頂空—?dú)庀嗌V法測(cè)定動(dòng)物源制品中三甲胺含量的測(cè)量不確定度評(píng)定

應(yīng)月 劉超曄 孫杰

摘要[目的]分析頂空-氣相色譜法（HS-GC）測(cè)定動(dòng)物源制品中三甲胺含量的測(cè)量不確定度來(lái)源并定量。 [方法]建立（HS-GC）測(cè)定動(dòng)物源制品中三甲胺含量的測(cè)量不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型，從測(cè)定程序各步驟評(píng)定不確定度的各項(xiàng)來(lái)源，對(duì)該方法所得結(jié)果的已識(shí)別來(lái)源的不確定度影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]該方法測(cè)定動(dòng)物源制品中三甲胺含量的不確定度主要來(lái)源于三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品處理過(guò)程。當(dāng)動(dòng)物源制品中三甲胺含量為9.20 mg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.56 mg/kg（K=2，P=95%）。[結(jié)論]該評(píng)定方法在實(shí)際工作中對(duì)提高三甲胺檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性與準(zhǔn)確性具有一定指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞動(dòng)物源制品； 三甲胺；頂空氣相色譜法；不確定度

中圖分類號(hào)S851.34+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）20-0089-02

Abstract[Objective] A mathematical model was established to assess the uncertainty in determination of trimethylamine in animal derived food by headspace gas chromatography.[Method] Various sources of uncertainty for measurement results during the analysis have been evaluated and the identified key factors were assessed.In this paper，the impacts of major source of measurement uncertainty were methanol standard solution and sample preparation.[Result]The uncertainty of trimethylamine in animal derived food determined by HSGC originated mainly from trimethylamine standard liquid and sample treatment.When the trimethylamine content in animal derived food was 9.20 mg/kg，the expanded uncertainty of measurement results was 0.56 mg/kg（K=2，P=95%）.[Conclusion] This uncertainty evaluation method shows certain guiding significance to improve the reliability and the accuracy of trimethylamine detection in practical work.

Key wordsAnimal derived food；Trimethylamine；Headspace gas chromatography；Uncertainty

人類食用的魚、蝦、豬等肉產(chǎn)品隨著新鮮程度下降，在微生物和酶的作用下不斷降解生成三甲胺[1-2]。從食物中獲取的三甲胺可在肝臟中轉(zhuǎn)化成氧化三甲胺，有研究證明，人體內(nèi)過(guò)量氧化三甲胺可促使人體動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致心血管病發(fā)病[3-4]。因此，檢測(cè)動(dòng)物源制品中三甲胺含量對(duì)判斷其新鮮程度、提高其食用安全、保障消費(fèi)者身體健康意義重大[4-6]。

在檢驗(yàn)分析工作中，不確定度是測(cè)定結(jié)果質(zhì)量的衡量尺度。此前我國(guó)三甲胺檢測(cè)采用GB/T 5009.179—2003 《火腿中三甲胺氮的測(cè)定》，該標(biāo)準(zhǔn)采用分光光度法測(cè)定與苦味酸作用形成的苦味酸三甲胺鹽，但是苦味酸可與樣品中其他胺類物質(zhì)反應(yīng)，故而使測(cè)定結(jié)果偏高，此標(biāo)準(zhǔn)已于2017年3月1日廢止[7]。筆者結(jié)合GB 5009.179—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三甲胺的測(cè)定》（第二法頂空-氣相色譜法）[8]中的檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)操作，按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[9]建立三甲胺的頂空-氣相色譜法（HS-GC）檢測(cè)結(jié)果數(shù)學(xué)模型，分析檢測(cè)過(guò)程中的不確定度來(lái)源并定量。該不確定度評(píng)定結(jié)果可為規(guī)范動(dòng)物源制品中三甲胺測(cè)定步驟、提高測(cè)定精密度和準(zhǔn)確性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑7890氣相色譜儀帶7697A頂空，配氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），安捷倫公司；三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Chem service；其他試劑三氯乙酸、氫氧化鈉均為分析純。

1.2三甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液制備三甲胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品0.016 2 g，用5%三氯乙酸溶液溶解并定容至100 mL，等同濃度為100 μg/mL的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存。分別精密移取三甲胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1、2、5、10至100 mL容量瓶，10、20 mL至50 mL容量瓶，用5%三氯乙酸定容，得到濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3方法采用GB 5009.179—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三甲胺的測(cè)定》中“第二法”規(guī)定的方法，稱取約10 g制備好的樣品于50 mL的塑料離心管中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)1 min，以4 000 r/min離心5 min，上清液濾入50 mL容量瓶，殘留物再分別用15和10 mL 5%三氯乙酸溶液重復(fù)上述提取過(guò)程2次，合并濾液并用5%三氯乙酸溶液定容至50 mL。

分別準(zhǔn)確吸取樣品提取液、三甲胺標(biāo)準(zhǔn)工作液各2.0 mL于20 mL頂空瓶中，壓蓋密封，用醫(yī)用塑料注射器準(zhǔn)確注入5.0 mL 50%氫氧化鈉溶液，備用。制備好的試樣在40 ℃平衡40 min，供HS-GC測(cè)定。以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法采用峰面積定量。

1.4HS-GC條件石英毛細(xì)管色譜柱：聚乙二醇（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫箱：40 ℃保持3 min，以20 ℃/min速率升至220 ℃，保持1 min；載氣：氮?dú)猓兌?9.999%），流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度220 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL；分流進(jìn)樣，分流比2∶1。

1.5數(shù)學(xué)模型建立試樣中三甲胺含量的測(cè)定模型如下：

X=c×Vm

式中，X為試樣中三甲胺含量 （mg/kg）；c為從校準(zhǔn)曲線得到的三甲胺濃度 （mg/mL）；V為試樣溶液定容體積 （mL）；m為試樣質(zhì)量（g）。

三甲胺含量X的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度用urel（x）表示，試樣溶液定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度用urel（V）表示，試樣質(zhì)量m的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度用urel（m）表示，總重復(fù)性帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度用urel（）表示。其中c引起的相對(duì)不確定度urel（c）主要由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u曲rel和標(biāo)準(zhǔn)品溶液帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c0）引起。

由此得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度傳播率為：

urel（x）=urel（c）2+urel（V）2+urel（m）2+urel（）2

2不確定度評(píng)定

2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，三甲胺鹽酸鹽的不確定度為0.5%，按正態(tài)分布k=3，其相對(duì)不確定度為up1rel =0.5%3 =1.67×10-3。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程引入的不確定度。

2.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品稱量引起的不確定度。用精度為0.01 mg天平準(zhǔn)確稱取三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品0.016 2 g，服從均勻分布k=3。忽略稱量重復(fù)性引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為up2rel=0.0116.2×3=3.56×10-4。

2.1.2.2玻璃儀器校準(zhǔn)引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程需要使用一系列玻璃量器，按均勻分布屬A類，取k=3[10]，結(jié)果見表1。

按照標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程，由表1數(shù)據(jù)合成的相對(duì)不確定度為

up3rel=

u27+

u21+u26+u21+u25+u21+u24+u21+u24+u22+u23+u22=5.71×10-3。

2.1.2.3溫度引起的不確定度。試驗(yàn)所用玻璃量器在20 ℃校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)溫度約為25 ℃。20 ℃時(shí)水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，玻璃的膨脹系數(shù)為1.5×10-5/℃，在置信概率下的正態(tài)分布取k=2，則uTrel=（σ水-σ玻）×（Tt-T20）×12=4.88×10-4。得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（c0）=u2p1rel+

u2p2rel+u2p3rel+u2Trel=1.67×10-2。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。按照“1.2”配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度及相應(yīng)的峰面積見表2。采用最小二乘法擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=131.357 7x-53.136 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。同一樣品，重復(fù)測(cè)定6次，得到三甲胺平均含量為1.84 μg/mL。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計(jì)算[11]：urel曲=sa1p+1n+（c-）2sXX=1.88×10-2。式中，s為殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差，s=nj=1[Aj-（b+a×cj）]n-2=3.16；p為樣品測(cè)定次數(shù)，p=6；n為校準(zhǔn)的次數(shù)，n=3；c為樣品通過(guò)曲線求得的濃度（μg/mL）；為標(biāo)準(zhǔn)曲線6個(gè)濃度的平均值（μg/mL）；sxx為離均差平方和，sxx=nj=1（cj-）2=1 116。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線查得三甲胺濃度的不確定度為urel（c）=u2rel曲+u2rel（c0）=2.52×10-2。

2.2樣品引入的不確定度

2.2.1樣品取樣的不確定度。該試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中將樣品經(jīng)充分混勻后稱量，認(rèn)為樣品具有較好的均勻性，代表性充分，忽略取樣所致的不確定度[12]。

2.2.2樣品稱量引入的不確定度。用精度為0.01 mg的天平準(zhǔn)確稱取10 g樣品，按均勻分布計(jì)算，k=3。天平讀數(shù)穩(wěn)定，忽略稱量重復(fù)性引入的不確定度。樣品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（m）=0.0110×1 000×3=5.77×10-7。

2.2.3樣品定容體積引入的不確定度。試驗(yàn)用50 mL容量瓶，按均勻分布評(píng)定，uv1rel=0.0550×3=5.77×10-4。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)溫度為25 ℃。在置信概率下的正態(tài)分布取k=2，則uTrel=4.88×10-4。urel（v）=u2v1rel+u2Trel =7.55×10-4。

2.2.4樣品處理步驟引入的不確定度。樣品制備過(guò)程引入的不確定度，以2.0 μg/ml為三甲胺質(zhì)量濃度，進(jìn)行6次空白

樣品添加回收率試驗(yàn)，回收率結(jié)果分別為86.17%、92.35%、88.22%、84.53%、90.97%、93.26%，平均回收率f回為89.25%，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=3.50，urel（）=3n×1回=1.60×10-2，式中n=6。

2.3計(jì)算合成不確定度該試驗(yàn)得出HS-GC測(cè)定肉制品中三甲胺含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（x）=

u2rel（c）+u2rel（v）+u2rel（m）+u2rel（）=3.02×10-2。

2.4擴(kuò)展不確定度及結(jié)果

取擴(kuò)展因子K=2，在95%置信水平下，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel（x）=Kurel（x）= 6.04×10-2。試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，樣品三甲胺含量為9.20 mg/kg，則其擴(kuò)展不確定度為U=0.56 mg/kg，三甲胺的測(cè)定結(jié)果為（9.20±0.56）mg/kg。

3討論

通過(guò)對(duì)不確定度的計(jì)算評(píng)定，了解試驗(yàn)過(guò)程中不確定度的來(lái)源，并進(jìn)行分析和量化，從而判斷出可對(duì)哪些不確定度分量采取措施，以降低總不確定度。該試驗(yàn)中，HS-GC測(cè)定肉產(chǎn)品中三甲胺含量，測(cè)定結(jié)果為（9.20±0.56）mg/kg（K=2，P=95%）。通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)三甲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度和樣品處理步驟引入的不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)較大，樣品稱量與定容對(duì)三甲胺測(cè)定結(jié)果影響較小。在今后實(shí)際檢測(cè)工作中，應(yīng)盡可能規(guī)范試驗(yàn)操作，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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