大麻CBDA1基因的生物信息學(xué)分析

常麗　唐慧娟　李建軍　黃思齊　陳安國(guó)　趙立寧　李德芳

摘要 [目的]研究大麻二酚酸合成酶基因（CBDA1）編碼的蛋白質(zhì)序列所包含的生物學(xué)信息。[方法] 利用生物信息學(xué)在線工具及軟件分析大麻二酚酸合成酶（CBDAS）的理化性質(zhì)、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、motif結(jié)構(gòu)域及空間結(jié)構(gòu)等。[結(jié)果] CBDAS由544個(gè)氨基酸組成，分子量為62 168.42，理論等電點(diǎn)為8.81，是一種穩(wěn)定的親水性分泌蛋白，N末端包含1個(gè)由28個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，該蛋白的亞細(xì)胞定位在胞外。CBDAS屬于氧化還原酶家族，F(xiàn)DA是該酶活性的必需輔因子，CBDAS蛋白中只含有1個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域，含有23個(gè)磷酸化位點(diǎn)和6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)與四氫大麻酚酸合成酶（THCAS）同源性最高。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為今后深入研究CBDAS蛋白的結(jié)構(gòu)特征和功能提供理論參考。

關(guān)鍵詞 大麻；大麻二酚酸合成酶；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) S563.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0144-05

Bioinformatic Analysis of CBDA1 Gene in Cannabis sativa

CHANG Li， TANG Huijuan， LI Jianjun， ZHAO Lining*， LI Defang* et al

（Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha，Hunan 410205）

Abstract [Objective]To study the biological information contained in the protein sequence encoded by cannabidiolic acid synthase gene （CBDA1）. [Method]The physicochemical properties， hydrophilicity and hydrophobicity， transmembrane structure domain， the signal peptide， the motif and the spatial structure of cannabidiolic acid synthase （CBDAS） were analyzed by bioinformatic sever and online tools. [Result]CBDAS consisted of 544 amino acids with molecular weight of 62 168.42 and a theoretical isoelectric point of 8.81. It was a stable hydrophilic secretory protein and the Nterminal contained a signal peptide of 28 amino acid residues， moreover， the subcellular localization of CBDAS was extracellular. It was presumed that CBDAS belonged to the family of oxidoreductases and FDA was a necessary cofactor for the activity of CBDAS. In addtion， CBDAS contained one low complexity region， twenty three phosphorylation sites and six Nglycosylation sites. The secondary structure mainly included αhelix， βturn and random coil. Furthermore， the tertiary structure was the most homologous to tetrahydrocannabinol synthase （THCAS）. [Conclution]The results could provide a theoretical reference for further study of the structure and functions of CBDAS.

Key words Cannabis sativa；CBDAS；Bioinformatics

基金項(xiàng)目 國(guó)家麻類產(chǎn)業(yè)體系分子育種項(xiàng)目（CARS-19-E04）。

作者簡(jiǎn)介 常麗（1984—），女，河南焦作人，助理研究員，博士，從事麻類生物技術(shù)研究。*通訊作者：趙立寧，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事麻類生物技術(shù)研究；李德芳，研究員，博士生導(dǎo)師，從事一年生麻類遺傳改良研究。

收稿日期 2017-07-31

大麻（Cannabis sativa）是一年生草本植物，起源于我國(guó)，在南北朝時(shí)期人們就開始種植和使用大麻，大麻是我國(guó)傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物，主要用于紡織、建材、造紙、藥用、食用、飼料、工業(yè)原料等方面[1]。大麻植株中含有多種活性物質(zhì)，主要分為兩大類，即大麻酚類化合物和非大麻酚類化合物。目前，研究最多的是大麻酚類化合物，主要包括四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）、大麻酚（cannabinol，CBN）、大麻二酚（cannabidiol，CBD）、大麻萜酚（cannabigerol，CBG）、大麻環(huán)萜酚（cannabichromene，CBC）等。THC是由以色列Weizmann科學(xué)研究所的Yechiel Gaoni和Raphael Mechoulam于1963年首次分離得到[2]，并于次年確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。THC是大麻中最重要的活性物質(zhì)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，可用于治療癌癥引起的嘔吐[3]，但THC具有致幻作用，因此大麻在多國(guó)被禁止種植。四氫大麻酚酸合成酶（Tetrahydrocannabinolic acid synthase，THCAS）是THC合成途徑中的關(guān)鍵酶，最早在1995年由Taura等[4]從大麻幼葉中分離出，并于2004年成功克隆了該酶的基因[5]，隨后在2012年研究了該酶的結(jié)構(gòu)和功能[6]。與THC不同的是，CBD是大麻中的非成癮性成分，能阻礙THC對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)影響，并具有治療癲癇、抗痙攣、抗炎、抗焦慮等藥理活性[7-10]。因此，高CBD含量的藥用大麻成為當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)。而大麻二酚酸合成酶（Cannabidiolic acid synthase，CBDAS）是CBD合成途徑中的關(guān)鍵酶，最早在1996年由Taura等[11]從墨西哥纖維大麻中分離得到，并于2007年通過逆轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA[12]。但是CBDAS的結(jié)構(gòu)和功能至今還未報(bào)道，該研究以CBDA合成酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用生物信息學(xué)方法對(duì)CBDA合成酶基因編碼蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、修飾位點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以期為今后深入研究和利用CBDA合成酶提供重要的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)，同時(shí)為大麻作物遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以大麻品種Carmen的大麻二酚酸合成酶基因 （CBDA1）（LOCUS KJ469374）為研究對(duì)象，對(duì)其完整的CDS序列編碼的氨基酸序列、蛋白質(zhì)理化性及功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。

1.2 方法

利用ExPASy軟件中的Protparam程序?qū)BDAS蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度、分子量大小及等電點(diǎn)等進(jìn)行分析；利用ProtScale工具分析CBDAS蛋白的親疏水性；利用TMHMM Server v.2.0 和Signal IP 4.1工具分析CBDAS蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽；利用ProtComp v.9.0工具對(duì)CBDAS蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn) 行分析；利用PROSITE模體數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CBDAS蛋白進(jìn)行motif預(yù)測(cè)；利用SMART工具分析CBDAS蛋白的保守功能域；利用NetPhos 2.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server分析其蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)；利用GOR（GarnierOsguthorpeRobson Method）對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行性分析；利用SWISSMODEL服務(wù)器同源模擬構(gòu)建CBDAS的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBDA1基因編碼蛋白的氨基酸組成

氨基酸的種類、排列順序及數(shù)量直接影響蛋白質(zhì)的功能。CBDA1基因的CDS序列編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列為：

CBDAS由544個(gè)氨基酸組成，分子式為C2834H4343N743O792S21， 分子量為62 168.42，理論等電點(diǎn)為8.81。CBDAS包含20種常見氨基酸（表1），其中疏水性氨基酸占48.8%，親水性氨基酸占51.2%，堿性氨基酸占13.6%，酸性氨基酸占94%，且含有21個(gè)含硫氨基酸，說明該蛋白中存在二硫鍵。由于CBDAS序列的N末端是Met，該蛋白估計(jì)半衰期為30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外）、 > 20 h（酵母，體內(nèi)）、> 10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）。CBDAS的不穩(wěn)定指數(shù) Ⅱ 為30.57，屬于穩(wěn)定蛋白[13]。脂肪族氨基酸指數(shù)為88.31。

2.2 CBDA1基因編碼蛋白的親/疏水性分析

疏水作用能驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)的肽鏈壓縮成球狀結(jié)構(gòu)，對(duì)于維持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象十分重要。氨基酸發(fā)生變化可導(dǎo)致蛋白質(zhì)親/疏水性的改變，而親/疏水性的變化直接影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及功能。此外，通過了解肽鏈中不同肽段的疏水性，可以對(duì)跨膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，為蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及功能結(jié)構(gòu)域的分選提供重要的參考依據(jù)。因此，分析蛋白質(zhì)的親/疏水性具有十分重要的意義。通過ProtScale在線工具對(duì)CBDAS進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果見圖1，在第15位氨基酸出現(xiàn)最高值2.566，即疏水性最強(qiáng)，在第453位氨基酸出現(xiàn)最低值-3.556，即親水性最強(qiáng)。整體看CBDAS的疏水性和親水性氨基酸分布均衡，但預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CBDAS的親水性指數(shù)平均值（GRAVY，表示蛋白質(zhì)的溶解度）為-0.202，所以CBDAS更偏向是一個(gè)親水蛋白[14]。由圖1可知，在前29個(gè)氨基酸位置出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的疏水區(qū)域（score>1.5），且疏水區(qū)域較寬，在這個(gè)位置有可能出現(xiàn)一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。

2.3 CBDA1編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析

跨膜結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)通過與膜內(nèi)在蛋白的靜電相互作用和氫鍵鍵合作用與膜結(jié)合的一段氨基酸片段，一般由20個(gè)左右的疏水氨基酸殘基組成，主要形成α-螺旋?？缒そY(jié)構(gòu)域是膜中蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位，固著于細(xì)胞膜上起“錨定”作用[15]。跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析對(duì)于了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及在細(xì)胞中的作用部位具有重要意義。在目前的基因組數(shù)據(jù)中，有20%～30%的基因產(chǎn)物被預(yù)測(cè)為膜蛋白，它們?cè)谏矬w中擔(dān)負(fù)著多種功能。因此，有效、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)跨膜區(qū)和跨膜的方向?qū)χ笇?dǎo)跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究具有重要意義。利用跨膜預(yù)測(cè)服務(wù)器TMHMM Server v.2.0對(duì)CBDAS進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2，該蛋白存在一個(gè)潛在的跨膜區(qū)（第1～28位氨基酸），其中第1～4位氨基酸位于膜內(nèi)，第5～27位氨基酸為跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)，第28位以后的肽鏈主要在細(xì)胞膜外發(fā)揮其生物學(xué)功能。由于該跨膜結(jié)構(gòu)位于蛋白質(zhì)的N端，推測(cè)其極可能為一個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)序列的其他位置不存在跨膜結(jié)構(gòu)，因此，該蛋白屬于跨膜蛋白。

2.4 CBDA1基因編碼蛋白的信號(hào)肽分析

信號(hào)肽是蛋白質(zhì)的一個(gè)片段，一般由5～30個(gè)氨基酸殘基組成[16]，并大致分為 3個(gè)區(qū)段：N端為帶正電荷的氨基酸；中間為由20個(gè)或更多的以中性氨基酸為主組成的疏水核心區(qū)，能夠形成一段α-螺旋；C端含有小分子氨基酸，是被信號(hào)肽酶裂解的部位，亦稱加工區(qū)。信號(hào)肽在蛋白分泌的過程中起重要作用[17]，主要負(fù)責(zé)引導(dǎo)新合成蛋白質(zhì)的跨膜、轉(zhuǎn)移和定位，把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞不同的亞細(xì)胞器內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)功能。通過Signal IP 4.1工具進(jìn)行分析[18]，結(jié)果表明（圖3），CBDAS的N末端包含1個(gè)由28個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，切割位點(diǎn)在第28和29個(gè)氨基酸殘基之間，其平均值S為0801，當(dāng)平均值S>0.500時(shí)，可判斷該蛋白為分泌蛋白，說明CBDAS是一種分泌蛋白。

2.5 CBDA1基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成后經(jīng)蛋白質(zhì)分選信號(hào)引導(dǎo)被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器中，部

分蛋白質(zhì)則被分泌到細(xì)胞外或留在細(xì)胞質(zhì)中，只有轉(zhuǎn)運(yùn)到正

確的部位才能參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)[19]，如果定位發(fā)生

偏差，將會(huì)對(duì)細(xì)胞功能甚至生命產(chǎn)生重大影響。了解蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息，可以為推斷蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能提供必要的幫助，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的其他研究如相互作用、進(jìn)化等也能提供必要的信息。利用ProtComp v.9.0對(duì)CBDAS進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)位置的積分預(yù)測(cè)為細(xì)胞外（分泌），得分9.4，說明該蛋白主要在細(xì)胞外發(fā)揮其生物學(xué)功能。

2.6 CBDA1基因編碼蛋白motif分析

PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)收集了生物學(xué)有顯著意義的蛋白質(zhì)位點(diǎn)和序列模式，并能根據(jù)這些位點(diǎn)和模式快速、可靠地鑒別一個(gè)未知功能的蛋白質(zhì)序列應(yīng)該屬于哪一個(gè)蛋白質(zhì)家族。利用PROSITE對(duì)CBDA1編碼蛋白進(jìn)行motif預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4所示，CBDAS含有1個(gè)FAD-PCMH結(jié)合域，位于第77～251位氨基酸（ TTPKPLVIVTPSHVSHIQGTILCSKKVGLQIRTRSGGHDSEGmsYISQVPFVIVDLRNMRSIKIDVHSQTAWVEAGATLGEVYYWvnEK NESLSLAAGYCPTVCAGGHFGGGGYGPLMRSYGLAADNIIDA HLVNVHGKVLDRKSMGEDLFWALRGGGAESFGIIVAWKI RLVAV ）。CMH型FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由2個(gè)α-β亞結(jié)構(gòu)域組成：1個(gè)由α螺旋包圍的3個(gè)平行的β鏈（B1～B3）組成，并被包含在含有5個(gè)反平行β鏈的第2子結(jié)構(gòu)域（B4～B8）[20]。2個(gè)子域可以適應(yīng)它們之間的FAD輔因子[21]。在PCMH蛋白中，輔酶FAD也共價(jià)連接到位于C末端催化結(jié)構(gòu)域FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外的酪氨酸[22]。除CBDAS外，目前發(fā)現(xiàn)大麻的四氫大麻酚酸合成酶（THCAS）、細(xì)菌UDP-N-乙炔烯醇丙酮酰葡萄糖還原酶（UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine reductase，EC 1.1.1.158）、脊椎動(dòng)物烷基二羥基丙二酸合酶（alkyldihydroxyacetonephosphate synthase，EC 2.5.1.26）、真核乳酸脫氫酶D（D lactate dehydrogenase，EC 1.1.2.4）和細(xì)菌一氧化碳脫氫酶（Carbon monoxide dehydrogenase，EC 1.2.99.2）的結(jié)構(gòu)中也含有PCMH型FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域。推測(cè)CBDAS同THCAS一樣屬于氧化還原酶家族，F(xiàn)DA是CBDAS酶活性的必需輔因子。

2.7 CBDA1基因編碼蛋白的保守功能域分析

保守結(jié)構(gòu)域指生物進(jìn)化或1個(gè)蛋白家族中不變或相同的結(jié)構(gòu)域，具有重要功能。采用SMART工具推測(cè)，CBDAS蛋白中只含有1個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域（low complexity region，LCR）： GGHFGGGGYG ，位于第182～191位氨基酸。

2.8 CBDAS蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)分析

真核生物中的多肽及蛋白質(zhì)分子經(jīng)核糖體合成后大多需翻譯后修飾，才能確保蛋白質(zhì)發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能[23]。常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾有磷酸化和糖基化2種。磷酸化是由蛋白質(zhì)激酶催化將ATP或GTP γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（Ser、Thr、Tyr）上，是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式[24]，蛋白質(zhì)磷酸化修飾的作用主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方面：一是通過磷酸化修飾改變了受體蛋白質(zhì)的活性，蛋白質(zhì)磷酸化或去磷酸化修飾起到開啟或關(guān)閉蛋白質(zhì)活性的作用；二是磷酸化蛋白質(zhì)參與植物體內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)；三是影響蛋白質(zhì)間的互作，由于在氨基酸殘基上結(jié)合或失去了磷酸基團(tuán)，從而改變了受體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響了該受體蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)間的互作。細(xì)胞中蛋白質(zhì)磷酸化水平是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，其細(xì)微差異都可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝水平上的變化。因此，蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響是全方位的。糖基化通常修飾天冬酰胺的N端，其氨基酸特征序列為Asn-X-Ser-Thr（X是除Pro外的任一種類氨基酸）[25]。N-糖基化與植物蛋白質(zhì)正確折疊、細(xì)胞凋亡、器官發(fā)育及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能密切相關(guān)[26]。通常胞外分泌蛋白、膜整合蛋白及構(gòu)成內(nèi)膜系統(tǒng)的可溶性駐留蛋白大多需要經(jīng)過N-糖基化修飾。利用NetPhos 2.0和NetNGlyc 1.0對(duì)CBDAS進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白存在23個(gè)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（表2、3）。

2.9 CBDA1基因編碼蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

目前最好的單序列預(yù)測(cè)程序能夠達(dá)70%左右，比如基于information theory的GOR準(zhǔn)確度達(dá)69.7%[27]，利用GOR IV對(duì)CBDAS的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5顯示，CBDAS蛋白由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲組成，分別占整個(gè)肽鏈的21.88%、26.29%和51.84%。

利用SWISSMODEL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模工具構(gòu)建的CBDAS的三維結(jié)構(gòu)模型，如圖5所示。建模過程中共有168條模板和目標(biāo)序列相匹配，通過啟發(fā)式分析過濾得到29個(gè)模板，主要有Tetrahydrocannabinolic acid synthase（四氫大麻酚酸合成酶）、Pollen allergen Phl p（花粉過敏原Phl p）、berberine bridgeforming enzyme（小檗堿橋形成酶）、Reticuline oxidase（纖維素氧化酶）、alkyl dihydroxyacetone phosphate synthase，peroxisomal（烷基二羥基乙酸磷酸酯合成酶，過氧化物酶）。CBDAS的三級(jí)結(jié)構(gòu)也是參考這29個(gè)模板模擬構(gòu)建的，其中與THCAS[28]的同源性最高，為83.95%。

3 討論與結(jié)論

利用生物信息學(xué)對(duì)目的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)是當(dāng)前國(guó)際上研究的熱點(diǎn)之一，也是發(fā)現(xiàn)和研究新基因的一個(gè)重要手段。生物信息學(xué)與傳統(tǒng)的通過RT-PCR方法進(jìn)行克隆分析基因的方法相比，具有快捷、針對(duì)性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)。生物信息學(xué)能針對(duì)未知功能基因，采集數(shù)據(jù)，歸納分析，預(yù)測(cè)基因功能，挖掘基因潛在的研究線索，可為科學(xué)研究提供啟示和方向指導(dǎo)。對(duì)于蛋白質(zhì)而言，其生物學(xué)功能才是最終的研究目的。通過多種生物信息學(xué)工具分析CBDA1基因編碼的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)該基因編碼544個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.81，N端包含1個(gè)信號(hào)肽，而含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)一般都是分泌到細(xì)胞外。CBDAS的亞細(xì)胞定位結(jié)果也證實(shí)了該蛋白是一種穩(wěn)定的分泌蛋白，主要在胞外發(fā)揮其生物學(xué)功能。THCAS的二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富，包含了α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲，含有許多蛋白質(zhì)修飾及活化位點(diǎn)，如磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、FDA結(jié)合位點(diǎn)等，暗示該蛋白可能在體內(nèi)受多種因子的調(diào)控，具有接受細(xì)胞信號(hào)并做出反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能的潛能。這些結(jié)果對(duì)正確認(rèn)識(shí)和理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位、功能等均有重要的指導(dǎo)意義。

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