絲瓜絡填料反硝化濾池中微生物群落結(jié)構(gòu)研究

張瀏　欒曉男　杜玉來

摘要[目的]檢測絲瓜絡反硝化濾池內(nèi)主要微生物菌群，優(yōu)化濾池運行參數(shù)。[方法]綜合使用PCR-DGGE、高通量測序等微生物分析手段，研究了該濾池內(nèi)生物群落結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]填料表面微生物多樣性豐富，優(yōu)勢菌屬為紅假單胞菌屬、綠棒菌屬、紅芽生菌屬、芽生綠菌屬、氣單胞菌屬。[結(jié)論]該研究結(jié)果對于提高反硝化濾池處理污染物的效率具有指導意義。

關(guān)鍵詞絲瓜絡填料；微生物分析；反硝化生物濾池

中圖分類號X52文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）20-0060-05

Abstract[Objective] To test the main microbial flora in the loofah denitrification biofilter and optimize the operation parameters.[Method] The community structure of the filter was studied by means of PCRDGGE，high throughput sequencing and other microbiological analysis methods.[Result] The microbial diversity on the surface of the stuffing is abundant.The dominant species were Rhodopseudomonas，Chlorobaculum，Rhodoblastus，Blastochloris，Eromonas. [Conclusion]The research results have guiding significance for improving the efficiency of denitrifying filter treatment pollutants.

Key wordsLoofah filler；Microbiological analysis；Denitrification filter

目前，我國污水處理廠普遍采用的污水處理工藝有A/O、氧化溝和SBR 等，由于受原污水 COD/N 較低的限制，加之長期以來我國污水處理廠污染物排放標準中僅規(guī)定了氨氮（NH4+-N）和總氮（TN）的最高允許排放濃度，且 TN 最高允許排放濃度比NH4+-N至少高 10 mg/L，這些因素導致污水處理廠出水中 TN 至少有 60%為硝酸鹽氮，部分污水處理廠出水硝酸鹽最高可達20 mg/L[1]，并已造成地表及地下水體不同程度的硝酸鹽污染[2-3]。水體中過高的硝酸鹽濃度直接影響供水水質(zhì)安全，對嬰幼兒具有毒害作用，在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)[4]；另一方面，可導致溫室性氣體N2O的產(chǎn)生[5-6]。因此，降低硝酸鹽濃度已經(jīng)成為水處理研究中的重要課題[7-13]。

常規(guī)去除硝酸鹽的辦法有離子交換、反滲透和生物法[14]，但離子交換和反滲透由于價格昂貴，處理費用較高，去除效果有限，而難以達到推廣應用[15-19]。而生物法中反硝化生物濾池是解決該類問題經(jīng)濟有效的方法之一。其中反硝化是將硝酸鹽或者亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)氮的生物過程[20-21]，而反硝化生物濾池中起關(guān)鍵作用的就是生長在載體填料上的微生物。筆者研究了以絲瓜絡為填料的生物濾池，分析其微生物特征，以期找到更優(yōu)異的填料，旨在為以絲瓜絡為填料的生物濾池處理生活污水提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗裝置

試驗采用的反應器由有機玻璃圓柱制成，高420 cm，內(nèi)徑12 cm，有效體積47 L（圖1）。球形絲瓜絡填料直徑為8 cm，每個球形填料中絲瓜絡重量為5 g左右。采用間歇運行的方式，進水時間為6 min，流量為0.47 m3/h。

1.2試驗材料

試驗采用運行穩(wěn)定、且控制在最優(yōu)脫氮條件下的絲瓜絡填料為研究對象，對其進行微生物分析。

1.3分析方法

1.3.1Miseq高通量測序生物信息學分析。

首先提取樣品基因組DNA，設計并合成引物接頭，再進行PCR擴增及產(chǎn)物純化，待純化完成后，進行PCR產(chǎn)物定量和均一化，最后進行高通量測序。測序完成后對序列進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及生物信息學分析。

1.3.2PCR-DGGE技術(shù)原理及環(huán)境微生物群落多樣性分析。

DGGE是通過聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同，將序列不同的DNA分開。根據(jù)變性劑梯度方向的不同，DGGE可分為：垂直DGGE，即變性劑梯度與電場方向垂直，常用于試驗決定分離型、野生型和變異型的最佳變性劑梯度范圍；平行DGGE，其變性劑的梯度和電場方向平行，主要用于解鏈范圍明確的DNA片段檢測。該試驗流程如圖2所示。

2結(jié)果與分析

2.1PCR-DGGE測序結(jié)果

2.1.1DGGE凝膠電泳圖。試驗共取3個樣品進行測定，每個樣品取2組平行（樣品1平行樣記為1-1和1-2，樣品2平行樣記為2-1和2-2，樣品3平行樣記為3-1和3-2）。采用Biolinker DNA Red染液對DGGE膠圖進行泡染，染色完成后的膠圖在Bio-Rad凝膠成像儀上進行拍照，結(jié)果見圖3。

通過Quantity-One軟件分析原DGGE膠圖，將膠圖轉(zhuǎn)換成直觀的條帶分布圖（圖4），位于同一水平線的為相同物種，該圖左右兩側(cè)的數(shù)字為經(jīng)分析后該板膠共有的條帶數(shù)（也可認為是該板膠上所有樣本包含的物種數(shù)）。最下面一行表示以第1個樣本為基準的前提下，其余樣本與第1個樣本的相似性。

圖4下方的百分數(shù)中1對應的100%表示以樣品1-1為基準，在該條件下，其余樣本與該樣本的相似性?？梢钥闯觯?-1與1-2、2-1與1-2、3-1與3-2非常相似，說明取樣情況較好，能夠反映各樣品的真實情況。同時可知，樣品1與樣品2的相似性在85%左右，與樣品3的相似性僅在70%，說明樣品1和樣品2群落結(jié)構(gòu)更相似。

2.1.2生物群落多樣性指數(shù)。

由表1可知，樣品1的群落多樣性最高，樣品2最小。

2.1.3非加權(quán)組平均法（UPGMA）進行樣品間的聚類分析。UPGMA

是一種較常用的聚類分析方法。通過Quantity One軟件的UPGMA法所產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)生樹可以直觀地看到各樣品之間的相似性。由圖5可知，對于3個樣品所取的平行組，相似系數(shù)均在95%以上，說明這3個樣品取樣均一，能夠代表樣品的真實情況，并且從圖5中也可以看出樣品1和樣品2的相似性更高。

2.1.4克隆測序匯總。PCR-DGGE的膠條切下共16條（編號1～6）進行回收，擴增區(qū)域：16S，克隆測序結(jié)果見表2。由表2可知，菌種Chlorobium limicola strain DSM 245，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677，Magnetospirillum bellicus strain VDY，Rhodoblastus acidophilus strain DSM 137，Clostridium saccharobutylicum strain NCP 262的相似性均為100%，說明這些菌種是3個樣品共有的菌種，而其中Chlorobaculum limnaeum strain DSM 1677菌屬相似度為100%，條帶占比100%，說明該菌種是3個樣品的優(yōu)勢菌種。Chondromyces Robustus strain Cm a13，Chloroba culum parvum NCIB 8327，Rhodopseudomonas palustris TIE-1 strain TIE-1，Thiomonas perometabolis strain ATCC 23370、Dyella thiooxydans strain ATSB10菌種的數(shù)目也較多，且在3個樣品中也基本都有。

2.2高通量測序結(jié)果

通過PCR-DGGE分析結(jié)果可知，6個樣品均具有較好的代表性。同時也為了節(jié)約測序成本，采用編號1-1樣品代表樣品1，編號2-1代表樣品2，3-1代表樣品3來開展高通量測序工作。

2.2.1指數(shù)分析結(jié)果統(tǒng)計。由在指定的相似水平為97%（0.03）的條件下，樣品的各多樣性指數(shù)見表3。由表3可知，樣品2-1的OTU序列數(shù)最高，1-3最低，而3個樣品中1-1的優(yōu)化序列劃分得到的OTU數(shù)目最多，為1 566。由此可知，1-1和3-1樣品的物種總數(shù)較多，樣品3-1的香農(nóng)指數(shù)最高，為3.48。各樣品文庫的覆蓋率均在98%以上，樣本中序列沒有被測出的概率較低，覆蓋較深，可見該次測序結(jié)果能夠充分代表樣本的真實情況。

2.2.2稀釋性曲線。圖6是在97%相似水平下劃分OUT并繪制出的各樣品稀釋曲線。知以看出，3個樣品的曲線趨向平坦，說明這3個樣品的取樣數(shù)量合理，取樣深度足夠，能夠代表樣品的真實情況。

2.2.3各樣本間在門分類水平的比較。

在門分類水平上，根據(jù)各樣品中微生物組成繪制柱狀圖，比較各樣本在門分類水平上群落結(jié)構(gòu)組成的差異，結(jié)果見圖7。由圖7可知，1-1、1-2樣品在門水平上群落結(jié)構(gòu)比較相似，與1-3樣品中群落結(jié)構(gòu)略有差距，這與DGGE測序得出的結(jié)果一致。主要體現(xiàn)在1-1、1-2樣品群落結(jié)構(gòu)中，綠菌門（Chlorobi）數(shù)目占的比例最大，變形菌門（Proteobacteria）次之，而1-3樣品中變形菌門最多，其次是綠菌門。在擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）等菌門上，差距不明顯。

2.2.4熱圖（Heatmap）。

Heatmap 可以用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。常根據(jù)需要將數(shù)據(jù)進行聚類，將聚類后的數(shù)據(jù)表示在heatmap圖上，通過顏色的梯度及相似程度來反映數(shù)據(jù)的相似性和差異性。

圖8是根據(jù)屬水平上OTU中所含序列的數(shù)量位于前50的信息進行繪制，分別按照樣品和分類進行聚類后做出Heatmap圖，能夠反映出樣品在屬水平上表現(xiàn)的相似性或者差異性。

由圖8可知，3個樣品的菌落結(jié)構(gòu)在菌屬水平上非常相似，紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、綠棒菌屬（Chlorobaculum）、紅芽生菌屬（Rhodoblastus）、芽生綠菌屬（Blastochloris）、氣單胞菌屬（Aeromonas）是這3個樣品共同的優(yōu)勢菌屬，其中綠棒菌屬在所有的菌屬中豐度最大，而此菌屬一般為光能無機自養(yǎng)型，專性厭氧，在無氧、有光照的水體中生長。說明試驗裝置中溶解氧濃度非常低，厭氧環(huán)境好。同時反應裝置由有機玻璃制成，透明，光照條件好，有利于這些菌屬的生長。

3結(jié)論

（1）該研究結(jié)果表明，DGGE測序與高通量測序結(jié)論基本一致。而DGGE測序只能檢測到主要的微生物，如果總量占1%以下，便不能被檢測到，高通量測序樣品檢測到26門35綱55目85科153屬，說明DGGE顯著低估了微生物的群落組成。通過對比這兩種測序方法可知，高通量測序的檢測靈敏度是DGGE的4～39倍，若進一步分析樣品主要微生物類群的相對豐度，發(fā)現(xiàn)分類水平越低，高通量測序與DGGE的結(jié)果差異越大，尤其在科和屬的水平上差異最大[22]。并且高通量測序能夠較為全面和準確的反映微生物群落結(jié)構(gòu)，而DGGE僅能夠反映有限的優(yōu)勢微生物類群，在很大程度上極可能低估微生物的物種組成并高估其豐度。

（2）以絲瓜絡作為反硝化濾池的填料，通過高通量測序以及基于PCR-DGGE技術(shù)的環(huán)境微生物群落多樣性分析，初步得出：優(yōu)勢菌屬為紅假單胞菌屬、綠棒菌屬、紅芽生菌屬、芽生綠菌屬、氣單胞菌屬。

絲瓜絡作為反硝化濾池填料時，微生物生長狀況良好，表面微生物比較豐富，初步認為絲瓜絡可以作為反硝化生物濾池的填料。

參考文獻

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