測與登革病毒RNA定量檢測，并根據(jù)2009年WHO頒布指南初診為登革熱226例。其中男138例、女88例，年齡5個(gè)月～93歲、中位年齡32歲。采集患者全血置于干燥管中，離心，棄去有溶血現(xiàn)象的血液，再以3 600轉(zhuǎn)/分離心10 min，每例患者血清分裝為2管，每管至少300 μl樣本，儲存于-80℃冰箱備用。同時(shí)，使用隨機(jī)數(shù)字表法選取2015年12月在我院體檢中心進(jìn)行健康體檢的30名健康體檢者，取其血清，作為陰性對照使用，其中男20名、女10名，年齡18～65歲、中位年齡32歲。2組受檢者的性別構(gòu)成及年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>005）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均已簽署知情同意書。

二、標(biāo)準(zhǔn)登革病毒株制備與核酸提取

本研究采用的病毒株由南方醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系P3實(shí)驗(yàn)室趙衛(wèi)教授饋贈(zèng)，病毒株的型別分別為：1型夏威夷株，2型新幾內(nèi)亞株，3型H87株，4型 H241株。采用QIAGEN病毒RNA提取試劑盒提取RNA，并采用實(shí)驗(yàn)室已存的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和探針對提取的RNA進(jìn)行絕對定量，以標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對照。

三、登革病毒的血清特異性抗體檢測

采用膠體金快速免疫層析法（試劑盒由廣州萬孚生物技術(shù)有限公司提供）對登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）IgG/IgM抗體進(jìn)行定性檢測，當(dāng)樣品中含有登革病毒IgG/IgM抗體，且濃度高于最低檢出限時(shí)，將在檢測區(qū)T1或T2形成肉眼可見的紅色反應(yīng)線，此時(shí)結(jié)果為登革病毒IgG或登革病毒IgM抗體陽性，相反，當(dāng)樣品中不含有登革病毒IgG/IgM抗體或濃度低于最低檢出限時(shí)，則檢測區(qū)（T1、T2）無紅色反應(yīng)線出現(xiàn)，此時(shí)結(jié)果為登革病毒IgG/IgM抗體陰性。無論樣本中是否含有登革病毒IgG/IgM抗體，在質(zhì)控區(qū)（C）都會(huì)形成一條紅色的反應(yīng)線。

四、登革病毒RNA的PCR定量檢測

使用Taqman探針法，采用OMIGA病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA，將所得RNA分裝后存于-70℃?zhèn)溆?。同時(shí)提取正常人血清用作陰性對照，標(biāo)準(zhǔn)毒株用于陽性對照。采用與檢測標(biāo)準(zhǔn)株相同的方法對患者與正常人血清RNA樣本進(jìn)行檢測定量。試劑盒的登革病毒最低檢出限為10 copies。

五、登革病毒RNA的LAMP分析

采用迪澳生物公司所提供的登革病毒型特異性LAMP試劑盒及配套儀器檢測前述提取的RNA樣本，將已知病毒載量各型標(biāo)準(zhǔn)毒株倍比稀釋行LAMP檢測，制作出對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。試劑盒的登革病毒最低檢出限為10 copies。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所采集的數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 200分析。組間年齡比較行秩和檢驗(yàn)，性別構(gòu)成行χ2檢驗(yàn)，登革病毒陽性率以百分比表示。

結(jié)果

一、不同檢測方法對登革病毒診斷結(jié)果分析

226例登革熱患者血清樣本中，登革病毒血清抗體陽性率為845%（191/226），PCR檢測登革病毒RNA陽性率為956%（216/226），LAMP檢測登革病毒陽性率969%（219/226）， PCR及LAMP所檢測的登革病毒血清分型均以1型為主，見表1。30名健康體檢者的登革病毒檢測結(jié)果均為陰性。

二、登革病毒載量的LAMP檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

在104～108 copies時(shí)，隨著登革病毒載量的增加，LAMP的反應(yīng)時(shí)間隨之縮短，見圖1。當(dāng)?shù)歉锊《据d量小于或大于上述范圍時(shí)，則無法得出良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

討論

近年來，登革熱在世界范圍內(nèi)的大規(guī)模爆發(fā)，成為流行最廣的蚊媒疾病，約有39億熱帶與亞熱帶地區(qū)的人群受到登革病毒感染的威脅，其中有約500 000例病情嚴(yán)重的患者需要住院治療[2]。廣東省由于其亞熱帶氣候特點(diǎn)及伊蚊的分布成為登革病毒流行的重災(zāi)區(qū)。廣州市自1978年以來發(fā)生10次登革熱流行，4種血清型均曾出現(xiàn)。2014年7月以來，登革熱在廣東省暴發(fā)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)共有45 189例登革熱確診患者及6例死亡病例[3]。至2015年登革熱仍有小規(guī)模流行。登革熱的暴發(fā)和流行給社會(huì)帶來很大負(fù)擔(dān)，目前仍無有效的疫苗和特異有效的藥物用于預(yù)防和治療登革病毒的感染，早期發(fā)現(xiàn)和治療干預(yù)可降低其致死性，因此臨床需要尋找早期快速診斷登革病毒感染的方法。

雖然血清特異性抗體可對登革病毒初次或再次感染作出初步判斷，并具有診斷時(shí)間快、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但該方法在病例散發(fā)情況下或?qū)o癥狀人群檢測時(shí)，出現(xiàn)的假陽性率比較高，而且部分患者在感染后7～10 d內(nèi)的抗體水平也較低，只有當(dāng)患者癥狀持續(xù)出現(xiàn)時(shí)，再次采樣測試，才會(huì)有較好的效果[45]。本研究中，血清登革病毒抗體檢測的陽性率為847%，低于RNA的檢測率，IgM陽性及IgM/IgG雙陽性者的血清登革病毒RNA檢測均為陽性，少數(shù)單純IgG陽性的血清并未檢測出核酸，這可能與抗體形成時(shí)間及病毒擴(kuò)增復(fù)制的時(shí)間差有關(guān)。

過去十年來，各種各樣的核酸擴(kuò)增技術(shù)包括RTPCR、巢式PCR、Taqman探針實(shí)時(shí)定量PCR、SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR以及依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）等被廣泛地用于登革病毒核酸的檢測[812]。然而，上述核酸檢測方法大多對擴(kuò)增儀器要求較高，或者對擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測要求高，使得這些檢測方法難以普及，特別是在社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、私人診所等。LAMP因其只需一恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定簡便，成本低廉，設(shè)備要求低，受到了WHO、各國學(xué)者和相關(guān)政府部門的關(guān)注。本研究采用的LAMP與Taqman探針實(shí)時(shí)定量PCR相比，其最低檢出限均為10 copies，且2種方法的特異度均較好，在絕對定量的能力上， LAMP在登革病毒104～108 copies時(shí)隨著病毒載量的上升，出峰時(shí)間縮短。因此，LAMP法在偏遠(yuǎn)地區(qū)或條件較差的衛(wèi)生服務(wù)中心以及現(xiàn)場快速檢測方面能夠得以廣泛應(yīng)用，而Taqman探針RTPCR雖然能夠很好地定量檢測登革病毒RNA，但成本昂貴、檢測耗時(shí)較長以及對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高，限制了其推廣使用。

RTLAMP恒定溫度擴(kuò)增反應(yīng)具有鑒定簡便、高特異度、高效擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，在我國登革病毒檢測的領(lǐng)域正逐步進(jìn)入市場，然而，該技術(shù)對引物設(shè)計(jì)的要求極高，而病毒又存在高變異的特點(diǎn)，使其在應(yīng)用范圍上存在局限性，而高的擴(kuò)增效率導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)區(qū)域極其容易污染，也有可能提高其假陽性率。這些不足將是此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)改進(jìn)和完善的主要方向。

綜上所述，對于登革病毒的早期診斷，基層衛(wèi)生服務(wù)中心以及有條件的私人診所應(yīng)該普及使用快速免疫層析的方法初步判斷病情，對于陽性患者結(jié)合病情應(yīng)盡快送往上級醫(yī)療機(jī)構(gòu)完善檢查并給予對應(yīng)的支持治療；對于快速免疫層析檢測陰性而臨床癥狀極度懷疑，結(jié)合當(dāng)時(shí)的流行病學(xué)狀況，應(yīng)該盡早進(jìn)行RNA檢測，推薦使用RTLAMP檢測方法，如此才可使患者的病情能夠盡早確診，盡早得到相應(yīng)治療，流行病學(xué)的監(jiān)測與控制也才能夠更加全面地實(shí)施。

參考文獻(xiàn)

[1]Jarman RG， Nisalak A， Anderson KB， Klungthong C， Thaisomboonsuk B， Kaneechit W， Kalayanarooj S， Gibbons RVFactors influencing dengue virus isolation by C6/36 cell culture and mosquito inoculation of nested PCRpositive clinical samplesAm J Trop Med Hyg，2011，84（2）：218223

[2]Bhatt S， Gething PW， Brady OJ， Messina JP， Farlow AW， Moyes CL， Drake JM， Brownstein JS， Hoen AG， Sankoh O， Myers MF， George DB， Jaenisch T， Wint GR， Simmons CP， Scott TW， Farrar JJ， Hay SIThe global distribution and burden of dengueNature，2013，496（7446）：504507

[3]Zhao H， Zhao L， Jiang T， Li X， Fan H， Hong W， Zhang Y， Zhu Q， Ye Q， Tong Y， Cao W， Zhang F， Qin CIsolation and characterization of dengue virus serotype 2 from the large dengue outbreak in Guangdong， China in 2014Sci China Life Sci，2014，57（12）：11491155

[4]何似，陳潤，李世清，吳護(hù)華，陳燕，徐珊，楊建娜，陳敏紅.快速免疫色譜測試法與免疫熒光法檢測登革病毒IgG抗體的比較.中國人獸共患病雜志，2001，17（2）：5658.

[5]徐建敏，何麗娟，狄飚登革熱抗體二種檢測方法的比較中國人獸共患病雜志，2002，18（4）：9293.

[6]秦鄂德，秦成峰，姜濤登革病毒和登革病毒病北京：科學(xué)出版社，2008，2053

[7] Parida M， Horioke K， Ishida H， Dash PK， Saxena P， Jana AM， Islam MA， Inoue S， Hosaka N， Morita KRapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a realtime reverse transcriptionloopmediated isothermal amplification assayJ Clin Microbiol，2005，43（6）：28952903

[8]Kuno GUniversal diagnostic RTPCR protocol for arbovirusesJ Virol Methods，1998，72（1）：2741

[9]Lanciotti RS， Calisher CH， Gubler DJ， Chang GJ， Vorndam AVRapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptasepolymerase chain reactionJ Clin Microbiol，1992，30（3）：545551

[10]Laue T， Emmerich P， Schmitz HDetection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by using the TaqMan automated amplification systemJ Clin Microbiol，1999，37（8）：25432547

[11]王濤，凌士奇，黃挺，黃捷 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在角膜移植供體乙型肝炎病毒篩查中的應(yīng)用新醫(yī)學(xué)，2011，42（11）：720722.

[12]Sudiro TM， Ishiko H， Green S， Vaughn DW， Nisalak A， Kalayanarooj S， Rothman AL，Raengsakulrach B， Janus J， Kurane I， Ennis FARapid diagnosis of dengue viremia by reverse transcriptasepolymerase chain reaction using 3noncoding region universal primersAm J Trop Med Hyg，1997，56（4）：424429

（收稿日期：20170615）

（本文編輯：林燕薇）