茉莉酸甲酯對(duì)藜感染黃瓜花葉病毒后的生理影響

夏明星 于曉云 陳偉

摘要 [目的]探究茉莉酸甲酯（MeJA）對(duì)黃瓜花葉病毒介導(dǎo)藜的抗病生理反應(yīng)的影響。[方法]采用MeJA及其抑制劑沒食子酸丙酯（PG）預(yù)處理藜葉片后，分別接種黃瓜花葉病毒（CMV），并于接種0、1、3、5、7、9 d后測(cè)定其葉中H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性等生理指標(biāo)的變化。[結(jié)果]與對(duì)照相比，MeJA處理的接種藜葉POD活性前期降低，中后期逐漸升高，CAT、SOD活力與POD相反。接種CMV后，MeJA能提高相關(guān)抗氧化物酶的活性，其抑制劑PG處理后對(duì)MeJA所調(diào)控的氧化酶活性具有一定的抑制作用。[結(jié)論]MeJA對(duì)藜抗CMV有一定的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 茉莉酸甲酯；沒食子酸丙酯；藜；CMV病毒

中圖分類號(hào) S432.2+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0154-04

Abstract [Objective]The aim was to find out the effect of Methyl jasmonate （MeJA） on Cucumber mosaic virus （CMV）mediated physiological responses in Chenopodium album.[Method]The leaves of Chenopodium album were pretreated with either MeJA or its inhibitor gallic acid propyl gallate （PG）， and then were infected by CMV for 0， 1， 3， 5， 7 and 9 d. After collecting the leaves samples， the contents of H2O2 content and activities of the antioxidant enzymes including CAT， SOD and POD activity were determined.[Result]Compared to controls， POD activity was suppressed by MeJA pretreatment at the beginning， and went up gradually afterwards，while CAT and SOD activity in contrast to the POD. Furthermore， after inoculation with CMV， activities of the antioxidant enzymes pretreated with MeJA were significantly enhanced， whereas they were suppressed as pretreated with the inhibitor PG. [Conclusion]MeJA plays positive role in physiological resistance of Chenopodium album against CMV.

Key words Methyl jasmonate；Propyl gallate；Chenopodium album；Cucumber mosaic virus

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，簡(jiǎn)稱CMV）是世界上流行的植物病毒之一，其侵染寄主廣泛，因而也是目前研究較多的具經(jīng)濟(jì)重要性的植物病毒之一，其發(fā)生程度與蚜蟲繁殖情況密切相關(guān)。目前生產(chǎn)上大多通過防治蚜蟲來達(dá)到防治CMV的目的，而現(xiàn)有的防蚜蟲方式主要為化學(xué)防治，化學(xué)藥劑在長期的使用過程中其“3R”問題越來越被人重視。為解決上述問題，植物誘導(dǎo)抗病性被提了出來，Kloepper將誘導(dǎo)抗病性定義為“由生物或非生物因子激活的、依賴于寄主植物的物理或化學(xué)屏障的活化抗性過程”[1-2]。研究表明，茉莉酸（JA）及其衍生物、乙烯（ETH）、水楊酸（SA）等能有效誘發(fā)植物系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）[3]。茉莉酸甲酯（MeJA）是高等植物體內(nèi)的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)植物生長發(fā)育具有極為重要的生理作用[4]。MeJA易揮發(fā)，可從植物的氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)，于細(xì)胞質(zhì)中被酯酶水解為茉莉酸，實(shí)現(xiàn)長距離信號(hào)傳導(dǎo)和植物間的交流，致使鄰近植物產(chǎn)生誘導(dǎo)防御反應(yīng)[5]。目前已有大量研究表明，外源施用MeJA可誘導(dǎo)植物防衛(wèi)基因的表達(dá)、相關(guān)防御酶活性增強(qiáng)及多種次生代謝物質(zhì)的合成等，并能增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性[6-7]。沒食子酸丙酯（PG）是一種來源于綠色植物的天然多酚類化合物，也是一種極為重要的沒食子酸衍生物[8]。研究表明，亞麻酸通過脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧化物合成酶（AOS）等一系列酶促反應(yīng)生成JA與MeJA[9]，而PG是LOX脂氧合酶的抑制劑，通過抑制LOX活性而有效抑制JA合成途徑[10]。

筆者以植物病毒的指示植物——藜為材料，研究了MeJA及其抑制劑PG對(duì)藜感染黃瓜花葉病毒后生理反應(yīng)的影響，以期探究茉莉酸甲酯與CMV病毒及藜抗病毒機(jī)制間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

藜（Chenopodium album）從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)校園田間移栽獲得，所選材料均為高約30 cm、大小均勻、長勢(shì)一致的植株。黃瓜花葉病毒由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)前處理

以200 μmol/L MeJA與1 mmol/L PG溶液分別噴施整株，以噴施蒸餾水的處理為對(duì)照，之后放于透明密閉的裝置中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，以2種方式處理植株葉片，第1種方式是采用摩擦接種方式接種CMV病毒，每株接種4～7片葉；第2種是僅摩擦葉片但不接種CMV病毒，每株處理4～7片葉作為模擬接種對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)。接種后，每天觀察植株的發(fā)病情況，直至發(fā)病葉片脫落為止，并做詳細(xì)記錄。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

分別于接種后0、1、3、5、7、9 d摘取經(jīng)上述處理葉片測(cè)定以下幾個(gè)指標(biāo)：過氧化氫（H2O2）含量、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性。按Velikova等[11]的方法測(cè)定H2O2含量，參照結(jié)合Beers等[12]和Patra等[13]方法測(cè)定CAT活性，用NBT光還原法測(cè)定SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析，應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性和相關(guān)性分析。對(duì)不同溶劑處理下藜的各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，單因素方差分析后做多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜接種CMV后的表型變化

接種5 d后，經(jīng)MeJA處理的接種葉開始變黃且有芝麻粒大小的枯斑出現(xiàn)，而經(jīng)PG和蒸餾水處理的接種葉7 d后才表現(xiàn)出相同癥狀；經(jīng)MeJA、PG、蒸餾水處理的接種葉片出現(xiàn)花葉的時(shí)間依次為10、8、9 d，葉片經(jīng)PG處理出現(xiàn)花葉的時(shí)間較蒸餾水處理的時(shí)間提前，而MeJA處理后藜葉片出現(xiàn)花葉的時(shí)間比蒸餾水處理延后。

經(jīng)MeJA溶液、PG溶液和蒸餾水處理的植株出現(xiàn)枯斑的時(shí)間存在一定差異，其原因可能是因?yàn)槭蹸MV侵染后，植物細(xì)胞快速死亡，植株產(chǎn)生了超敏反應(yīng)，MeJA能夠促進(jìn)超敏反應(yīng)，所以出現(xiàn)枯斑的時(shí)間比其他2種處理更快，由于MeJA處理產(chǎn)生的超敏反應(yīng)更早，導(dǎo)致病原菌擴(kuò)展變慢，植株發(fā)病時(shí)間推遲，而PG抑制了JA途徑，導(dǎo)致植株發(fā)病時(shí)間提前。

2.2 MeJA對(duì)藜幾個(gè)生理指標(biāo)的影響

2.2.1 噴施MeJA后藜接種CMV葉中H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)及CAT活性變化。

從圖1可以看出，經(jīng)MeJA處理后模擬接種的葉片和蒸餾水處理的接種葉片CAT活性變化基本一致，總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)；而經(jīng)MeJA處理的葉片CAT活性較其他2組處理提前到1 d達(dá)到最大值，其可能的原因是：外源噴施的MeJA可誘導(dǎo)植株體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞或組織啟動(dòng)防御機(jī)制，因此可以對(duì)病原菌的侵染較蒸餾水、PG處理葉片提前做出應(yīng)答。

從圖2可以看出，經(jīng)MeJA處理后接種的葉片體內(nèi)H2O2呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，并在整個(gè)檢測(cè)過程中出現(xiàn)了2次峰值，而經(jīng)過蒸餾水處理后接種CMV和MeJA處理后模擬接種的2組處理的H2O2變化情況基本一致，只在接種后第9天有差異。

經(jīng)MeJA處理接種的葉片CAT活性在0～1 d升高，1～3 d降低，而H2O2 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～3 d逐漸升高，可能是因?yàn)镸eJA的處理導(dǎo)致了植物體內(nèi)本身積累了一定量的H2O2，雖然CAT活性在接種后1～3 d降低，但其降低速度低于之前升高速度，故植物體內(nèi)H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)在接種后1～3 d在緩慢增加。3種處理的H2O2都是先增加到頂峰，隨后逐漸降低，MeJA處理的接種葉較蒸餾水處理的接種葉和MeJA處理模擬接種葉先達(dá)到峰值，這可能是因?yàn)榻?jīng)MeJA處理后接種CMV的藜葉片內(nèi)CAT活性較其他2個(gè)處理先降低到最低值；而后期在CAT活性基本不變的情況下H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，其可能的原因是MeJA啟動(dòng)的衰老程序中產(chǎn)生了較多的H2O2，這可能與藜較早產(chǎn)生超敏反應(yīng)有關(guān)。

2.2.2 噴施MeJA后藜接種CMV葉中SOD活性的變化情況。經(jīng)研究，SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可對(duì)抗與阻斷超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。由圖3可知，前期SOD活性增加速度由高到低依次為MeJA處理組、MeJA模擬接種處理組、蒸餾水處理組，這可能是因?yàn)镸eJA能夠快速誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生抗性，以增加SOD活性來修復(fù)因病毒侵染而對(duì)細(xì)胞造成的損害。因?yàn)镾OD強(qiáng)大的修復(fù)功能，植株細(xì)胞因侵染和摩擦的損害都在不斷的愈合[14]，所以在中期其活性變化不會(huì)太大。MeJA模擬接種處理SOD在7 d出現(xiàn)了峰值，很有可能是模擬接種時(shí)植物摩擦受傷，從而誘導(dǎo)了內(nèi)源JA所調(diào)控的過程，進(jìn)而增加自身對(duì)機(jī)械損傷的抗性。

2.2.3 噴施MeJA后藜接種CMV葉中POD活性的變化情況。

POD不僅參與植物體內(nèi)木質(zhì)素的聚合過程，也是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性清除劑，故POD活性與植物抗病性有密切的關(guān)系[15]。湯會(huì)君等[16]研究表明，煙草接種病毒后抗病品種POD活性升高。由圖4可以看出，3個(gè)處理POD活性變化趨勢(shì)相似均呈現(xiàn)先下降后上升又下降的趨勢(shì)，所不同的是MeJA模擬接種處理組恢復(fù)上升最早，于第3天恢復(fù)到較高水平，并保持到第5天；MeJA接種處理組次之，于第5天恢復(fù)到最大值；蒸餾水處理組則在第7天?？梢酝茰y(cè)MeJA能促使植株產(chǎn)生對(duì)CMV的抗性。

2.3 PG對(duì)藜幾個(gè)生理指標(biāo)的影響

2.3.1 噴施PG后藜接種CMV葉中H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)及CAT活性的變化情況。

在逆境脅迫下，細(xì)胞內(nèi)易產(chǎn)生H2O2破壞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而CAT能把H2O2分解，從而清除H2O2維護(hù)膜的穩(wěn)定性，就抗逆性強(qiáng)的品種來說過氧化氫酶活性與抗逆性呈顯著性相關(guān)。由圖5、6可知，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化并沒有同其相應(yīng)CAT的變化呈一定的相關(guān)性，其可能的原因是影響CAT活性的因素有很多，PG與JA的作用時(shí)期也是其中之一，故PG與CAT這2種生理指標(biāo)不一定有直接聯(lián)系。在前期經(jīng)PG處理的H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)在緩慢下降，與圖2各處理前期的變化相反，很有可能是PG抑制了植物體內(nèi)MeJA所誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)的產(chǎn)生，從而降低了植物對(duì)病毒與受傷的防御反應(yīng)能力。

2.3.2 噴施PG后藜接種CMV葉中SOD活性的變化情況。

由圖7可以看出，經(jīng)PG處理的接種葉片SOD活性與PG處理的模擬接種葉片SOD活性變化趨勢(shì)恰恰相反，這很有可能是因?yàn)樵诮臃NCMV后，0～1 d時(shí)經(jīng)PG處理的植株被病毒侵染激發(fā)體內(nèi)防御機(jī)制，使能夠修復(fù)損害細(xì)胞的SOD活性增強(qiáng)，而PG模擬接種組并未實(shí)際接種CMV病毒，所以SOD活性未增加；在接種后1～3 d模擬組SOD活性開始增加，可能是因?yàn)橹澳Σ翆?duì)植物細(xì)胞造成了損傷，致使植物開始自動(dòng)修復(fù)。接種CMV的蒸餾水處理組SOD活性在200 U/g小幅度波動(dòng)，沒有明顯變化，可能是采樣葉片在接種病毒時(shí)摩擦得不夠，既未對(duì)植物葉片造成傷害，也未能將病毒成功接種于植物體內(nèi)，故在植株正常生長過程中，SOD活性無太大變化。

2.3.3 噴施PG后藜接種CMV葉中POD活性的變化情況。從圖8可以看出，3個(gè)處理組POD活性變化趨勢(shì)基本一致，均呈現(xiàn)出先下降后升高至峰值然后再降低的變化趨勢(shì)只是出現(xiàn)峰值的時(shí)間點(diǎn)不同。其中，PG處理后模擬接種的葉片POD酶活力始終低于初始酶活力，而經(jīng)PG處理和蒸餾水處理后接種CMV的葉片POD酶活力最大值高于初始酶活力，下降后的回升均出現(xiàn)在第7天。與圖4相比，經(jīng)PG處理的接種CMV葉片的POD活性回升較經(jīng)MeJA處理的接種CMV葉片推遲2 d，而經(jīng)PG處理的模擬接種葉片的POD活性則無回升趨勢(shì)，故推測(cè)PG可能抑制了MeJA所調(diào)控的POD活性上升過程。研究表明，接種病毒后抗病品種植物的POD會(huì)升高，而此處PG抑制了植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)[15]。

3 討論與結(jié)論

研究表明，MeJA不僅能有效調(diào)控植物的生長發(fā)育，且在植物脅迫防御中也有重要作用[17]，增強(qiáng)植物抵御不良環(huán)境的能力[18]。當(dāng)植株受到外界脅迫時(shí)，體內(nèi)的SOD活性會(huì)明顯增強(qiáng)，以提高其自身的抗氧化能力和抗病性[15]。禹艷紅等[19]研究表明，MeJA能提高巴西煙草對(duì)CMV的抗性，且指出SOD活性與抗病毒有較密切的關(guān)系。該試驗(yàn)中，經(jīng)MeJA處理的藜接種葉SOD活性比空白對(duì)照組高，而PG處理的藜接種葉SOD活性在0～1 d升高，1～3 d降低，但總體低于MeJA處理組，表明MeJA能有效提高植株藜體內(nèi)的SOD活性。

POD不僅是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一，而且還參與氧自由基的消除反應(yīng)和乙烯生物合成，同植物的抗病性密切相關(guān)[20]。該試驗(yàn)中，MeJA處理的接種藜葉POD活性前期降低直到低于對(duì)照，中后期逐漸升高，且高于對(duì)照，這與師金鴿等[21]的試驗(yàn)結(jié)果相同。

H2O2作為植物對(duì)外界環(huán)境脅迫反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，除了能直接殺死病原物外，還可選擇性誘導(dǎo)許多相關(guān)基因的表達(dá)，以提高其自身免疫能力。該研究表明，經(jīng)MeJA處理的藜接種葉在接種后0～3 d其CAT活性先升高后降低，而相對(duì)應(yīng)的H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之升高，這同師金鴿等[17]的試驗(yàn)結(jié)果相符。經(jīng)PG處理的接種藜葉0～3 d先升高后降低，其相對(duì)應(yīng)H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)則一直在降低。何強(qiáng)等[8]研究表明，PG作為MeJA的抑制劑，能與蛋白質(zhì)結(jié)合抑制某些氧化酶的活性，所以PG可能是抑制了植物體內(nèi)MeJA的形成，導(dǎo)致H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，從而抑制植株的抗病性。

綜上所述，藜接種CMV后MeJA能提高相關(guān)氧化酶的活性，其抑制劑PG處理后對(duì)MeJA所調(diào)控的氧化酶活性變化過程則有一定的抑制作用，故MeJA對(duì)藜抗CMV有一定的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

[1] KUC' J.Concepts and directions of induced systemic resistance in plants and its application[J].Eur J Plant Pathol，2001，107（1）：7-12.

[2] KlOEPPER J W，WUNZUN S.Proposed definition related to induced disease resistance[J].Biocontrol Sci Technology，1992，2：349-351.

[3]何偉，李紅玉，段建功，等.植物對(duì)蟲害的系統(tǒng)獲得性抗性及抗蟲與抗病信號(hào)途徑間的相互作用[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2005，32（4）：425-430.

[4] TURNER J G，ELLIS C，DEVOTO A.The jasmonate signal pathway[J].The plant cell，2002，14（14）：153-164.

[5] CHEONG J J，CHOI Y D.Methyl jasmonate as a vital substance in plants[J].Trends in genetics，2003，19（7）：409-413.

[6] SHI Y X，YU Y，F(xiàn)U J F，et al.Reationship beteween LOX activity and JA accumulations in cucumber leaves induced by pathogen[J].Acta phytophylacica sinica，2008，35（6）：486-490.

[7] FENG Y J，WANG J W，SU Y J，et al.The role of Jasmonic acid in the systemic induced defense response of aboveround and underground in corn（Zea mays）[J].Scientia agricultura sinica，2009，42（8）：2726-2735.

[8] 何強(qiáng)，姚開，石碧.棓酸酯類化合物的合成及其應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè)，2000，30（1）：29-35.

[9] 蔡昆爭(zhēng)，董桃杏，徐濤.茉莉酸類物質(zhì)（JAs）的生理特性及其在逆境脅迫中的抗性作用[J].生態(tài)環(huán)境，2006，15（2）：397-404.

[10] BALDWIN I T，SCHMELZ E A.Immunological “memory” in the induced accumulation of nicotine in wild tobacco[J].Ecology，1996，77（1）：236-246.

[11] VELIKOVA V，YORDANOV I，EDREVA A.Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants：Protective role of exogenous polyamines[J].Plant science，2000，151（1）：59-66.

[12] BEERS R F Jr，SIZER I W.A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase[J].Biol Chem，1952，195（1）：133-140.

[13] PATRA H K，KAR M，MISHRA D.Catalase activity in leaves and cotyledons during plant development and senescence[J].Biochem Physiol Pflanzen，1978，172：385-390.

[14] 陳鴻鵬，譚曉風(fēng).超氧化物歧化酶（SOD）研究綜述[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2007，25（1）：59-65.

[15] 師金鴿，李占杰，楊鐵釗.水楊酸對(duì)煙草抗黃瓜花葉病毒的誘導(dǎo)效應(yīng)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（6）：108-111.

[16] 湯會(huì)君，張俊華，魏向峰.不同抗性煙草品種感染Pseudomonas syringae pv.tabaci病菌后幾種酶活性測(cè)定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（4）：30-34.

[17] SWIATEK A，VAN DONGEN W，ESMANS E L，et al.Metabolic fate of jasmonates in tobacco bright yellow2 cells[J].Plant Physiol，2004，135（1）：161-172.

[18] 吳國昭，曾任森.外源水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯處理對(duì)挺立型普通野生稻保護(hù)酶活性的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（3）：82-84.

[19] 禹艷紅，徐曲毅，賓金華.茉莉酸甲酯對(duì)煙草愈傷組織一些活性氧生成和相關(guān)酶活性的影響[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2005，13（3）：239-245.

[20] 余叔文.植物生理與分子生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，1992：417-430.

[21] 師金鴿，殷全玉，楊鐵釗，等.茉莉酸甲酯對(duì)煙草花葉病毒的誘導(dǎo)效應(yīng)[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（5）：55-60.