西藏山羊DQA2基因多態(tài)性與血液免疫性狀的相關(guān)性分析

呂雪峰 李亞東 何茜

摘要 [目的]了解西藏山羊DQA2基因與血液免疫性狀的關(guān)系。[方法]利用PCR-RFLP對西藏山羊DQA2基因外顯子2多態(tài)性及其血液免疫指標(biāo)效應(yīng)進(jìn)行了分析。[結(jié)果]在西藏山羊中共檢測到4種基因型，由3個等位基因控制。其中，BB基因型淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于AB型和BC型（P<0.05），BB型中間細(xì)胞數(shù)目高于AB型和BC型，BB型平均血紅蛋白含量低于AB型和BC型，但均差異不顯著。[結(jié)論]西藏山羊BB基因型是影響血液淋巴細(xì)胞總數(shù)的重要因素，與血液免疫指標(biāo)有一定的相關(guān)性，可作為抗病育種的遺傳標(biāo)記，也為后期的輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 西藏山羊；MHC-DQA2；血液免疫；多態(tài)性

中圖分類號 S827 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0107-03

Abstract [Objective] To understand the relationship between DQA2 gene and blood immune traits in Tibet goat.[Method]The polymorphism of exon 2 of DQA2 gene of Tibetan goat and the effects on blood immune traits were studied by PCRRFLP.[Result]Four genotypes were detected in Tibetan goat，which were controlled by three alleles.Lymphocyte count（WSCC）with genotype BB was significantly higher than that with genotype AB and BC （P<0.05）.Intermediate cell count （MID） with genotype BB was higher than that with genotype AB and BC.Mean corpuscular hemoglobin（MCH） with genotype BB was lower than that with genotype AB and BC，but there was no significant difference.[Conclusion]Genotype BB was an important factor affecting WSCC.There was correlation between genotypes and blood immune traits，so it could be used as a genetic marker for disease resistance breeding，and it also provided scientific basis for the latter selective breeding.

Key words Tibetan goats；MHCDQA2；Blood immune；Polymorphism

西藏山羊是我國非常重要的畜禽資源，也是國家重點保護(hù)的品種之一，主要產(chǎn)地在西藏、四川、甘肅部分地區(qū)[1]。西藏山羊所產(chǎn)的羊絨平均細(xì)度14 μm，長度40～50 mm，屬于羊絨中的精品。該品種具有耐粗飼、耐高寒、抗缺氧、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好等特點[2]。

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompability complex，MHC）是由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座組成的復(fù)合體，由 Ⅰ 類、Ⅱ 類和 Ⅲ 類基因組成，存在豐富的多態(tài)性。其中，Ⅱ 類基因的多態(tài)性在動物免疫中發(fā)揮最主要的作用，Ⅱ 類基因包含DQ、DR、DO等亞區(qū)，其產(chǎn)物參與抗原遞呈和 T 細(xì)胞激活，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，是開展抗病育種的首選標(biāo)記基因。山羊的MHC也稱為山羊白細(xì)胞抗原（Goat lymphocyte antigen，GOLA）。對山羊GOLA基因遺傳多態(tài)性的研究，主要集中在 DR 亞區(qū)的 DRB 基因[3-5]和DQ亞區(qū)的DQA1基因[6-8]，有關(guān)山羊DQA2基因的研究報道較少。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) DQA2 基因在藏綿羊中具有豐富的遺傳多態(tài)性[9-10]。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)山羊的 DQA2基因也具有豐富的多態(tài)性。邢鳳[12]發(fā)現(xiàn)山羊 DQA2 與線蟲抗性有一定的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn) DQB1 基因與血液免疫指標(biāo)也有一定的相關(guān)性[13]。李俊營等[7]應(yīng)用 PCR-RFLP技術(shù)檢測了山羊 DQA2 基因遺傳多態(tài)性，在 HaeⅢ 酶切位點上檢測到由3個等位基因控制的5種基因型。

西藏山羊長期生活在高海拔地區(qū)，具有優(yōu)良的抗逆性，因此了解西藏山羊DQA2的遺傳多樣性和免疫系統(tǒng)的關(guān)系是研究其抗病性能、開展抗病育種的基礎(chǔ)。筆者利用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）對西藏山羊DQA2基因外顯子2進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，并結(jié)合DQA2基因與血液免疫性狀的相關(guān)性進(jìn)行了研究，探討DQA2 基因與西藏山羊血液免疫性狀的相關(guān)性，旨在篩選出具有顯著效應(yīng)的分子遺傳標(biāo)記，為西藏山羊輔助性選擇、抗病育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 西藏山羊（白絨型）99只和西藏山羊（紫絨型）56只，分別采自西藏阿里地區(qū)日土縣和措勤縣，頸靜脈采血，EDTA抗凝，冷藏保存。

1.2 引物合成與PCR擴(kuò)增

1.2.1 引物設(shè)計與合成。DQA2引物序列為：5′-CTTCCTGCTCCTCACCCTCAC-3′和5′-AAAGAGAAGTAGAATGGTGGACACTT -3′[13]，擴(kuò)增片段長度約304 bp，引物由上海生工股份有限公司合成。

1.2.2 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：基因組DNA 1 μL（約100 ng）、10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、Taq酶 0.5 μL、ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序如下： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 32個循環(huán)； 72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 RFLP 檢測與測序 采用限制性核酸內(nèi)切酶HaeⅢ對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為 20 μL，包括 PCR 產(chǎn)物 10 μL、限制性內(nèi)切酶 HaeⅢ 0.5 μL、10 × NE buffer 2 μL、ddH2O 7.5 μL ，37 ℃恒溫條件下酶切 15 min，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)酶切結(jié)果，將純合基因型個體PCR產(chǎn)物送交上海生工股份有限公司測序。

1.4 血液免疫指標(biāo)測定 使用全自動動物血細(xì)胞分析儀（型號XF6030），測定西藏山羊的血液免疫指標(biāo)，包括白細(xì)胞數(shù)目（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)目（W-SCC）、中間細(xì)胞數(shù)目（MID）、中性粒細(xì)胞數(shù)目（W-LCC）、血紅蛋白濃度（HGB）、 紅細(xì)胞數(shù)目（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV）和紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）。

1.5 數(shù)據(jù)處理 血液免疫指標(biāo)數(shù)據(jù)使用Excel軟件計算，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；等位基因頻率、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）均采用PopGene 1.32（FrancisC.Yeh，Ph.D）軟件進(jìn)行計算；多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）使用PIC_Calc 0.6軟件進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 對西藏地區(qū)白絨型、紫絨型山羊DQA2基因外顯子2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約304 bp的特異性條帶，經(jīng)過測序分析可知，該PCR片段與預(yù)期的目的片段相一致。

2.2 PCR-RFLP檢測 對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 HaeⅢ 酶切后出現(xiàn)4種結(jié)果（圖1），4種基因型分別命名為AB、BB、BC、AC，由3個等位基因控制。酶切結(jié)果表明，西藏山羊白絨型和紫絨型DQA2基因第2外顯子存在3個多態(tài)性酶切位點。

從圖2可以看出，該段的DNA序列存在1個HaeⅢ多態(tài)性位點，位于82 bp處。這說明基因型BB的測序結(jié)果與酶切結(jié)果相一致。

2.3 DQA2基因外顯子2的多態(tài)性分析 由表1可知，在西藏山羊中共檢測到4種基因型，這4種基因型在西藏山羊白絨型和紫絨型群體中的分布基本均衡。無論白絨型還是紫絨

型，AB基因型頻率最高，BB基因型頻率次之，BC和AC基因型頻率較低；在白絨型山羊中只檢測到BC基因型，在紫絨型山羊中只檢測到AC基因型。在 2個山羊品系中，等位基因 B為優(yōu)勢等位基因。

從表2可以看出，西藏山羊白絨型和紫絨型的觀察雜合度（Ho）分別為0.656 6和0.535 7， 期望雜合度（He）分別為0.455 8和0.421 5，2個群體的觀察雜合度都高于期望雜合度；2個群體的多態(tài)信息含量分布為0.367 4和0.344 2，較為接近。

2.4 DQA2基因多態(tài)性與免疫性狀的相關(guān)性 從表3可以看出，紫絨型西藏山羊白細(xì)胞數(shù)目（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)目（W-SCC）、中間細(xì)胞數(shù)目（MID）都顯著高于白絨型西藏山羊（P<0.05）。DQA2基因不同基因型與免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析表明，在西藏白絨型山羊中，BB基因型淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于AB型和BC型（P<0.05），BB基因型中間細(xì)胞數(shù)目高于AB型和BC型，

BB基因型平均血紅蛋白含量低于AB型和BC型，但差異均不顯著；在紫絨型西藏山羊中，BB基因型淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于AB型和BC型（P<0.05）。

3 討論

西藏山羊是藏族牧民長期飼養(yǎng)和選擇而形成的多用型（絨、毛、肉、奶、皮）普通品種，也是高原、高寒地區(qū)的一個古老地方品種，根據(jù)毛色分為白絨型和紫絨型。西藏山羊具有耐粗飼、耐高寒、抗缺氧、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好等特點，深受藏族牧民的喜愛。

在抗病育種領(lǐng)域，MHC由于自身的特點，常被育種學(xué)家作為首選標(biāo)記基因，其基因序列發(fā)生變異可能影響宿主對病原體的免疫應(yīng)答，也可能導(dǎo)致物種間抗病性和疾病易感性發(fā)生變異，如 MHC 與山羊流產(chǎn)[14]、綿羊布魯氏菌病[15]、包蟲病[16]的易感性相關(guān)。該研究對西藏山羊DQA2 基因外顯子2進(jìn)行了RFLP 檢測，在限制酶HaeⅢ酶切位點上共檢測到4種基因型，與萊蕪黑山羊、波爾山羊和魯波山羊DQA2的檢測結(jié)果相似。其中，BC基因型僅在西藏白絨型山羊中檢測到，僅檢測到4個個體；AC基因型僅在西藏紫絨型山羊中檢測到，只檢測到2個個體，其原因一方面可能與樣本數(shù)量有關(guān)，另一方面也是因為BC、AC這2個基因型在西藏山羊2個品系中分布較少，這可能是自然或人工選擇的結(jié)果。西藏山羊在育種歷史過程中，未經(jīng)過引入雜交，其血統(tǒng)較為原始純正，受選擇的機(jī)率很大。

遺傳多樣性是物種生存適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)，也是物種進(jìn)化的前提。物種遺傳多樣性越高，遺傳變異性越豐富，物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力也就越強(qiáng)?？捎闷谕s合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）值的高低來反映群體內(nèi)遺傳變異的大小。西藏山羊白絨型和紫絨型的觀察雜合度（Ho）分別為0.656 6和0.535 7，期望雜合度（He）分別為0.455 8和0.421 5，西藏山羊2個群體的觀察雜合度均高于期望雜合度，說明西藏山羊2個群體中雜合子含量較多，遺傳多樣性比較豐富。根據(jù)Botstein 等[17]提出的多態(tài)信息含量（PIC），PIC>0.5 為高度多態(tài)，0.25< PIC<0.5 為中度多態(tài)， PIC<0.25 為低度多態(tài)。西藏山羊的多態(tài)信息含量為0.367 4和0.344 2，可判斷為中度多態(tài)，從多態(tài)信息含量來看可認(rèn)為西藏山羊具有較豐富的遺傳多樣性。

血液免疫指標(biāo)對動物機(jī)體生理狀況和代謝水平具有客觀的指示作用。雖然血液免疫指標(biāo)受到不同因素的影響，如年齡、性別、生理狀態(tài)、營養(yǎng)水平等，但因其具有相對的穩(wěn)定性，所以這些指標(biāo)的相應(yīng)變化可以反映動物機(jī)體的生理與病理的變化。在動物機(jī)體防御機(jī)制中，白細(xì)胞是重要的組成部分，淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的一種，按其發(fā)生和功能的差異分為T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，是種羊的免疫活性細(xì)胞，針對某一抗原起特異性反應(yīng)；中性粒細(xì)胞作為機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，具有很強(qiáng)的吞噬能力，能將大部分病原體吞噬消化。無論是白絨型西藏山羊還是紫絨型西藏山羊，BB基因型的淋巴細(xì)胞數(shù)目均顯著高于AB、AC和BC 3種基因型，表明西藏山羊DQA2基因外顯子2與淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著相關(guān)；另外，BB基因型的中性粒細(xì)胞數(shù)目和中間細(xì)胞數(shù)目也高于AB、AC和BC基因型，但未達(dá)到顯著水平。這說明BB基因型是影響西藏山羊血液免疫指標(biāo)的因素。同時，紫絨型西藏山羊的白細(xì)胞數(shù)目、中間細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目與中性粒細(xì)胞數(shù)目均高于白絨型西藏山羊，說明紫絨型西藏山羊在血液免疫方面強(qiáng)于白絨型山羊，同時也反映了該品種的特異性。

該研究發(fā)現(xiàn)西藏山羊DQA2基因與血液免疫性狀存在一定的相關(guān)性，但受限于樣本數(shù)量，使得BC、AC基因型的樣本數(shù)量過少，在后期的研究中應(yīng)加大樣本數(shù)量，發(fā)現(xiàn)更多的與免疫性狀有關(guān)的DNA分子標(biāo)記，為絨山羊抗病育種提供更可靠的參考價值。

4 結(jié)論

在西藏山羊中共檢測到4種基因型，基因型頻率由高到低依次為AB、BB、BC 和AC，白絨型山羊中只檢測到BC基因型，紫絨型山羊中只檢測到AC基因型。在2個品系中，等位基因B為優(yōu)勢等位基因。白絨型山羊和紫絨型山羊2個品系的多態(tài)信息含量分別為0.367 4和0.344 2，屬于中度多態(tài)性。BB基因型淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著高于AB型和BC型，可認(rèn)為是影響西藏山羊血液免疫指標(biāo)的主要因素。紫絨型西藏山羊的白細(xì)胞數(shù)目、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中間細(xì)胞數(shù)目都顯著高于白絨型西藏山羊。

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