抗性家蠶血液中與BmNPV抗性相關銅化合物的分離方法研究

李龍　孫慧　劉澤玉

摘要[目的]探究家蠶血淋巴中與BmNPV抗性相關銅化合物的分離方法。[方法]選取對 BmNPV 具有抗性的家蠶品種和非抗性品種為研究對象，對它們進行添食 BmNPV 病毒處理。提取家蠶的血淋巴，運用SEC-ICP-MS對2組樣品中Cu化合物進行分離和檢測。[結(jié)果]篩選出優(yōu)化的體積排阻色譜分離條件：YarraTM SEC-2000分離柱，30 mmol/L Tris-醋酸為流動相（pH 7.4），流速0.5 mL/min。建立了分離與檢測家蠶血液中Cu化合物的SEC-ICP-MS聯(lián)用技術。BmNPV抗性和非抗性家蠶血液中Cu化合物主要的差異是位于7.6 min的組分。[結(jié)論]制備了葡聚糖G100凝膠柱分離并收集可能與BmNPV 抗性相關的家蠶血液分離液，為家蠶金屬蛋白的分離提供更簡便有效的方法。

關鍵詞家蠶；BmNPV；抗性；體積排阻色譜；電感耦合等離子體質(zhì)譜

中圖分類號S881.2文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）20-0111-06

Abstract[Objective] To study the separation methods of copper compounds related to BmNPV resistance in hemolymph of Bombyx mori. [Method] B. mori cultivars with and without BmNPV resistance were selected as research objects to feed BmNPV virus.Cu compounds was extracting and determinated from hemolymph of two groups B.mori by SECICPMS.[Result] The optimal seperation conditions for size exclusion chromatography were as follows：YarraTM SEC2000，30 mmol/L Trisacetic acid（pH 7.4） as mobile phase， flow rate of 0.5 mL/min. SECICPMS technology for separating and detecting copper compounds in hemolymph of B. mori was established. The main differences of copper compounds between resistant cultivars of B. mori and nonresistant cultivars of B. mori was the compounds with the retention time of 7.6 min. [Conclusion] The separation liquid of hemolymph of Bombyx mori might be related with BmNPV resistance seperated and collected by glucan G100 gel column was prepared. The research can provide simpler and more effective methods for the seperation of metal proteins in B. mori.

Key wordsBombyx mori；BmNPV；Resistance；Size exclusion chromatography；ICPMS

蠶絲產(chǎn)業(yè)在我國已有5 000多年的歷史，長久以來為中華民族文化、經(jīng)濟和社會發(fā)展做出了重大貢獻[1]。然而，每年因蠶病感染造成的損失占蠶業(yè)生產(chǎn)總收入的20%左右[2]，其中因為家蠶核型多角體病毒（BmNPV）感染帶來的家蠶核型多角體病毒病在家蠶的生長中非常多見，對蠶業(yè)生產(chǎn)的危害極，大約占蠶病給蠶繭造成經(jīng)濟損失的70%[3]。在過去的幾十年，對BmNPV的研究主要集中在鑒定、分類[4]、感染途徑[5]、生物反應器[6]和殺蟲劑[7]的研究，在家蠶抗病毒感染機制方面的研究甚少。徐安英等[8]利用從家蠶種質(zhì)資源中篩選出的具有抗BmNPV病的顯性基因，采用雜交、回交及系統(tǒng)選育的方法，培育出適應不同季節(jié)、蠶區(qū)的抗BmNPV品種，即華康1號、華康2號?？茖W家們在篩選出抗BmNPV家蠶品種的同時，也深入研究了家蠶對BmNPV抗性的分子機制。2013年，F(xiàn)eng等[9]篩選出對BmNPV抗性家蠶NB品種，并對其遺傳規(guī)律進行了重新分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗性表現(xiàn)出單基因控制的遺傳規(guī)律，認為這些規(guī)律可能是由于抗性品種的不斷篩選，使得家蠶的主效基因被強化，微效基因的作用則愈加不明顯。

迄今為止，科學家們獲得許多與家蠶對BmNPV抗性有關的分子標記信息，但目前還不能利用分子標記和圖位克隆的方法定位抗性基因，因此，人們考慮從不同的組學研究方法入手進行相關機理的探索，尤其是蛋白質(zhì)組學。關于家蠶抗NPV蛋白質(zhì)組水平研究還處于起步階段，目前各研究小組通過多種大通量組學方法獲得了一些家蠶抗BmNPV的差異表達基因和蛋白質(zhì)，這些不同方法獲得的數(shù)據(jù)可以相互驗證、相互補充。例如，無論是在蛋白水平還是在mRNA水平，感性品系中的家蠶胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine protease）、家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑5（Bmserpin-5）和家蠶胰凝乳蛋白酶抑制劑CI-8A（Chymotrypsin inhibitor CI-8A）在添毒后沒有明顯變化。但是，這些酶在抗性家蠶中腸和脂肪體中的表達顯著上調(diào)，表明與這些因子相關的酚氧化酶級聯(lián)途徑在家蠶抗BmNPV的過程中確實起到一定的作用[10-12]。

金屬組學是蛋白質(zhì)組學的重要組成部分，生物體內(nèi)約1/3的蛋白質(zhì)與微量元素（主要是金屬元素）結(jié)合形成金屬蛋白或金屬酶[13]。這些金屬元素的存在對于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的發(fā)揮是必不可少的。體內(nèi)微量元素水平的反常、存在形態(tài)的變化以及特定的金屬酶、金屬蛋白的表達、定位、結(jié)構(gòu)、功能等的變化常常與某些病理狀態(tài)相關，甚至是關鍵的病理環(huán)節(jié)。金屬蛋白在結(jié)構(gòu)維持、金屬離子存儲和轉(zhuǎn)運、電子傳遞、分子識別與催化、基因表達調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、氧化應激等方面都發(fā)揮著非常重要的作用[14]。目前，對家蠶金屬蛋白的研究報道較少，已有的報道主要涉及金屬酶和一些金屬蛋白的分離純化及部分性質(zhì)的研究。目前，已經(jīng)鑒定出的家蠶金屬蛋白酶包括過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）以及過氧化物酶（POD）[15-17]。研究表明，某些金屬元素會影響家蠶體內(nèi)其他酶[如堿性磷酸酶（AKP）和家蠶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等]的活性作用[18-19]，但是由于分離與純化技術的限制，這些金屬蛋白酶的作用機制尚不明確。

為了探明各金屬蛋白在不同生化過程中的作用機理和在生物體的不同生物功能，研究這些金屬蛋白的結(jié)構(gòu)、含量及其在生物組織中的分布與變化規(guī)律往往是十分必要的，而金屬蛋白的提取和分離又是實現(xiàn)準確的金屬蛋白結(jié)構(gòu)預測和定量分析的前提[20]。常用的蛋白分離技術包括高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳（CE）和電泳等技術。其中，高效液相色譜用于分離金屬蛋白時，對金屬與蛋白的結(jié)合影響較小，保證了金屬蛋白在分離過程中的完整性。Yang等[21]建立了體積排阻色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法，同時測定了印度芥菜中鎘、銅、鋅形態(tài)分析方法，并檢測到3種金屬的4種結(jié)合肽形態(tài)。趙艷芳等[22]運用體積排阻色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術分析了高鎘累積扇貝中鎘與蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合形態(tài)，共檢測到 3種鎘形態(tài)：金屬硫蛋白（MT）-Cd、谷胱甘肽（GSH）-Cd、半胱氨酸（Cys）-Cd。為了滿足復雜生物樣品的分離，目前還發(fā)展了多維 HPLC技術。多維 HPLC 是利用2種或2種以上的分離機理不同的模式對復雜樣品進行分離的一種技術，它是將由第1種分離模式分離的全部或部分組分轉(zhuǎn)入到另1種或幾種不同類型的分離模式中進行進一步分離，從而大大提高了整個系統(tǒng)的分離效果和峰容量[23-24]。Barnett等[25]利用離線的二維 SEC/SAX（陰離子交換色譜）模式分離藍藻體內(nèi)金屬蛋白，并與用凝膠電泳法分離的金屬蛋白進行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二維 SEC/SAX 分離后質(zhì)譜得到了更多的預期和非預期金屬結(jié)合蛋白，同時展現(xiàn)出色譜方法分離金屬蛋白的優(yōu)勢，即不需標記、可保持蛋白活性以及分離速度快等。

Cu是許多酶中的必需元素，Cu與有機配體形成的配合物不僅具有氧化、還原、催化、超分子化合物結(jié)構(gòu)控制等重要作用，而且具有抗菌、抗癌、抗病毒等生物活性[26]。家蠶體內(nèi)血淋巴中的Cu元素含量在0.5 μg/mL左右，中腸和脂肪體中含量更高[27]。因此，筆者嘗試從Cu金屬化合物層面，分析家蠶抗性與某些Cu金屬化合物的潛在聯(lián)系，為研究家蠶對BmNPV的抗性機制提供線索。筆者選取對 BmNPV 具有抗性的家蠶品種和非抗性品種為研究對象，對其進行添食 BmNPV 病毒處理，提取供試家蠶的血淋巴，用SEC-ICP-MS 聯(lián)用技術對2組樣品中Cu金屬化合物進行分離和檢測，同時考察了體積排阻色譜流動相的組成、色譜柱填料和流速等對家蠶血淋巴中銅化合物分離效果的影響，篩選出優(yōu)化的分離條件。另外，建立了HPLC結(jié)合葡聚糖凝膠柱的方法，分離出可能與家蠶抗BmNPV相關的Cu化合物組分，旨在為今后這些可能與抗性相關Cu化合物的鑒定提供更加有效的分離方法。

1材料與方法

1.1供試材料、儀器與試劑

1.1.1供試材料。

家蠶品種和白玉N由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所保存，白玉N為抗病品種，白玉為其非抗性非抗性品種，抗性品種的遺傳背景與非抗性品種的相似度為999%；BmNPV由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所病理組提供，濃度為1.0×109多角體/mL。

1.1.2儀器。

e2695 高效液相色譜儀，為美國 Waters公司產(chǎn)品；TSK-GEL G3000SWxL 色譜柱，為日本 TOSOH 公司產(chǎn)品；YarraTM SEC-2000色譜柱，為美國菲羅門公司產(chǎn)品；ICP-MS X Series 2型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；MilliQ超純水儀，為法國Millipore公司產(chǎn)品；MS303S分析天平，為瑞士Mettler Toledo 儀器有限公司產(chǎn)品；Allegra X-22R 多功能高速離心機，為美國Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；EL20 PH計，為瑞士Mettler Toledo儀器有限公司產(chǎn)品；Waters Fraction Collector，為美國Waters公司產(chǎn)品。

1.1.3試劑。

Tris、醋酸、鹽酸、醋酸銨，均為分析純；甲醇為色譜純；葡聚糖G100購自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1樣品制備及前處理。

將飼養(yǎng)至5齡的抗性和非抗性家蠶分別分成2組：1組在5齡第1天接種BmNPV病毒（10 μL/頭）（將病毒涂抹在葉子上，稍微晾干，喂食家蠶）；另1組為對照組。供試家蠶被分為4組：抗性對照組、抗性染毒組、非抗性品種對照組、非抗性染毒組。添食病毒后4組家蠶喂食無病毒桑葉飼養(yǎng)至5齡第5天，剪破第二腹足取每組家蠶血液，于4 ℃下10 000 r/min離心20 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。使用前解凍，并用0.22 μm濾膜過濾。

1.2.2SEC-ICP-MS法檢測家蠶血液中Cu金屬化合物的差異。

1.2.2.1體積排阻-高效液相色譜條件的選擇。

為了使家蠶血淋巴中Cu金屬化合物得到更好的分離效果，選取3種流動相、2種色譜柱和4種流速進行比較，篩選出良好的色譜分離條件。3種流動相分別為A（30 mmol/L 醋酸銨緩沖液，pH 7.4）、B（30 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.4）、C（30 mmol/L Tris-醋酸緩沖液，pH 7.4）。2種不同填料的色譜柱：TSK-GEL G3000SWx（300 mm×7.8 mm，5 μm）和YarraTM SEC-2000（300 mm×7.8 mm，3 μm）。流速分別為04、05、0.6、0.7和0.8 mL/min。使用紫外檢測器，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，進樣量50 μL。

1.2.2.2SEC-ICP-MS分離檢測家蠶血液中的Cu金屬化合物。

配制10 mg/L Li、Co、In、U多元素混合質(zhì)譜調(diào)諧液調(diào)節(jié)ICP-MS的靈敏度，用PEEK管將HPLC與ICP-MS的霧化器連接起來，組成SEC-ICP-MS聯(lián)用系統(tǒng)。4組家蠶血液過0.22 μm濾膜，注入SEC-ICP-MS聯(lián)用系統(tǒng)，將ICP-MS作為檢測器，在線監(jiān)測家蠶血液中Cu金屬化合物。HPLC的流動相為30 mmol/L Tris-醋酸緩沖液（pH 7.4），YarraTM SEC-2000色譜柱，流速0.7 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量50 μL。ICP-MS的工作條件如表1所示。

1.2.3特定餾分的Cu金屬化合物的收集方法的選擇。

1.2.3.1SEC- HPLC結(jié)合餾分收集器手動收集7.6 min組

分。

以30 mmol/L Tris-醋酸緩沖液（pH 7.4）為流動相，用YarraTM SEC-2000色譜柱與餾分收集器，以0.7 mL/min流速，在waters高效液相色譜儀上對家蠶血液進行SEC分離，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，進樣量50 μL。餾分收集器手動收集7.6 min譜峰餾分，收集的餾分再次以相同的SEC條件進行色譜分離。

1.2.3.2葡聚糖G100凝膠柱分離收集目標Cu金屬化合物餾分。

稱取5 g葡聚糖G100用200 mL純水浸泡24 h，倒去上層水，制成凝膠備用。用凝膠等體積的1.0 mol/L的NaOH溶液浸泡凝膠3 h，加水后輕輕攪拌，靜置5 min后倒掉上層水及未沉淀的細顆粒，如此反復3～5次，然后將凝膠沿著攪拌棒逐次緩慢的加入柱中。組裝完成后，將血液樣品緩慢加入到層析柱中，同時利用泵以固定流速加入洗脫液（30 mmol/L的Tris-鹽酸，流速1.0 mL/min），每分鐘收取1次分離液。收取的分離液以30 mmol/L Tris-醋酸緩沖液（pH 7.4）為流動相，用YarraTM SEC-2000色譜柱，以0.7 mL/min流速，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，進樣量50 μL，在waters高效液相色譜儀上對家蠶血液進行SEC分離，檢測收集的組分的出峰時間和峰高。

45卷20期李 龍等抗性家蠶血液中與BmNPV抗性相關銅化合物的分離方法研究

2結(jié)果與分析

2.1體積排阻-高效液相色譜條件的選擇

目前，家蠶血液蛋白質(zhì)組學已取得很大的研究進展，但由于蛋白分離技術的限制，仍有很大的研究探索空間。目前蛋白質(zhì)分離的傳統(tǒng)主流技術是雙向凝膠電泳技術，但是其具有重復性差、靈敏度低等缺點，而逐步發(fā)展的液相色譜等新型分離技術有補充和取代雙向凝膠電泳的趨勢。體積排阻色譜（SEC）分離蛋白質(zhì)回收率高，不會造成蛋白的損失，是最常用的初步篩選未知樣品中化合物的方法[28]。影響體積排阻色譜法分離效果的因素有很多，包括色譜柱填料、流動相、pH、流速等。金屬與生物大分子生成的絡合物和金屬離子之間的平衡與溶液的 pH 密切有關，在分析體液時，常用相當于生理狀態(tài)的緩沖液（pH 7.4）[29]，因此，該試驗選用分離家蠶血液的體積排阻色譜流動相的pH為7.4。同時，考察了不同的色譜柱、流動相以及流速對分離效果的影響。SEC所用的流動相一般為水相，以防止金屬蛋白被破壞或蛋白變性。最常用的分離體液的緩沖液是10～50 mmol/L Tris-HCl和Tris-醋酸，也有少數(shù)文獻使用Tris-醋酸銨。因此，比較了這3種緩沖液（30 mmol/L，pH 7.4）的對抗性對照組家蠶血淋巴的分離效果。從圖1可以看出，3種流動相均可以對照組家蠶血淋巴成分進行分離，但通過比較三者的峰型、峰的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，流動相30 mmol/L Tris-醋酸緩沖液、pH 7.4對家蠶血淋巴蛋白組分的分離效果較好（圖1c），因此選取 30 mmol/L Tris-醋酸緩沖液、pH 7.4作為家蠶血淋巴金屬化合物分離的流動相。

緩沖液的洗脫流速也是影響分離效果的重要因素。考察了流速分別為0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mL/min時對抗性對照組家蠶血液分離的影響。結(jié)果表明，當流速為0.7 mL/min時樣品在色譜柱中的擴散效應影響較小，并且分離度較高（圖1c），因此選擇流速為0.7 mL/min。

理想的排阻色譜樣品與固定相之間應該沒有相互作用力，固定相表面應為親水性的羥基，但是由于填料合成時實驗條件的限制，固定相表面不可避免的存在一些羧基、氨基等帶電基團，因此溶質(zhì)與固定相表面會有一些靜電作用力[30]。因此，考察了TSK-GEL G3000SWx（300 mm×7.8 mm，5 μm）和YarraTM SEC-2000（300 mm×7.8 mm 3 μm）2種不同型號的體積排阻色譜柱對抗性對照組家蠶血液化合物分離的影響，結(jié)果如圖2所示。比較二者的峰形、峰的數(shù)量可以看出，YarraTM SEC-2000色譜柱的分離效果較好。因此，最終選擇的分離條件如下：YarraTM SEC-2000分離柱，流動相 30 mmol/L Tris-醋酸緩沖液（pH 7.4），流速0.7 mL/min。

2.24組家蠶血液中的Cu金屬化合物的差異比較

ICP-MS具有高靈敏度以及可多元素同時分析等特點，已成為金屬蛋白中金屬元素分析必不可少的方法[31]。ICP-MS 可直接用于經(jīng)液相色譜分離后的金屬蛋白中金屬元素種類及含量的檢測，且因其具有分析同位素比值的能力，結(jié)合同位素稀釋法可以對色譜分離所得到的未知金屬元素進行準確定量[32-33]。采用SEC-ICP-MS方法測定了家蠶血液中Cu金屬化合物，分離結(jié)果如圖3所示。體積排阻色譜是根據(jù)分子量大小分離樣品的，大分子物質(zhì)在柱內(nèi)的保留時間短，所以先出峰，分子量小的蛋白在柱內(nèi)的保留時間長而后出峰。結(jié)合抗性對照組家蠶血淋巴蛋白在SEC中的出峰時間（圖2b），比較Cu金屬與抗性對照組家蠶血液中化合物的結(jié)合情況（圖3a）可知，Cu元素在家蠶血液的多數(shù)出峰時間內(nèi)都可以被檢測到，說明Cu結(jié)合的化合物分子量范圍較廣，與大分子和小分子化合物均有結(jié)合。對比添食病毒前后抗性和非抗性家蠶血淋巴Cu元素的金屬譜峰（圖3）可知，4組家蠶血淋巴 Cu 結(jié)合化合物有明顯差異?？剐哉＝M（圖3a）有3處明顯峰：7.6、11.0、和18.0 min，12.0～14.0 min檢測到2個信號強度很弱的譜峰。非抗性正常組（圖3b）有2處明顯峰：110和18.0 min，12.5和13.5 min譜峰不明顯?？剐约倚Q組的18.0 min峰的Cu金屬信號強度明顯強于非抗性家

蠶?？剐约倚Q在被喂食BmNPV 5 d后，7.6 min峰消失，

11.0 min峰的金屬信號強度和峰面積都明顯降低，峰的形狀

也不明顯（圖3c）；非抗性家蠶感染BmNPV 5 d后，0～16.0 min幾乎檢測不到峰，只出現(xiàn)一個18.0 min峰（圖3d）。因此，抗性和非抗性家蠶血液中Cu化合物主要的差異在7.6 min峰。

2.3葡聚糖G100凝膠柱分離收集特定Cu金屬化合物餾分

4組家蠶血淋巴的Cu金屬化合物的SEC-ICP-MS分離結(jié)果表明，正常的抗性和非抗性家蠶血液中Cu化合物主要的差異在7.6 min峰，而抗性家蠶喂食BmNPV后也幾乎檢測不到7.6 min峰，據(jù)此推測這種差異可能與家蠶對BmNPV的抗性有關。為了后續(xù)的檢測鑒定，需要分離并收集7.6 min餾分，借助質(zhì)譜手段對其做定性分析。常用的方法是利用餾分收集器，根據(jù)液相色譜儀的檢測信號手動收集樣品餾出液，多次收集，合并餾分，減壓濃縮后借助質(zhì)譜手段定性分析。這個方法要求準確計算樣品流出液從色譜柱到餾分收集器的時間。從家蠶血液的SEC-HPLC色譜分離圖可以看出，分離的7.6 min峰的出峰時間只有1 min，因此色譜柱到餾分收集器的時間計算準確度對結(jié)果的影響較大。此外，與葡聚糖凝膠柱分離相比，HPLC的進樣量較少，直接利用HPLC收集得到的餾分樣品濃度太低（圖4a）。

分離效果圖。圖4a是直接利用餾分收集器從HPLC手動收集的家蠶血液餾分分離圖，圖4b是葡聚糖凝膠柱分離家蠶血液并手動收集7.6 min分離液的SEC-HPLC分離效果圖。4a圖中峰高和峰面積明顯小于圖4b。因此，直接利用餾分收集器從HPLC手動收集的家蠶血液餾分需要多次收集合并，并對餾分進行濃縮才可以進行質(zhì)譜鑒定。這種方法工作量繁瑣，同時濃縮的過程中可能會破壞Cu結(jié)合金屬化合物。因此，用葡聚糖G100凝膠柱結(jié)合HPLC的方法分離并收集目標Cu金屬化合物餾分，分離所得的分離液經(jīng)HPLC法進行純度檢測，檢測結(jié)果如圖5所示。4組家蠶血液的分離液在0～30 min時間內(nèi)只出現(xiàn)一個7.6 min譜峰，說明收集的

家蠶血液分離液成分相對簡單，至少分子量相似。4組家蠶血液分離液的7.6 min譜峰中抗性正常組最高，非抗性染毒組最低，這種差異趨勢與SEC-ICP-MS分離結(jié)果相一致。

3結(jié)論

筆者篩選出相對優(yōu)化的體積排阻色譜分離條件，建立了SEC-ICP-MS聯(lián)用技術來分離與檢測家蠶血液中的Cu金屬化合物。結(jié)果表明，BmNPV抗性和非抗性家蠶血液中Cu化合物主要的差異是位于7.6 min的組分。同時，利用葡聚糖G100凝膠柱重點對7.6 min組分進行了分離并收集分離液。此方法比傳統(tǒng)的HPLC-餾分收集器收集的餾分濃度高，可省去再次對餾分進行合并和濃縮等步驟，是家蠶金屬化合物分離較為簡便和有效方法。

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