保護酶CAT在木薯種質(zhì)抗螨中的功能初步研究

梁曉 盧芙萍 盧輝 伍春玲 何宏力 陳青 朱俊洪

摘 要 為驗證保護酶CAT在木薯抗螨中的功能，測定分析了朱砂葉螨取食抗、感螨木薯種質(zhì)后，CAT的表達量和酶活分別在木薯和朱砂葉螨中的變化情況。結(jié)果表明，一方面，朱砂葉螨取食1 d和8 d后，感螨木薯種質(zhì)BRA900體內(nèi)MeCAT1的表達量和CAT總酶活僅分別較為害前提高1.11倍、1.24倍和1.06倍、1.15倍，而在抗螨木薯種質(zhì)C1115體內(nèi)則分別較為害前提高2.75倍、2.62倍和2.36倍、2.38倍，均顯著高于感螨木薯水平。另一方面，朱砂葉螨取食感螨種質(zhì)BRA900 1 d和8 d后，保護酶TcCAT的基因表達量和CAT酶活分別是為害前的1.13倍、0.98倍和1.02倍、0.99倍，而取食抗螨木薯種質(zhì)C1115 1 d和8 d后分別降低至為害前的0.57倍、0.61倍和0.52倍、0.61倍，均顯著低于取食感螨木薯水平。以上結(jié)果初步證實了保護酶CAT在木薯中被誘導能夠緩解朱砂葉螨造成的氧化損傷，在朱砂葉螨中被抑制不利于取食為害，從而形成木薯抗螨性的功能。本研究為將CAT作為基因資源應用于抗螨木薯種質(zhì)創(chuàng)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 CAT；朱砂葉螨；木薯種質(zhì)；抗螨功能

中圖分類號 S433.1；S433.7 文獻標識碼 A

Abstract In order to validate the function of catalase（CAT）in cassava resistance to mite， we determined the changes of transcriptions and activities of CAT in either cassava or Tetranychus cinnabarinus after the mite-resistant and mite-susceptible cassava cultivars were damaged by T. cinnabarinus. The results showed that， in one hand， compared to the same leaves before damaged by T. cinnabarinus， the transcriptions of MeCAT1 and total activities of CAT in leaves of 1 d and 8 d-damaged mite-susceptible cassava cultivar BRA900 was 1.11- and 1.24-fold， 1.06- and 1.15-fold， respectively， while the corresponding multiples of transcriptions in 1 d and 8 d-damaged leaves of mite-resistant cassava cultivar C1115 was 2.75- and 2.62-fold， and was 2.36- and 2.38-fold of total activities， respectively， which were both significantly higher than the levels of BRA900. In the other hand， when T. cinnabarinus feeding on BRA900 for 1 d and 8 d， the transcriptions of TcCAT and activities of CAT in T. cinnabarinus was 1.13 and 0.98-fold， 1.02- and 0.99-fold compared to those before feeding， respectively， while the corresponding multiples of transcriptions in T. cinnabarinus feeding on C1115 was 0.57- and 0.61-fold， and were 0.52- and 0.61-fold of total activities， respectively， which were both significantly lower than the levels of BRA900. These results preliminarily demonstrated that the induction of CAT could release oxidative damage caused by T. cinnabarinus， and the suppression of CAT could inhibit the feeding adaption of T. cinnabarinus， which both contribute to cassava resistance to mite. This study provides a theoretical basis for molecular breeding of mite-resistance cassava.

Key words Catalase； Tetranychus cinnabarinus； cassava； resistance to mite

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.024

木薯（Manihot esculenta Crantz）亦稱樹薯，屬大戟科木薯屬，具有粗生粗長，耐貧瘠、干旱、高產(chǎn)、淀粉含量高等特點[1]，是世界8億人口的主糧和中國熱帶地區(qū)重要的工業(yè)原料、飼料、生物質(zhì)能源和救荒作物，是僅次于水稻、玉米、甘蔗、甘薯的第五大作物，因其可在山地、坡地等隨處種植，“不與人爭糧，不與糧爭地”，在熱帶地區(qū)農(nóng)民增收方面發(fā)揮著極其重要的作用。近年來木薯在熱區(qū)的種植面積不斷增加，并逐漸成為中國熱區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一[2]。

朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus Boisduval）是危害木薯最嚴重的世界危險性害螨，自2005年以來，該螨在廣西、廣東、海南、云南、江西等地嚴重發(fā)生與成災，導致當?shù)啬臼頊p產(chǎn)20%～30%，嚴重危害時可造成減產(chǎn)50%～70%[3]，已成為嚴重制約木薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因子之一。目前，各木薯產(chǎn)區(qū)對于朱砂葉螨的防治仍依賴于化學藥劑防治，但朱砂葉螨一般于木薯種植后6～8個月暴發(fā)成災，此時的木薯地已封行，給噴施藥劑造成很大困難，同時由于朱砂葉螨個體小、繁殖能力強、世代短、發(fā)育快等特點，比其他害蟲容易產(chǎn)生抗藥性，在化學防治過程中，因施藥技術(shù)落后、農(nóng)藥的有效利用率不足、使用頻率與劑量不斷加大導致“3R”等問題日趨嚴重[3-4]。因此，尋求新的有效地控制朱砂葉螨的策略和方法成為當前木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的重要問題。

當前，培育抗螨木薯是防治朱砂葉螨最經(jīng)濟、有效、簡便的方法，而抗螨基因的挖掘及其功能研究是采用分子育種手段獲得抗螨木薯的關(guān)鍵。害蟲為害寄主植物時，其造成的組織創(chuàng)傷會在寄主植物體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧，影響植株正常生長。同時，害蟲攝入的植物次生代謝物質(zhì)也會造成害蟲的氧化損傷，不利于取食為害。過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）是導致氧化損傷的主要活性氧之一，過氧化氫酶（Catalase，CAT）能夠?qū)2O2分解為水和氧氣，是將H2O2含量維持在相對穩(wěn)定水平的最重要的抗氧化酶[5-6]。因此，測定分析寄主植物和害蟲互作時CAT基因表達和酶活力的變化情況將有助于研究CAT在作物抗蟲中的功能。研究表明，CAT活性的增加與寄主植物的抗蟲性關(guān)系密切[7-8]。然而迄今為止，尚缺乏保護酶CAT在木薯抗螨中的功能報道。因此，本研究通過測定朱砂葉螨取食抗螨木薯種質(zhì)C1115和感螨木薯種質(zhì)BRA900后，CAT基因表達量和酶活力分別在木薯和朱砂葉螨體內(nèi)的變化情況，初步驗證其在木薯種質(zhì)抗螨中的功能，為采用分子育種手段進行抗螨木薯種質(zhì)創(chuàng)制提供理論基礎(chǔ)和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試木薯種質(zhì) 抗螨木薯種質(zhì)C1115，感螨木薯種質(zhì)BRA900[9]由中國熱農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃提供。

1.1.2 供試朱砂葉螨飼養(yǎng) 參考李遷的方法進行朱砂葉螨的室內(nèi)飼養(yǎng)[9]。

1.1.3 試驗器材 Ultraspec 3000紫外可見光分光光度計（Pharmacia Biotech， Ltd.， Cambridge， UK）、MJ Research PTC-100 PCR儀（MJ Research Inc.）組織勻漿機、高速冷凍離心機、Bio-Rad iCycler & iQ Real-Time PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）等。

1.1.4 試驗藥品 配制緩沖液的相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，緩沖液按照分子克隆實驗指南（第三版）配制。RNA提取及酶活測定相關(guān)試劑均購自Sigma公司（Sigma-Aldrich Company，USA）。Trizol試劑盒Invitrogen（Invitrogen Inc. USA），DNaseⅠ試劑盒，cDNA合成試劑盒，Master mix，MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒均為Fermentas公司產(chǎn)品（Fermentas， Glen Burnie， MD）。

1.2 方法

1.2.1 酶液提取及活性測定 測定木薯葉片的CAT酶活時，將50頭朱砂葉螨雌成螨接種于室內(nèi)種植3個月的木薯頂芽下方葉片上。為測定CAT酶活性在抗螨木薯C1115和感螨木薯BRA900中的變化趨勢，取100 mg受螨害的葉片用于酶液提取，同時以為害前的100 mg葉片組織CAT酶活作為對照。采樣從接種害螨1 d一直進行到14 d，采樣間隔期也為1 d，以確定CAT酶活變化最顯著的取樣時間。測定朱砂葉螨CAT酶活時，將大約200頭朱砂葉螨雌成螨接種于采自田間生長6個月的健康木薯葉片上，并按照1.1.2的方法室內(nèi)飼養(yǎng)，分別取200頭取食前，取食抗、感木薯葉片的成螨用于酶活分析。上述各個木薯或朱砂葉螨處理均設(shè)置3個重復。CAT酶活測定參照Lu[10]的方法以H2O2的消耗量來計算。測定時反應混合液（1.5 mL）包含50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0），15 mmol/L H2O2，以及100 μL酶提取液。H2O2的消耗量通過測定240 nm波長下的吸光值，并由摩爾消光系數(shù)（36 mol/L cm）定量。CAT的酶活表示為CAT單位/每分鐘/每克蛋白。

1.2.2 保護酶基因CAT表達量的熒光定量PCR測定

木薯葉片和朱砂葉螨的RNA樣品采集方法與酶活分析相同，兩者總RNA的提取參照Trizol RNA提取試劑盒進行。經(jīng)gDNA Eraser（TaKaRa Biochemicals， Dalian， China）處理去除基因組DNA后，取1.0 μg RNA用于cDNA的合成。cDNA樣品經(jīng)nuclear-free水10倍稀釋后作為熒光定量PCR的模板，分別以木薯Meactin和朱砂葉螨Tcactin為管家基因，相關(guān)基因的引物信息[11]如表1所示。PCR反應條件為：95 ℃預溫育1 min后，以40個循環(huán)完成如下程序：95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s。分別以來源于未經(jīng)朱砂葉螨為害的木薯葉片和未取食木薯葉片的朱砂葉螨的cDNA為對照，被為害或取食的木薯MeCAT1和朱砂葉螨TcCAT基因表達量以為害前的相對倍數(shù)表示，根據(jù)Pfaffl的2-ΔΔCt方法計算而得[12]，每個處理均設(shè)置3個重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異分析采用Student's t-test方法，所有數(shù)據(jù)均為3個生物學重復的平均值±標準（Means±SE），顯著性檢測水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗、感木薯種質(zhì)受朱砂葉螨為害后CAT酶活變化趨勢分析

從圖1可以看出，抗螨木薯種質(zhì)C1115受朱砂葉螨為害1 d后，葉片中CAT的活性與為害前相比顯著升高，隨后酶活變化倍數(shù)緩慢增加至8 d達到最大值，而為害9～14 d時，又呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，1～14 d內(nèi)抗螨木薯CAT的活性分別達到為害前的2.05～2.37倍，并始終維持在顯著升高的水平（Student's t-test， p<0.05）。感螨木薯種質(zhì)受螨害1～8 d過程中，CAT活性變化不大，分別達到為害前的1.06～1.23倍，而受螨害9～14 d過程中，隨著木薯葉片受害逐漸嚴重，CAT活性分別顯著降低至受害前的0.62～0.16倍?；谝陨辖Y(jié)果，我們最終選擇1 d和8 d作為CAT酶活和基因表達量測定的最佳時間點。

2.2 朱砂葉螨為害前后抗、感木薯葉組織中MeCAT1基因表達量差異分析

從圖2可以看出，朱砂葉螨為害前后抗、感木薯種質(zhì)葉組織中MeCAT1基因表達量變化倍數(shù)存在顯著差異。朱砂葉螨為害1 d和8 d后，感螨木薯種質(zhì)BRA900葉組織中MeCAT1的基因表達量僅分別較為害前提高1.11倍和1.24倍，而抗螨木薯種質(zhì)C1115葉組織中MeCAT1的基因表達量較為害前分別提高2.75倍和2.62倍，以上結(jié)果表明抗螨木薯種質(zhì)C1115能夠通過顯著提高保護酶MeCAT1的轉(zhuǎn)錄水平，有效清除朱砂葉螨為害累積的活性氧，從而較感螨種質(zhì)BRA900具有更強的抗螨害能力。

2.3 朱砂葉螨為害前后抗、感木薯種質(zhì)葉組織中CAT總活力差異分析

從圖3可以看出，朱砂葉螨為害前后抗、感木薯種質(zhì)葉組織中CAT總活力存在顯著差異。朱砂葉螨取食1 d和8 d后，感螨木薯種質(zhì)BRA900葉組織中CAT總活力較為害前提高1.06倍和1.15倍，而抗螨木薯種質(zhì)C1115葉組織中CAT總活力較為害前分別提高2.36倍和2.38倍，以上結(jié)果表明木薯葉片中CAT總活力的變化趨勢與基因水平相一致，抗螨木薯種質(zhì)C1115通過顯著提高保護酶CAT的活力，有效清除朱砂葉螨為害累積的活性氧，從而較感螨種質(zhì)BRA900具有更強的抗螨害能力。

2.4 取食抗、感木薯種質(zhì)前后朱砂葉螨體內(nèi)TcCAT基因表達差異分析

從圖4可以看出，取食抗、感木薯種質(zhì)前后朱砂葉螨體內(nèi)TcCAT基因表達量變化存在顯著差異。朱砂葉螨取食感螨木薯種質(zhì)BRA900 1 d、8 d后體內(nèi)保護酶TcCAT的表達量分別是為害前的1.13倍和0.98倍，而取食抗螨木薯種質(zhì)C1115 1 d、8 d后TcCAT的表達量降低至為害前的0.57倍和0.61倍。上述結(jié)果表明與取食感螨種質(zhì)BRA900相比，取食抗螨種質(zhì)C1115后，朱砂葉螨體內(nèi)TcCAT表達受到了顯著抑制削弱了朱砂葉螨修復自身氧化損傷的能力，不利于其為害抗螨種質(zhì)C1115。

2.5 取食抗、感木薯種質(zhì)前后朱砂葉螨體內(nèi)CAT酶活力差異分析

從圖5可以看出，取食抗、感木薯種質(zhì)前后朱砂葉螨體內(nèi)CAT酶活力變化存在顯著差異。朱砂葉螨取食感螨木薯種質(zhì)BRA900 1 d、8 d后體內(nèi)CAT酶活力分別是為害前的1.02倍和0.99倍，而取食抗螨木薯種質(zhì)C1115 1 d、8 d后CAT酶活力降低至為害前的0.52倍和0.61倍。上述結(jié)果表明朱砂葉螨取食抗、感螨木薯種質(zhì)后酶活的變化趨勢與基因水平一致，取食抗螨種質(zhì)C1115后CAT酶活力被顯著抑制削弱了朱砂葉螨修復自身氧化損傷能力，不利于其為害抗螨種質(zhì)C1115。

3 討論

寄主植物受害蟲為害后保護酶被誘導與其植物抗蟲性顯著相關(guān)[8，10，14]。Bendnarski等[6]測定了豌豆幼苗葉子受長管蚜為害后的氧化應激反應，發(fā)現(xiàn)CAT活性的提高可以顯著增強豌豆苗的抗蚜力。王梅玉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種番茄受刺皮癭螨為害后體內(nèi)CAT等保護酶活性有所提高，且以抗螨品系YZ618提高幅度最大。Lu等[14]研究發(fā)現(xiàn)抗螨橡膠樹種質(zhì)被6點始葉螨取食后，CAT的活性也呈現(xiàn)顯著提高的趨勢。此外，研究還發(fā)現(xiàn)CAT等保護酶活性被誘導可能與黃瓜幼苗應對煙粉虱為害的自我保護機制相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯種質(zhì)C1115被朱砂葉螨為害后，MeCAT1基因表達量和CAT總酶活均較為害前有顯著提高，并且表達量提高倍數(shù)顯著高于感螨種質(zhì)BRA900。保護酶CAT能夠有效緩解朱砂葉螨取食后造成的氧化損傷，是形成C1115的抗螨能力的重要因素。

害蟲取食寄主植物時，害蟲體內(nèi)保護酶基因表達量和酶活性顯著被抑制也與寄主植物抗蟲性關(guān)系密切[16-17]。Krishnan等[16]發(fā)現(xiàn)棉貪夜蛾取食西紅柿后體內(nèi)CAT的活性顯著高于取食半人工飼料，并推斷CAT活性增強是形成其對西紅柿寄主取食適應性的主要因素。對森林天幕毒蛾和白斑毒蛾的研究表明[17]，兩種毒蛾取食寄主植物時攝入的單寧酸均能夠顯著抑制中腸CAT的活性而不利于其為害。本研究中朱砂葉螨取食抗螨木薯種質(zhì)C1115后，體內(nèi)TcCAT的表達量和活性與取食前相比顯著下降，表明抗螨木薯C1115抑制了朱砂葉螨CAT修復自身氧化損傷的功能，不利于被朱砂葉螨為害；而朱砂葉螨取食感螨木薯種質(zhì)BRA900后，體內(nèi)CAT的表達量和活性與取食前相比變化不大，說明朱砂葉螨能夠正常啟動活性氧清除機制以應對攝入的次生代謝物質(zhì)造成的氧化損傷，從而易于在感螨木薯BRA900上為害。

本研究表明抗螨木薯能夠通過提高CAT基因表達量和酶活增強自身修復氧化損傷能力，同時通過抑制朱砂葉螨CAT酶活不利于螨害發(fā)生。以上兩個方面是木薯形成抗螨能力的重要因素，并初步證實保護酶CAT在木薯種質(zhì)抗螨中的功能，具有作為有效基因資源應用于抗螨木薯分子育種的應用潛力，但其功能有待進一步研究與驗證。

參考文獻

[1] Cock J H. Cassava： a basic energy source in the tropics[J]. Science， 1982， 218（4574）： 755-762.

[2] 伍 薇， 柯佑鵬. 中國木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及前景展望[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)， 2011， 12（3）： 6-9.

[3] 陳 青， 盧芙萍， 黃貴修， 等. 木薯害蟲普查及其安全性評估[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（5）： 819-827.

[4] Smith C M. Plant resistance to insects. A fundamental approach[M]. New York： John Wiley and Sons Ltd.， 1989.

[5] Andre C， Kim S W， Yu X H， et al. Fusing catalase to an alkane-producing enzyme maintains enzymatic activity by converting the inhibitory byproduct H2O2 to the cosubstrate O2[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2013， 110（8）： 3 191-3 196.

[6] 胡甘雨， 司風玲， 車燕飛， 等， 蔥蠅過氧化氫酶基因的克隆及生物信息學分析[J]. 西南大學學報（自然科學版）， 2014， 34（1）： 32-40.

[7] 李毅平， 龔 和. 昆蟲體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)研究進展[J]. 生命科學， 1998， 10 （5）： 240-243.

[8] Bednarski， W Borowiak-Sobkowiak， B Wilkaniec， et al. Oxidative stress in pea seedling leaves in response to Acyrthosiphon pisum infestation[J]. Phytochemistry， 2013， 93： 49-62.

[9] 李 遷， 盧芙萍， 陳 青， 等. 木薯種質(zhì)對朱砂葉螨的抗性評價[J]. 熱帶作物學報， 2015， 36（1）： 143-151.

[10] Lu F， Chen Q， Chen Z， et al. Effects of heat stress on development， reproduction and activities of protective enzymes in Mononychellus mcgregori[J]. Exp Appl Acarol， 2014， 63（2）： 267-284.

[11] Xu J， Duan X， Yang J， et al. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots[J]. Plant Physiol， 2013， 161（3）： 1 517-1 528.

[12] Pfaffl， M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res， 2001， 29（9）： e45-e45.

[13] 王梅玉， 王冬生， 洪曉月， 等. 番茄葉片理化性質(zhì)差異與抗番茄刺皮癭螨性[J]. 昆蟲知識， 2008， 45（6）： 904-908.

[14] Lu F， Chen Z， Lu H， et al. Effects of resistant and susceptible rubber germplasms on development， reproduction and protective enzyme activities of Eotetranychus sexmaculatus （Acari： Tetranychidae）[J]. Exp Appl Acarol， 2016： 1-17.

[15] Zhang S Z， Hua， B Z， Zhang F. Induction of the activities of antioxidative enzymes and the levels of malondialdehyde in cucumber seedlings as a consequence of Bemisia tabaci （Hemiptera： Aleyrodidae） infestation[J]. Arthropod-Plant Inte， 2008， 2（4）： 209-213.

[16] Krishnan N， Kodrík， D. Antioxidant enzymes in Spodoptera littoralis （Boisduval）： are they enhanced to protect gut tissues during oxidative stress？[J]. J Insect Physiol， 2006， 52（1）： 11-20.

[17] Barbehenn R V. Gut-based antioxidant enzymes in a polyphagous and a graminivorous grasshopper[J]. J Chem Ecol， 2002， 28（7）： 1 329-1 347.