‘火焰’品種彩色馬蹄蓮組培快繁體系的建立及優(yōu)化

張慧 羅珍珍 由翠榮 孔艷輝 解曉旭 孫印兵

摘要[目的]建立并優(yōu)化‘火焰品種彩色馬蹄蓮組培快繁體系。[方法]以‘火焰品種彩色馬蹄蓮的球莖嫩芽為試驗材料，對其組織培養(yǎng)無性繁殖體系進行研究。[結果]最佳誘導培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；植株再生最適合培養(yǎng)基為 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。[結論]該研究建立了‘火焰品種彩色馬蹄蓮的組培快繁體系，為其快速繁殖及產業(yè)化生產提供了技術和理論依據(jù)。

關鍵詞‘火焰彩色馬蹄蓮；組培快繁；優(yōu)化

中圖分類號S682.2+64文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）16-0133-03

The Establishment and Optimization of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Zantedeschia hybrida ‘Flame

ZHANG Hui1，LUO Zhenzhen1，YOU Cuirong2 et al（1.Yantai Landscape Scientific Institute，Yantai，Shandong 264000；2.College of Life Science，Yantai University，Yantai，Shandong 264005）

Abstract[Objective]To establish and optimze the tissue culture and rapiad progration system of Zantedeschia hybrida ‘Flame.[Method]The bulb shoots of Z.hybrida ‘Flame were used as experimental materials to study the system of tissue culture and rapid propagation.[Result]The optimal medium for induction was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The best proliferation medium was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The most suitable plant regeneration medium was 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The optimum rooting medium was 1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L activated carbon.[Conctustion]The tissue culture and rapid propagation system of Z.hybrida‘Flame was established to provide technology and the theoretical forndation for its rapid propagation and industrialized production.

Key wordsZantedeschia hybrida ‘Flame；Tissue culture and rapid propagation；Optimization

基金項目山東省科技發(fā)展計劃項目（2013GNC11037）；煙臺市科技發(fā)展計劃項目（2015GNC113）

作者簡介張慧（1985—），女，山東濟南人，中級工程師，碩士，從事園林植物組織培養(yǎng)研究。

收稿日期2017-04-12

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）為天南星科馬蹄蓮屬多年生草本植物，葉形奇特、花色艷麗，不論作為切花還是盆栽都有極好的觀賞效果[1]。近年來，彩色馬蹄蓮已成為我國重要的新興花卉品種，具有極大的市場發(fā)展?jié)摿?。傳統(tǒng)上，彩色馬蹄蓮多采用播種法和塊莖分割繁殖，周期長、繁殖系數(shù)低，在生產繁殖過程中易受環(huán)境因子的制約[2]。尤其是分生繁殖易誘發(fā)病毒病，導致種系退化、產量和品質下降，很難保持彩色馬蹄蓮原有的優(yōu)良性狀。組培離體快繁可以有效縮短繁育周期，節(jié)約成本，起到提純復壯的作用，是實現(xiàn)產業(yè)化生產的有效途徑。

國內外關于彩色馬蹄蓮離體快繁無性體系的建立已有較多研究與報道。1981 年Cohen等[3]成功地進行了馬蹄蓮的離體培養(yǎng)。國內，彩色馬蹄蓮首先于1988年在廣西引種成功[4] ，我國對馬蹄蓮組織培養(yǎng)的研究起步較晚，最早于1989年由林榮等[5]報道了馬蹄蓮離體培養(yǎng)的成功，20世紀90年代末，李倩中等[6]、吳麗芳等[7]對彩色馬蹄蓮的組培方法進行了研究報道。2000年后關于彩色馬蹄蓮離體培養(yǎng)的研究越來越多，彭峰等[8]對‘凍糕的組培體系建立進行了研究；鄭柱等[9]、張麗等[10]進行了黃色馬蹄蓮離體快繁及叢生芽誘導優(yōu)化的研究；束曉春等[11]研究了不同的消毒方法和激素水平對‘檸檬品種彩色馬蹄蓮離體繁殖的影響；王偉英等[12]對‘高原品種彩色馬蹄蓮離體快繁各階段的培養(yǎng)條件及激素進行了篩選。

‘火焰品種彩色馬蹄蓮，花色艷麗，黃中透紅，猶如火焰，葉型優(yōu)美，帶有透明斑點，市場認可度極高，但關于此品種彩色馬蹄蓮離體快繁的報道較少，該試驗在前人研究的基礎上，對‘火焰品種彩色馬蹄蓮的叢生芽誘導、增殖、植株再生、生根及試管苗煉苗移栽等進行了進一步研究和優(yōu)化，以期提出一套適宜該品種彩色馬蹄蓮組培快繁的簡便快捷的方法，以指導產業(yè)化生產。

1材料與方法

1.1材料

供試植物為‘火焰品種彩色馬蹄蓮，自新西蘭引進，以其球莖嫩芽為外植體，對其無性繁殖體系進行建立及優(yōu)化。

1.2方法

該試驗初培養(yǎng)誘導及不定芽增殖以MS為基本培養(yǎng)基，而植株再生及生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂粉5.8 g/L，蔗糖30 g/L，肌醇、酪蛋白各100 mg/L， pH為5.8，121 ℃/ 20 min高壓滅菌。培養(yǎng)室溫度為（25±1）℃，相對濕度一般保持在70%～75%，光照強度為2 000～3 000 lx，光照周期為每天16 h。

1.2.1不同6-BA濃度對初代叢生芽誘導的影響。

‘火焰品種球莖嫩芽外植體，先用3 g/L 50%多菌靈可濕性粉劑浸泡12～18 h，再選取球莖上的嫩芽，切成長度約1 cm的小塊，在中性洗滌劑溶液中浸泡15 min，流水沖洗1 h，無菌濾紙吸干材料表面水分后，放入無菌瓶中，用0.1% HgCl2溶液浸泡7 min，再用2% NaClO溶液滅菌10 min，無菌水沖洗5次，每次5 min。將滅菌后的球莖嫩芽切成0.5 cm左右，接種在NAA濃度為0.2 mg/L，6-BA濃度分別設置為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L的誘導培養(yǎng)基上，每瓶接種2塊，每個處理接種15瓶，先暗培養(yǎng)20 d，再進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d統(tǒng)計并計算叢生芽誘導率。

1.2.2不同6-BA濃度對叢生芽繼代增殖的影響。

將各品種彩色馬蹄蓮初代培養(yǎng)得到的叢芽塊分割為約0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種于不同6-BA濃度的MS培養(yǎng)基中，設置6-BA濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，添加NAA（0.2 mg/L），每個處理接種10瓶，每瓶6塊，設3次重復。光照培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計不定芽增殖面積、增殖倍數(shù)以及大于1 cm的植株數(shù)。

1.2.3不同6-BA濃度對不定芽植株再生的影響。

將叢芽塊分割為約0.5 cm×0.5 cm的小塊，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA（0.2 mg/L），分別設置6-BA濃度為0（CK）、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L，每個處理接種10瓶，每瓶6塊，設3次重復。光照培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計不定芽增殖面積、增殖倍數(shù)以及大于1 cm的植株數(shù)。

1.2.4不同活性炭濃度對再生植株生根的影響。

選取高度均勻、生長良好、約3 cm的植株，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA（0.2 mg/L），設置活性炭濃度0（CK）、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L，每個處理接種10瓶，每瓶6塊，設3次重復。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計各植株的生根數(shù)，調查株高。

1.3數(shù)據(jù)分析試驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行單因素或兩因素方差分析，并采用LSD、Duncans新復極差法等檢測各處理組間試驗結果的差異顯著性。

2結果與分析

2.1不同6-BA濃度對初代叢生芽誘導的影響

‘火焰品種球莖嫩芽外植體經45 d初代培養(yǎng)，在添加不同6-BA濃度的培養(yǎng)基中均可誘導形成叢生芽和愈傷組織。由表1可知，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，誘導出的愈傷組織和叢生芽都極少且黃化；平均叢生芽誘導率在添加2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中最高（29.6%），該濃度下叢生芽濃綠健壯，生長狀況最好；而6-BA濃度為3.0 和4.0 mg/L時，誘導出的愈傷組織相對較多，叢生芽量少且細弱。同時初培養(yǎng)誘導結果顯示，球莖嫩芽作為外植體，可以通過器官直接發(fā)生途徑誘導產生叢生不定芽，其最適誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

2.2不同6-BA濃度對叢生芽繼代增殖的影響

由表2可知，6-BA濃度為2.0 mg/L時，‘火焰品種不定芽的平均增殖面積和增殖倍數(shù)分別為4.6 cm2和8.2，效果最佳，與其他處理存在顯著差異；在4.0 mg/L 6-BA處理下的增殖效果最差。另外，大于1 cm植株數(shù)在該組試驗中都較少，在低濃度1.0 mg/L時平均分化出1.0株。綜合考察可知，不定芽增殖的最適培養(yǎng)基均為1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L。

2.3不同6-BA濃度對不定芽植株再生的影響

光照培養(yǎng)45 d后，不定芽分化率達100%。由表3可知，6-BA濃度為0.2和0.8 mg/L的處理，不定芽塊生長較好，增殖面積都超過4.0 cm2，且6-BA濃度為0.8 mg/L時，增殖倍數(shù)為6.4。6-BA濃度為0.2 mg/L時，大于1 cm植株數(shù)為6.3株，與其他處理具有顯著差異。由此可知，火焰不定芽植株再生的最適培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

2.4不同活性炭濃度對再生植株生根和株高的影響

由圖1可知，不同活性炭濃度對再生植株生根的影響存在顯著差異。未添加活性炭的對照中，植株根數(shù)較多，但都未超過1 cm，且植株高度在所有處理中最矮；隨活性炭濃度增高（0～4.0 g/L），植株生根數(shù)先增加后減少。活性炭濃度為2.0 g/L時，平均每株生根數(shù)達2.5條，明顯優(yōu)于其他處理，此時植株根系長且發(fā)達，有許多側根長出，平均每株植株高度為6.9 cm。綜合各指標結果表明，活性炭對‘火焰生根具有顯著促進作用，最適濃度為2.0 g/L。

2.5試管苗的煉苗及移栽

將生根試管苗不開瓶蓋煉苗3 d，打開瓶蓋后煉苗2 d。取出試管苗，在清水中洗滌2次，小心洗去根部的培養(yǎng)基，盡量不要損傷根部。栽到播種土和珍珠巖以3∶1混合的基質中，用水澆透，置于苗床上，并搭塑料小拱棚，保濕處理2 d，成活率可達98%。

3討論

3.1外植體的選擇及初培養(yǎng)叢生芽誘導

該試驗是以球莖嫩芽作為外植體，通過不定芽發(fā)生途徑來建立離體快繁體系。鄭柱[13]也是以切割直徑為0.4～0.6 cm的嫩芽塊作為外植體，認為添加NAA 0.1 mg/L、6-BA 2.0 mg/L至MS培養(yǎng)基中誘導效果最好；趙潤洲等[14]也是通過不定芽途徑建立彩色馬蹄蓮離體快繁體系，得出最佳不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。也有很多學者以葉片作為外植體，采用愈傷組織間接發(fā)生途徑，如龔雪琴等[15]選用葉片作為外植體，認為在MS 培養(yǎng)基中添加6-BA 和2，4-D 對愈傷誘導率有顯著影響，6-BA和2，4-D 影響胚性愈傷組織的誘導，不同激素的配比也是關鍵因素；劉金朗[16]對2種彩色馬蹄蓮品種的幼嫩葉片進行了初代誘導研究，認為在MS+ KT 5.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，30～40 d即可產生愈傷組織。

2種方式都可以建立植物的離體快繁體系，以葉片作為外植體是通過脫分化形成愈傷組織，再分化出不定芽，然后進行繼代增殖，生根培養(yǎng)，最終形成再生植株。相對而言，這一過程比較漫長且容易引起變異，使再生植株失去原有的優(yōu)良性狀。而通過誘導不定芽建立其離體快繁體系，能夠縮短時間，節(jié)省成本，且有利于優(yōu)良性狀的保持[2]。通過何種方式建立快繁體系也與植物品種及外植體的選擇有較大關系。

3.2品種增殖及植株再生的激素及濃度

彩色馬蹄蓮組培過程中，激素濃度和種類是影響其快繁增殖及分化的主要因素 [17-19]。該研究顯示，6-BA濃度是影響叢生芽增殖的關鍵因素，試驗通過6-BA與NAA配合使用來促進不定芽的增殖，結果表明1.0～4.0 mg/L 6-BA均可實現(xiàn)增殖，但明顯表現(xiàn)為低濃度下促進不定芽再生植株的生長，而高濃度有利于不定芽的大量增殖。這與鄭柱[13]、王進忠等[20]的觀點一致。前者認為在添加1.5～2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時，能顯著促進黃花馬蹄蓮叢生芽的大量增殖，而后者認為高濃度6-BA 有利于愈傷組織和芽的分化，低濃度則對芽的生長有利。另外選擇生長素0.2 mg/L NAA與細胞分裂素6-BA相互配合來促進植株再生，這與王偉英等[12]、張麗等[10]的研究觀點是一致的。也有研究者采用6-BA與其他的激素配合來促進不定芽增殖及分化。何俊蓉等[21]認為，叢芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L，再將其轉接到低濃度的NAA 上以促進不定芽分化成苗；龔雪琴等[15]認為，繼代和愈傷組織繼續(xù)發(fā)生的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L。研究結果不盡相同，可能與研究品種不同及離體快繁體系各環(huán)節(jié)預設條件不同都有一定的關系。

45卷16期張 慧等‘火焰品種彩色馬蹄蓮組培快繁體系的建立及優(yōu)化

3.3再生植株生根該試驗添加2.0 g/L活性炭促進再生植株生根，這與趙潤洲等[14]、李開云等[22]的研究觀點是一致的，只是活性炭的添加量存在差異。趙潤洲等[14]認為，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 mg/L；李開云等[22]認為，MS+NAA 0.5 mg/L+0.2%活性炭效果最好。該試驗選取NAA作為促進生根的外源激素，也有很多研究采用IBA作為外源激素，如張軍云等[23]認為添加IBA 0.3 mg/L對生根的誘導效果最佳；孫新政等[24]用6-BA配合0.2 mg/L IBA促進紅色馬蹄蓮生根；邵果園等[17]用0.2 mg/L IBA促進黃色馬蹄蓮生根，促進生根所選用激素不同可能與品種不同有較大的關系。應用何種激素更加經濟實惠也是產業(yè)化生產需要考慮的問題。

4結論

該試驗建立并優(yōu)化了‘火焰品種彩色馬蹄蓮的離體快繁無性繁殖體系，結果表明，以球莖嫩芽作為外植體，最佳誘導培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，叢生芽誘導率可達29.6%，此時叢生芽量多，生長健壯；最佳增殖配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍數(shù)最大為8.2；植株再生最適合培養(yǎng)基為 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。

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